CN107058520A - 分子标志物foxm1基因的应用 - Google Patents

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Abstract

分子标志物FOXM1基因的应用，属于分子诊断领域，涉及一种用于多发性骨髓瘤诊断的分子标志物，具体涉及骨髓细胞中的分子标志物FOXM1基因在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用。本发明首次发现了FOXM1基因表达与多发性骨髓瘤相关。通过受试者中FOXM1的表达，可以判断受试者是否患有多发性骨髓瘤、或者判断受试者是否存在患有多发性骨髓瘤的风险，从而知道临床医师给受试者提供预防方案或治疗方案。本发明发现了一种新的生物标记物‑FOXM1基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更方便、更灵敏，能够实现多发性骨髓瘤的早期诊断，从而降低多发性骨髓瘤的死亡率。

Description

分子标志物FOXM1基因的应用
技术领域
本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于多发性骨髓瘤诊断的分子标志物，具体涉及骨髓细胞中的分子标志物-FOXM1基因在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)，是一种浆细胞异常增生的血液系统恶性肿瘤，约占所有血液系统恶性肿瘤的10％，严重危害人类健康。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害等。由于正常免疫球蛋白的生成受抑制，因此容易出现各种细菌性感染
目前多发性骨髓瘤的诊断主要依靠骨髓克隆性浆细胞比例和(或)活组织病理学检查作为MM诊断基础。2014年，国际骨髓瘤工作组(IMWG)对MM诊断标注进行了修订，定义骨髓克隆性浆细胞比例≥10％和/或活组织病理学检查证实为浆细胞瘤；同时伴有以下一种或多种情况：高钙血症、肾功能不全、贫血和溶骨性骨损害；将骨髓克隆性浆细胞比例≥60％、受累血清游离轻链与未受累血清游离轻链比值≥100、MRI检查发现局灶性病变部位>1处(每处检查的病灶直径≥5mm)作为极高危无症状MM生物学标志物纳入MM诊断标准。此外，MRI、低剂量全身CT、FDG/PET及PET/CT等现代影像学技术被纳入检查辅助方法。
到目前为止，很多生物标志物都不能很好的用来作为临床诊断标志。目前临床常用的诊断标志物是单克隆免疫球蛋白(M蛋白)，在MM患者血清中M蛋白所属免疫球蛋白显著增高而非M蛋白所属免疫球蛋白含量显著下降。但修订后的MM诊断标准强调单克隆蛋白水平并不是诊断活动性MM所必需。
综上，目前多发性骨髓瘤诊断的方法复杂、检查项目多，缺少一种可靠、方便的临床诊断方法。新的研究表明，在多发性骨髓瘤患者中，检出FOXM1基因的表达显著增高，FOXM1基因的表达水平与骨髓瘤细胞的生长或抑制有直接关系。表明FOXM1是一种高危的骨髓瘤基因，可为多发性骨髓瘤的临床诊断提供可靠的判断。
FOXM1是Fox家族中转录因子之一，特异性表达于增殖期细胞中，在细胞终末分化时消失。FOXM1的表达水平与正常细胞的增殖、衰老及器官的形成过程密切相关，而其异常表达则通过影响基因组的稳定性及有丝分裂过程的进展等促进肿瘤的发生发展及转移，且FOXM1在肿瘤干细胞的存在及维持干细胞多能性方面发挥重要作用，因此FOXM1的表达水平将为肿瘤诊断、评估、预后等提供一个重要指标。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供了一种分子标志物FOXM1基因的应用，可用于多发性骨髓瘤的诊断。相比于目前的诊断方法，大大减少了检查项目，降低成本；配合辅助诊断方法，准确率高；具有及时性，特异性，灵敏性。
技术方案：骨髓细胞中的分子标志物-FOXM1基因在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用。
上述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测FOXM1基因表达水平以诊断多发性骨髓瘤的产品。
上述用RT-PCR诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增FOXM1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增FOXM1基因的引物；所述用免疫检测诊断多发性骨髓瘤的产品包括：与FOXM1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断多发性骨髓瘤的产品包括：与FOXM1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断多发性骨髓瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片，其中蛋白芯片包括与FOXM1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与FOXM1基因的核酸序列杂交的探针。
上述用实时定量PCR诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增FOXM1基因的引物，序列如：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
一种用于诊断多发性骨髓瘤的工具，该工具能够检测样本中FOXM1基因的表达。
上述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。
上述芯片包括基因芯片或蛋白质芯片，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测FOXM1基因转录水平的针对FOXM1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的FOXM1蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测FOXM1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括FOXM1蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测FOXM1基因转录水平的试纸；所述高通量测序平台包括用于检测FOXM1基因转录水平的试剂。
上述检测FOXM1基因转录水平的试剂包括针对FOXM1基因的引物和/或探针。
有益效果：本发明首次发现了FOXM1基因表达与多发性骨髓瘤相关。通过受试者中FOXM1的表达，可以判断受试者是否患有多发性骨髓瘤、或者判断受试者是否存在患有多发性骨髓瘤的风险，从而知道临床医师给受试者提供预防方案或治疗方案。本发明发现了一种新的生物标记物-FOXM1基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更方便、更灵敏，能够实现多发性骨髓瘤的早期诊断，从而降低多发性骨髓瘤的死亡率。
附图说明
图1显示利用基因芯片检测FOXM1基因在多发性骨髓瘤患者和正常人中的表达差异。分析22例正常骨髓，44例意义未明的单克隆丙种球蛋白疾病(monoclonal gammopathyof undetermined significance，MGUS，MM前体疾病)，351例MM初诊病人浆细胞基因芯片数据库，发现FOXM1基因的表达水平在MM患者中要明显高于正常以及MGUS样本。
图2显示利用QPCR检测FOXM1基因在多发性骨髓瘤患者和正常人中的表达差异。
图3显示利用RT-PCR检测FOXM1基因在多发性骨髓瘤细胞株、患者中和正常人中的表达差异。条带1：人多发性骨髓瘤8226细胞株；条带2：人多发性骨髓瘤U266细胞株；条带3-10：患者多发性骨髓瘤标本；条带11：正常人。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明提供了检测FOXM1基因表达的产品在制备诊断多发性骨髓瘤的工具中的应用。
进一步，上面所提到的检测FOXM1基因表达的产品包括：通过RT-PCR，实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台等检测FOXM1基因表达水平以诊断多发性骨髓瘤的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增FOXM1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增FOXM1基因的引物；所述用免疫检测诊断多发性骨髓瘤的产品包括：与FOXM1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断多发性骨髓瘤的产品包括：与FOXM1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断多发性骨髓瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与FOXM1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与FOXM1基因的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增FOXM1基因的引物的序列如：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测FOXM1基因表达的产品可以应用于该平台实现对FOXM1基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知FOXM1基因的异常与多发性骨髓瘤相关也属于FOXM1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种多发性骨髓瘤的工具，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测FOXM1基因转录水平的针对FOXM1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的FOXM1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括FOXM1基因在内的多个基因(例如，与多发性骨髓瘤相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括FOXM1蛋白在内的多个蛋白质(例如与多发性骨髓瘤相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与多发性骨髓瘤相关的标志物同时检测，可大大提高多发性骨髓瘤诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测FOXM1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括FOXM1蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测FOXM1基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对FOXM1基因的引物和/或探针。根据基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测FOXM1基因表达水平的引物和探针。
所述高通量测序平台包括检测FOXM1基因表达水平的试剂。
所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测FOXM1基因的转录水平。
与FOXM1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其他衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述FOXM1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述FOXM1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如：嵌合抗体，scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)。只要所述片段能够保留与FOXM1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
本发明的具体实施方案中，所述针对FOXM1基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示。
用于诊断多发性骨髓瘤的FOXM1基因及其表达产物的来源包括但不限于骨髓、血液、组织液、尿液、唾液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断多发性骨髓瘤的FOXM1基因及其表达产物的来源是骨髓。
本发明的上下文中，“FOXM1基因”包括FOXM1基因以及FOXM1基因的任何功能等同物的多核苷酸。FOXM1基因包括与目前国际公共核酸序列GeneBank中FOXM1基因(NC_000012.12)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，FOXM1基因的编码序列包括以下任意一种：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述FOXM1基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，FOXM1基因表达产物包括FOXM1蛋白以及FOXM1蛋白的部分肽。所述FOXM1蛋白的部分肽含有与多发性骨髓瘤相关的功能域。
“FOXM1蛋白”包括FOXM1蛋白以及FOXM1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括FOXM1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与FOXM1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，FOXM1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生物的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少具有80％同源性(又称为序列统一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述FOXM1蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是FOXM1蛋白的融合蛋白。对于与FOXM1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留FOXM1蛋白的生物活性即可。
本发明的FOXM1蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留FOXM1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“多发性骨髓瘤”既包括判断受试者是否已经患有多发性骨髓瘤、也包括受试者是否存在患有多发性骨髓瘤的风险。
实施例1筛选多发性骨髓瘤患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象：
收集多发性骨髓瘤患者8例，正常人8例
多发性骨髓瘤患者的纳入标准：所有多发性骨髓瘤的诊断根据WHO诊断多发性骨髓瘤标准，所有初治多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞标本获得病人的知情同意。
多发性骨髓瘤患者的排除标准：转移癌，反应性浆细胞增多症和未定性的单克隆免疫球蛋白病。
2、骨髓中总RNA的提取
(1)骨髓单个核细胞的分离：向收集到的骨髓标本中加入3倍体积的红细胞裂解液，用滴管反复吹打混匀后于冰上放置10～15min，使骨髓标本中的红细胞充分裂解；1200rpm/min离心5min，弃上清，PBS洗涤细胞1次。弃上清，加入1mL PBS吹打混匀后转移至1.5mL EP管中，1200rpm/min离心5min，弃上清。每个样本加1mL Trizol，吹打混匀。
(2)每1mL Trizol加入氯仿200μL，充分混匀剧烈震荡15秒，室温静置10min等待分层。
(3)于4℃12000rpm/min离心15min。离心后可见管中混合物液面分为3层，最上层为无色水相，含有RNA；中间层为白色絮状，含有蛋白层与DNA；最下层为红色的酚-氯仿有机相。
取上层水相约400μL至另一EP管中，注意避免吸入中间的蛋白层，每管加入等体积异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10min，于4℃12000rpm/min离心10min，可见管底白色沉淀。
弃上清，加入-20℃预冷的75％DEPC酒精1mL，悬起沉淀，4℃7500rpm/min离心5min。
弃上清，室温放置10-20min风干沉淀，依据沉淀量的多少酌情加入DEPC水溶解沉淀。-80℃冰箱保存。
3、RNA样品的质量分析
紫外分光光度计检测RNA样品，OD260/OD280为1.8-2.0。
4、基因芯片杂交及扫描
采用Affymetrix U133Plus 2.0microarrays检测RNA水平。多发性骨髓瘤患者组的数据可在NIH基因表达综合(GEO)下GSE2658检索号查得，正常组和未定性的单克隆免疫球蛋白病的基因芯片数据在GSE5900下。
5、芯片数据处理与分析
基因芯片的数据分析基于GCO1.1软件(Affymetrix)，包含对与疾病相关相关的生存的单变量的对数等级检测。对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
6、统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P＜0.05有显著意义。
7、结果
结果显示(如图1所示，分析22例正常骨髓，44例意义未明的单克隆丙种球蛋白疾病(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS，MM前体疾病)，351例MM初诊病人浆细胞基因芯片数据库，发现FOXM1基因的表达水平在MM患者中要明显高于正常以及MGUS样本)，与正常人相比，多发性骨髓瘤患者FOXM1基因的MRNA水平显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
实施例2 QPCR实验验证多发性骨髓瘤患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象
筛选标准同实施例1，多发性骨髓瘤患者46例，正常人66例。
2、骨髓中总RNA的提取
步骤同实施例1。
3、逆转录
根据TAKARA逆转录试剂盒进行RNA逆转录。采用10μL反应体系，分别加入5×PrimeScript RT Master Mix 2μL，总RNA 0.5μg，加一定量RNase Free Water至10μL。37℃反应15min，85℃反应5s。产物cDNA置-20℃冰箱保存。
4、QPCR
采用10μL反应体系，每个样本设置3个复孔，加样过程避光。配制以下反应体系：2×SYBGREEN Master Mix 5μL，正向引物0.5μL，反向引物(5pm)0.5μL，反向引物(5pm)0.5μL，模板cDNA 1μL，ddH2O 3μL。扩增FOXM1基因的正向引物序列为5’-TGCCCAGCAGTCTCTTACCT-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-CTACCCACCTTCTGGCAGTC-3’(SEQ ID NO.4)；扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(SEQ IDNO.5)，反向引物序列为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(SEQ ID NO.6)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃1min，95℃15s，60℃15s，72℃30s；共40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，△△CT法进行相对定量。
5、统计学方法
结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间差异采用t检验，认为当P＜0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图2所示，与正常人相比，多发性骨髓瘤患者的FOXM1基因的mRNA水平显著增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，结果同基因芯片实验。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京中医药大学
<120> 分子标志物FOXM1基因的应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19475
<212> DNA
<213> 人源
<400> 1
tttcaaacag cggaacaaac tgaaagctcc ggtgccagac cccacccccg gccccggccc 60
gggaccccct cccctcccgg gatcccccgg ggttcccacc ccgcccgcac cgccggggac 120
ccggccggtc cggcgcgagc ccccgtccgg ggccctggct cggcccccag gttggaggag 180
cccggagccc gccttcggag ctacggccta acggcggcgg cgactgcagt ctggaggtga 240
gcgggatgca gcaatggagt cccaggcctg gcctgggcac aggcggggag caaggcctcc 300
gggcgcggag gtcagggcgt ctagcagcag ggcacgggcc acgagtggag atttgggtca 360
cacgggaaga atctgagcca gggtgcaagt tttttctgcg tccacctcct ggccgtggcc 420
ttctcactgc ttaaagcgcc ccttggcctt ccctggaagt ctgacctccg caccctgccc 480
gcggcctcgg gagggctggg gtggcctacc ttcttaggcc gactgtggct gagatgaaga 540
ctgagattgt actacattga gtcaaagacc aacctgcata cacactcccc tgctcccagg 600
ctgtctcacc actaggcaac accgcctcca tcttacttac ccttttgcag ggcccttttc 660
ctggttcttg agaatgtagc aagatttccc cgctcaggat ggggatgggt cggaggagcc 720
actctggaag tttcccgggc aagaaagtgt tggcaataat aataacgggc tggtcaggaa 780
gtagaagaga aaattaagac ttagatatcc tgtggaaaaa gaggaataat atctactgat 840
tgatgcgggg agagagggaa gcctggaaag atcggaggtg aaagtaaaac tgagatttga 900
aggtagaggt gtggagggcc tgtgaactct atgcagatga caaatgtcaa aaaagtgcag 960
ttgcttttca gggagagaat aagtgtccta aaaaagagac agccaattcc tctgtcttcc 1020
aaagttccgt gaaatagaat tacacaattt tgcttaatgg tagaatattc catgtatcta 1080
ttaaaatcaa caaaaggccg ggcgcagtgg ctcacgcctg taatcccagc actttgggag 1140
gccgaggcgg gtggatcacc tgaggagttc aagaccagcc tggcaaacat ggtgaaaccc 1200
tgtttctact aaaaaaaaaa aaaaaaaatt agctgggcat ggtggtgcat gcctgtaatt 1260
gcagctactc gggaggctga ggcaggagaa tcgcttgaac ccgggaggcc gaggttgcag 1320
tgagctgaga ttgcgccatt gcactccagc ctgggtgaca agagcgaagc tccgtctcaa 1380
aaaaaaaaaa aaaattaaaa aaaatcaaca aaagacttaa aaaaaaaaga ctacactgtt 1440
agcatttcag aaccacctta gtgtaatgat gatagctcat tgtggtacta agaagacagg 1500
ggttatagtc ttatttctgg aaaagaaatt aataaagtgg catgcttagt taaaatatat 1560
ataaccacat gcaagtacta aaatgccact gtataaatac aatacaaatt gtaaaagaaa 1620
acatgctttt taaattagag caagtataat agcctgtgaa ataaatgtca ccctctagag 1680
ttgttcagtg cacaagctgc acaactttac atgggccttc agtagaggtt tccattttat 1740
gtgaggtttt gtaaactggg agatgatttt tccagtagtg tggcaatagt acaatctgcc 1800
tttcttccct gattctgtgt gcactggtcc tatttacaaa gtaatataaa aatcaaaagg 1860
cttggccaga cgcggtggct cacgcctgta atcccagcac tttgggaggc cgaggcgggc 1920
agatgacctg aggtcaggag tttgagacca gcctgagcaa catggtgaaa ccctgtctct 1980
actaaaaata caaaaactag ccgggcgtgg tggtgggcac ctgtaatccc agctactcag 2040
gaggctgaga cgtgggactc gcttaaaccc aggaggcaga ggttgcagtg aactgagatc 2100
gtgccactgc actccagcct gggtgacaaa gtgagactct gtctcaaaaa aaaaaaaaaa 2160
aaaaaaatta aaatcctttg tcttgaatgg attatgggat cagagtttca tcaggactcc 2220
taattaccat atgctttcct attctagcat cttccatttc tgtccataca gtcattgcaa 2280
gtgatctatt tatattatag taggcaatta tagagatttc cacatatttg tagctatccc 2340
atccatttct gtagccaaat attctgaagc ttcaaggaga tctttgtctt atctccaacc 2400
cagtcccatt tttgcccttt gaattgcttc tgtctgctgt aattttagcc ttcttttgtc 2460
agtaaagctt atctccttat tatctgaggt ctttacaaaa gtccatggaa tgtttacctg 2520
ggcctttagg ctcatgttcc tggtcatata aagaggagca cctttctcta aaaggacctc 2580
ttctcagcct aaacaatctc taacatcttg ccactatttg cattttccag ggtccacact 2640
tgtgattctc aatggagagt gaaaacgcag attcataatg aaaactagcc cccgtcggcc 2700
actgattctc aaaagacgga ggctgcccct tcctgttcaa aatgccccaa gtgaaacatc 2760
agaggaggaa cctaagagat cccctgccca acaggagtct aatcaagcag aggcctccaa 2820
ggaagtggca gagtccaact cttgcaagtt tccagctggg atcaagatta ttaaccaccc 2880
caccatgccc aacacgcaag tagtggccat ccccaacaat gctaatattc acagcatcat 2940
cacagcactg actgccaagg gaaaagagag tggcagtagt gggcccaaca aattcatcct 3000
catcagctgt gggggagccc caactcagcc tccaggactc cggcctcaaa cccaaaccag 3060
ctatgatgcc aaaaggacag aagtgaccct ggagaccttg ggaccaaaac ctgcagctag 3120
ggatgtgaat cttcctagac cacctggagc cctttgcgag cagaaacggg agacctgtgg 3180
tatgtggtct tccagggaaa ggggtgaggg agcccagcct ttcctctgta gtggcaaggt 3240
gtgtagtcag tcttgatgct tacaacagtc aggcttctgg ccgagcacag tggctcatcc 3300
ctgtaatccc agcactttgg gaggctgagg cgggcggatc acttgaggtc agcagtttgg 3360
actagcctgg ccaacatggt gaaacccgtc tctactaaaa atataaaaaa actagccgag 3420
cgtggtggca cacgtctgta gtcccagcta ctctggaggc tgaggcagga gaatcgctga 3480
acctgggagg tggaggttgc agtgagctga gattatgcca ctgcactcca gcctggccac 3540
agagggagac tctgtctcaa aaaaaaaaat aaaaatgaaa aaagaagggg tctcaaaaat 3600
aaataaatga agaaggggtc tcactatgtt gcccaggctg gtctcggact cctgagctca 3660
agggatccaa ccatatgggc ctcccaaggt gctgggatta taggcatgaa cgacagcgcc 3720
tgacttcatt ttccttcttt tttttttttt tttttttgag atggagtctt gctctgttgc 3780
ccaagctgta gtgcagtggt gcaatctcag ctcactgcaa tctccacctt ctgggttcaa 3840
gtgattctcc tgcctcagcc ttctgagtag ctgggattac aggcacccgc caccacacct 3900
ggctaatttt ggtatttttt agtagagaca ggggtttgcc atgttagcca ggttggtctt 3960
gaactcctga cctcaggtga ttcgcccacc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggt 4020
gtgagccact gcgcctggcc tcattttcct tcttgataaa ggagaaaact gaagcaagag 4080
gaggaaaatg actttttctt tagagatgcg gtctcgcact gtcacccagg ctagagtgca 4140
gtggcgcaat cacggctcac tctagcctcg aatgcctgga ctcaagccat tctcccacat 4200
cagcctccca agtagctggg actataggca tgcaccatca ttcccagtta attttttttt 4260
tctttttgca gagatggggt cccactatat tgcccaggct gaaaagtgac ttttttggtg 4320
tgcatatctc aataattctt ttgtaagcct gccttgattg atctctaagg ctcagtgtgg 4380
ctcagcttga aatgcaattt gaactatgct cctaaatttg tcctgaaatg cataatgggg 4440
cagagtaact tagagccaca atagattcag catgtgttct ccgtccctaa aggcagaggt 4500
cttggacaag tgatccctag ccaccaattc tttctttttt attttttatt tttctgagac 4560
agagtctcac tcaggctgga gtgtagtggc gcaatgttgg ctcactgcag ccttcgtctc 4620
ccgggttcga gcaattctcc tgtctcagcc tcctgagtag ctgggactac aggcgtgtgc 4680
caccacaccc agctaatttt gtatttttag tagagacgag gtttcaccat gttggccagg 4740
ctggtcttga actcctgacc tcaggagatc cacccgcctc gccctcccaa agtgctagga 4800
ttacaggtgt gagccactgc acccggcctg ctagccacca attctgatgg acacacctgg 4860
gcatctgatg aggcagctaa gtggggtgtt ggattatttt ccctctagca gatggtgagg 4920
cagcaggctg cactatcaac aatagcctat ccaacatcca gtggcttcga aagatgagtt 4980
ctgatggact gggctcccgc agcatcaagc aagagatgga ggaaaaggag aattgtcacc 5040
tggagcagcg acaggttaag gtgaattgtt ccgtccctca ctaaagaaat cagatccagt 5100
gtagggaatt cctaggtagg gaaatggatc aagtggcctg atggaccaga atttccaagt 5160
tctggtatta gctctccact tcatgctatt ctgcataact tttgagctat ttttctgcct 5220
gggatctttt ctctcccatc tgtgaaattt ccttgagggc agagtccctt ggtcactctg 5280
tattccagcc agcactgggt ttagtatttt gtccttagta ggtattcagg aaatgattaa 5340
gaggtcttca ttttgggaat ccacctgaac tttaaagatg cttcccaaca gtatgaacag 5400
tatgaattga atagaataca acaagttaat tttattagaa gatataatat taatagcaga 5460
taaagtcagt tatatatata cacgtatata tatttttttt ttttaagaca gcgtcttgct 5520
ctgttgccca ggctggagcg caatggtgca gtcatggctc tctgcagcct cgacctccag 5580
ggctcaactg atccttctac ctcagtcttc caagtagctg ggacttgcca gcttggtgca 5640
tgccaccatg cccagctaat ttttgtattt tttgtagaga tggggtttcg ctatgttgcc 5700
caggctgatt tcaactcctg ggctctagtg atcctcctgc ctcagcctcc caaagggctg 5760
ggattacagg cgtgaaccac cagcctggcc tagatacgaa ttttaaatac ttctctagca 5820
atcaaaattg atctaaccca attgtgtagt ctgggttttt ttcccacagt taccaatata 5880
acacatctag attctattgt atatatgtgt aaatcactca ttcaaccttt attttctttt 5940
ttttctcaac ttttatttta ggttcagggg gtacatgtgc aggtgtgtta catgggtata 6000
ttgtgtgtcg ctggggttta gtgtacaaat gattttgtca cccaggtagt gagtatagta 6060
cctgctaggt agtttttctg tctccccctc ctcccactct ccaccctcaa gaaggccctg 6120
gtgtctagtg ttcccttctt catatccatg tgtgctcaat gtttagctcc tgcttttttt 6180
tttttttttt ttttttttga gacgtagtct ttctctgtct cctaggctgg agtgcagtgc 6240
tgcgatttca gctcactgct acctccacct cccaggtcaa gtgattctcc tgcctcagac 6300
ttctgagtag ctgggattac aggtgcccgc tgccacgccc ggctaatttt tgtattttta 6360
gtagagatgg ggtttcacta tgttggccag gctggtcttg aactcctgac ctcgtgatcc 6420
acctgccttg gccttccaaa gtgctgggat tacaggcgtg agccactgcg cccggcctct 6480
ttttttttct ttttgagacg gattctctct ttgttgccag gctggagtgc agtggcacaa 6540
tctctgctca ctgaaacctc tgcatcccag gttcaagtga ttctcctgcc tcagcctccc 6600
gagtagctgg gactataggc gcccgccacc acgcccggct aattttttta tttttagtag 6660
agatggggtt tcaccatggt ggccaggatg gtctcaatct cttgacctcg tcatccaccc 6720
gcctcagcct cccaaagtgt tgggattaca ggcgtgagcc accgtaccca gcctagttcc 6780
tacttataag tgagaacatg caatatttgg ttttctgttc ctgcattaaa tcgcttagga 6840
tcatagcctc cagctcaaca atctttaaaa gtgaaaattt ggccaggcgc gataactcat 6900
gcttgtaatc acagcacttt gggaggccaa ggtgagtgga tcacctgacg tcgggagttc 6960
cagaccagcc tgaccccgcc tctactagca atacaaaatt agctgggtgc agtagtacat 7020
gcctataatc ccagctactc gggaggctga ggcaggagaa tcacttgaac ccaggaggca 7080
gagcttgcgg tgagccaaga tcgtgccatt acactccaac ctgggcaaca aaagtgaaac 7140
tctgtctcaa aaaaaaaaaa aaagtgaaaa tttacatgcg tgtatatgta agtaaatatt 7200
aattgtgcta tatacataaa atttgtgtac tttagaaagt aatatctcca attttaaaaa 7260
tgtgaatgag accgggcata gcggctgaca attgtaatcc cagcactttg ggaggccaag 7320
gtgggcagat tgcttgagcc cgtaagttct aggccagcct gggcaacata gcaaaatcct 7380
ggtctctact actaaaaata cgaaaaaaaa aaaaaaaatc gccaggcgca atggctcatg 7440
cctgtaatcc catcactctg ggaggccaag gtgggtggat cacctgaggt caggagttcg 7500
agactagcct ggccaatatg gtaaacccca tctctactaa aaatacaaaa aaagtagctg 7560
ggcgtggtgg caggcacctg taatctcagc tacttgggag gctgcagcag gagaatcgct 7620
tgaacccagg aggcagaggt tgcagtgagc cgagatcgta ccattgtact ccagcctggg 7680
caacaagagt gaaactccat ctcaaaaaaa aaaaaaaaat tagctgggcg tggtggtgta 7740
tgcctgtagt cccagctact tggaggctga gacaggagga tcacctgagc ctgggaaggt 7800
caaggctgca gtgagctgtg atccagccac tgcacgctat cctgggtgac acagtgagac 7860
cctgtctcaa aaaaagaaaa agaaatgtga ttgatcagct ctttgcctaa aacttagcta 7920
actgtgtgct ttgcagacat tgtctgactc atagtcttga gaatgtttct ctcatacaaa 7980
cattgaaatg agatgcgttt attcacagca catcaggaac agaaatggga ctaagaccta 8040
ggtttctaga cccaaaagtc tgaaaaacgg gcgtggtttt agtgtaacat caatgctttg 8100
agaatcaaag tacatactca aactttccta agaaatttca actggaaggg actggatttt 8160
ctccaaattc aacaaaatga tggatgacaa aaccagtttc ttattggcta gggtctaggc 8220
tagatcatct ccaagattct tcccaactct aaaattttat tctatgagat agtggtctca 8280
gatgagtttg tttctagacc gtcctatggg ataaaggttt ctctagatgt tcttcaaggg 8340
cttgggttgg gggtgcttct catgaactct ttcatgtcat tccctgtgtc ataaccctca 8400
ggttgaggag ccttcgagac catcagcgtc ctggcagaac tctgtgtctg agcggccacc 8460
ctactcttac atggccatga tacaattcgc catcaacagc actgagagga agcgcatgac 8520
tttgaaagac atctatacgt ggattgagga ccactttccc tactttaagc acattgccaa 8580
gccaggctgg aaggtaatgt gtcccacagc aaccaaaatc aaggtcagcc cagcctgaca 8640
gtctctccag tgctgtactg caacttgtat ctgggacagc agttaagtgc aaaggacact 8700
agaatgataa acaaatgtat cttttagatt gtgactcaat cttattgaat ccaggcaaaa 8760
tcattaagaa gagctcctta actacttcat gtgttactac ctaaagtcca tggagggtct 8820
tcaatgtagc actcaagccc acttttctgc tacactcaac agccgtccta gatgccagca 8880
gctagagtgg ctaagtagtt ttatgaaaat gtcttgatta aaaaaaaaaa tgctgtctgt 8940
gagcctcatg acccaagatg tcatctcctg tagcgtcaca tagcatttct agtgggcagg 9000
ggttttcctt tcacttcatt catggaaaga ccgagatgcc tgtgagtcaa catagctcac 9060
gcagttggtc ggtgtcagag ccacaaatga ggtcttctga cgggtgctca attccaagtc 9120
aagtgtgctt tgttttcctc atggtagaac tctttctttt tttttttttt ttttttgaga 9180
cagagtctcg ctctgtcacc caggctggag tgcaatggca gatctcaggt cactgcaacc 9240
tcctccgcct ccaaggttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta 9300
caggcatgcg ccaccacgcc tggctaattt ttttgtattt ttagtagaga cagtgtttca 9360
ccatgttggt caggctggtc tcgaactcct aacctcaaat gatccacccg tctcgacctc 9420
ccaaagtgct gggattacag gcatgagcca ccacacctgg cccctcatgg tagaactatg 9480
tttttttttt ttttgagatg gagtctcgct ctgtcaccca ggctggagtg cagtggcgcg 9540
atctcggctc actgcaagct ccgcctcctg ggttcacgcc attctcctgc ctcagcttcc 9600
cgagtagctg ggactacagg cgcccgccac tacgcctggc taattcatgg tagaactttt 9660
aattttactc ccttccatca gcttactttc ctagtttttt gtttgtttgt tttttgagac 9720
agggtctcac cctgttgcct gggctggagt gcagcctcag ccccctgggc tcaagctctt 9780
ccctcctcaa catcccaagt agctgggata acaggtgcac caccacagtc cgctaatttt 9840
ttttttgtag agacagttgc ccaggctggt tactatgttg cccaggctgg tctgaactcc 9900
tagtctcaag cactcctcct gccttagcct ctcagtgcac tgtgattaca ggcgtgagcc 9960
accacaccca gccttaattt cctagtttct tgtttgtttg tttgagacgg ggcctcactc 10020
tgtcacccag gctggagtgc agtgacatga tcttggctaa cttcaacctc tgcctcccag 10080
gttcaagtga ttcccctgcc tcagcctccc gagtagctgg gactaaaggc atgcgccacc 10140
atgcctggct aatttttata tttttgatag agacagggtt tcaccatgtt tgctaggctg 10200
gtctcaaact cctggcctca agtgatccac tcaccttggc ctcccacagt gctgggatta 10260
taggcgtgag ccaccacgcc gggcctaatt ccctagtttc ttaatttctc tgagccacct 10320
ttcttgctat tgatcactac ctcacagcct tactctgctt ttctagcccc tgacagctat 10380
ctaggtcttt tctttatcac aatctaaggt tggcatcagt ctttattccc gtagaataga 10440
tgggtttatg gctgaaggtg acggctctgc ggtgtggagt gtcaggagag ttgccaagag 10500
ggctgcaaag acaccagacg aagcctgtgc tgagcacagt gggaggggcc tgaggctggt 10560
ttccccatgt gtttgaaggg tgatgtttct gaatctaaag tagctgataa ccagttgtct 10620
tgctcttctt ccagaactcc atccgccaca acctttccct gcacgacatg tttgtccggg 10680
agacgtctgc caatggcaag gtctccttct ggaccattca ccccagtgcc aaccgctact 10740
tgacattgga ccaggtgttt aaggtgaatg ccctgctttc ctctaaatag ggcctaagtt 10800
ggaggttgtc atagccatct caaaaggaaa caagttctgc tagtgatgct ttcatttgat 10860
caggggagag ttagaagcca gccacccaat tagtgacttg cacaaaaccc agtgaattaa 10920
gtacacttga caaataccaa atgacacatt tttgtgccag accagagcaa ggagaaggct 10980
gttctgaccc aacagaaagg gctccccagg gcagtgtttt cctaacttcc ctgtgaatgg 11040
gaattgcctg ggacattgtt aaaacacagc ttcccagacc cctctcttgg ggctcttgat 11100
ttagtgcttc tgggatgggc ccaggaattt gtatttttag caagcatctc aggtgattct 11160
tacaagaaat tctgggaatg cttgctctaa aaaaagccct tcctgctggg tgtggtggct 11220
cacgtctgta atcccagcac tttgggaggc tgaggcaggt ggatcaccta aggtcgggag 11280
ttggagacca gcctgaccaa catggagaaa ctccgtctct actaaaaata caaaaattag 11340
ctgggtgtgg tggcgcatgc ctgtaatccc agctacttgg gaggctgagg caggagaatc 11400
ccttgaaccc aggaggcggt ggttgtggag agctgaaatc gcaccattgc actccagcct 11460
gggcaataag agtgaaagtc tgtctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagcctgcct 11520
taggctggag accagaagct gagctaccag aacgtctttt cagaaagaag ttattttggt 11580
ttttcagagt gcccataagg ctgctggtag ctgtaaccat tctcctggga ggggcagttg 11640
tctggggtgt cttttgtcat cagtcaggaa taagtgtttt tcccaatccg gtcaaattga 11700
ccacgttggt ggtaacttca tctcatttct ctcccacaat gcctggccgc caccagccac 11760
tggacccagg gtctccacaa ttgcccgagc acttggaatc agtaaggttc tttccctctg 11820
gctcggggct tggccttgtt ttcctttcac tgctcagcat ggctttagtg gacagagaca 11880
agatgtgatg tggggaaggg tccctatggc catgttttgt ctaggtgcca gccctagaca 11940
cagaacaccc tgagggtcag gcacacaccc acttccctcc ccttccatgg gcatcacaag 12000
ggcacactga gcagagcagg gcacagcagg ggagcatgct gcagcagcca caagcgcatg 12060
gcaccagcct caggggcggc agttcgttcg ctcacttttg tgcctagctt ttctttgcca 12120
cgcatatagc tacctgctct ggcatccccc aggggtgttg aggacacgtg ggtgaagcgg 12180
tagtgccact ctgccatcat gtgtctgtag gccacccacc tgcccactca tcacagtttt 12240
ggagactgct cgcctacgtc catcccctca ggttggcctc ctctctctgg gctgtcatta 12300
actcaagcac acaccaccag agcagctggt ggggttttgc catcccctct ttaccttatt 12360
gtgttaacat aggtttcttt ctctccccat ctgccacaag cagcagcaga aacgaccgaa 12420
tccagagctc cgccggaaca tgaccatcaa aaccgaactc cccctgggcg cacgttagta 12480
tgggagagtg ggccttgggc ctggtccttg ttctggggcc atatctttag ggaaccagac 12540
tctgggattc tgttcccacc tcaaagggat ctgagcccag agaaggagag caaagctcct 12600
ggggctgaga aggggtgtac tccagtcccc ctgctcctga tctctcgtgt ttcctcctag 12660
ggcggaagat gaagccactg ctaccacggg tcagctcata cctggtacct atccagttcc 12720
cggtgaacca gtcactggtg ttgcagccct cggtgaaggt gccattgccc ctggcggctt 12780
ccctcatgag ctcagagctt gcccgccata gcaagcgagt ccgcattgcc cccaaggtgg 12840
gtgtcctatt ttcctctgaa gagagattct ggccaattaa gaatgttgga ccttcagctt 12900
gcaaagcact ctgataagtg ttccttgaga gcttataaat ctagttgggt agaaaaggca 12960
taaaaacata gggaagtgta atagcattag aagagctaaa aaggtatttg gattacaatg 13020
taagtggtgt cagaaggccc ataaatacct gatgagcttg taagaattca gacaaaagtg 13080
attgtgatag atgggctagg attattaagg aagatacaca agggaggcag gccttagaaa 13140
gagatggatt tggccgggcg ctgtggctta cacctgtaat cccagcactt tgggaggcca 13200
aggcaggtgg atcatgaggt caggagtttg agaccagcct ggccaacgtg gcgaaacccc 13260
gtctctacta aaaaatacaa aaattagctg ggcttggtgg cacatgcctg taatcccagc 13320
tacttgggag gctgaggctg gagaatcaca tgagcccagg aagggaagtt gcagtgagcc 13380
gagatcactg cactccagcc tgggtgacag agcgagactc tgtctcaaaa aaaaaaaaag 13440
aaaagaaaga agtggatttg aggctagacg ctgtgggtct cacttgtaat cccgacactt 13500
tgggaggccg aggcaggggt attgcttaca gccaagagtt cgagaccagc ctgggcaaca 13560
tagcaagacc ccagtctctg ctaaaaatgc aaaaaaaaaa attagccacg gtggtagtac 13620
atgcctgtgg taccagctac tcaggaggct gaggcagaag gatcacttga gtccaggagg 13680
ttgaggctgc agtgagccct gtttgcacca ctgcactcca gcctgggcaa cagtgaggcc 13740
ctgtctcaaa aaagaaaaga aaaaaagtag atttgggtaa gcaaacaggt gtagagagag 13800
catgctaatg ggcagtgcca tggaggcggg aaatgcagtt cgtacctggc agtagtaaag 13860
tgactgggtc agactaactc agggtttctc aagtactatt cacgttgaca gctggagaat 13920
tctttgttgg gcgtgggagg gactgtcctg tgcactgaag ggtgtttagc agtatccctt 13980
gttttcccca ctagacgcca gtagcaccca ccacaggcgc ggcaatccaa atgcctccag 14040
acattgccaa atgtcccctg gcagggaggg aatcacccct gcttgagtat cactggtcta 14100
gcttgagggg aaggtgagaa gggtaaattc agagccaact tggatcagcc atcagatctg 14160
cacttaacac tgttaaaggg ttctgtgagt acgggctgac atgtaaccaa agtgaaaagc 14220
ttcccccatc cccttcagag agatgaaaat agcatagagt ctggagttta gagcgacttg 14280
ggtttgcttt ttttttaata tataaaatct tttaggccat gcacagtggc tcacacctat 14340
aatcctagta ttttgggagg ccaaggcagg aggatcactt gaggccagga gttcaagacc 14400
agcctgggca gcaaagtaag accctgtctg taacaaaaaa aaaaaaattt ttttttaatt 14460
agccaggcat tttcatgtat acctgttgtc ccagccactt gggaggctga ggcagaagga 14520
ttacttgagc tccagagctg gaggctgcaa tgagctataa tcgtgccact gcattctagc 14580
ttaggcaaca aaatgagacc ctgtctctaa aaaacatttt ctttaattat aaataaaaca 14640
tattacacac aaaattatac cacacataca taatttagcg taaattcatt catgtggccg 14700
tagcatgtgc cctgtttggg ttttcatgca gtgggttttc tcccctttcc tttttggctc 14760
cctctccacc ctaccatcac ccacatcacc cctactccca agataactgg ttgataattt 14820
atgatgcttt cttgcatatt ttatcaatgc tcttagttat actatacatg tatagcgata 14880
gccattttat atgtacacat acaacacaca gaacattgat aatgtaatca tgttgtgcat 14940
acttctctac atgtctcttt tttttttttt ttttcctgag acggagtctc actctgtcgc 15000
ccaggctgga gtgcaatggc atgatcttgg ctcactgcaa cctccgcctc ctgggttcaa 15060
gcgattctcc tgcctcggcc tcctgagtag ctgcgatcac aggcgcacgt caccacgccc 15120
agctaatttt tgtattttta gtagagatgg ggtttcacca tgttggtcag gctggtctcg 15180
agctcctgac ctcatgatcc gcctgccttg gcctcccaaa gtgttgagat tacaggaatg 15240
acccaccacg cccagcctct acatgtctct aactcaacaa tgcctcatgg aatttcttcc 15300
aagtcacttg gcatagtcct aattcattat tttttagtgt ccatgtaata ttccatgatg 15360
tggctacacc acagattttt cagccattcc acttttatgg acagattctg tttctcaaat 15420
tttgcccaat gaacgacact gcaataaata tgtttgcaag gatctctctt actagtgctt 15480
tcatttctct aggatagagt cccagatgtg agattgttgg gtgagaaggt attttaaatt 15540
ctactaaata ttgctagatt gctttccaaa aaagctatga taagtcatgt ttaaaccagc 15600
aatatatgat aagatctata tctttgccag caattggtat tattagtctg tttaatatct 15660
gccaatctaa tatgtatagg ttatatcttc ttaatttttt aaaatgtttt atttatttat 15720
ttttaaattt tttatttcca taggtttttg gggaacaggt ggtgtttggt tacatgagta 15780
agttctttag tggcgatctg cgagattttg gtacacccat caccagcttg tttaatttta 15840
tctttctttg tttatcagta agtctgagca ccttgtcatt atgtttggtg acttggaatt 15900
gtcctctatg aattggttat ttatgaacat tgcccatttt tatataggtt ttgttatcaa 15960
tttgtgagag ctcttttttt ttttttttga gacggagtct tgctctgtca cccaggctgg 16020
agtgcagtgg cgtgatctca gctcactgca gactctgcct cctgggttca agcgattctc 16080
ctgcctcagc ctcccaagta gctgggatta caggcgccca ccactgcgcc cagctaattt 16140
ttgtattttt tagtagagac agggtttcac catcttggcc aggctggtca cgaactcctg 16200
acctcatgat ccacccacct cggcctccca aagtgctggg attacaggca taagccacca 16260
cgcccagcct gtgagagttt tttttttttt tgagatggag tcttgctatg tcacccaggc 16320
tgaagtacag tggtgtgatc ttggcaacct ctgcctcccg ggttcaagca attctcgtgc 16380
ctcagcctcc cgagtagctg ggattacagg tgcatgccac cacgcccggc taattttgta 16440
tttttagtag agacaaggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctcgaact tctgacctca 16500
ggtgatctgc ctgccttggc ctcccaaagt gctggattac aggcgtgagc caccgcaccc 16560
agccccctgt gagagctctt tgttgttaaa ataatcttct ttcttttatg ctgaagatat 16620
ttttctactt ctattgttta tctctttact ttcctttctt ttcttttctg agacaggatc 16680
ttgctatgtt gcctagtctg gagtgcagtg gtgtaatgaa ggctcactac atccttgacc 16740
tcccaggctc aagtgatctt cccacctcag cctcccacct gtagctggaa ctacaggtgc 16800
atgccaccac atccagctaa ttaaaaaaaa tttttttgta gagatgggat ctcactatgt 16860
tgctcaggct ggtctcaaac tggcctcagt gtcttgcagt gctgggatta caggcattgt 16920
ttgttgtttc ttaactttgt ttatggtatc tcttgccaca gtaaaatttt aaagttttat 16980
gtagtcaaat gtctctcttc tcttttacag tttctgggtt tccagtcttg gttaagaagg 17040
tcacccgcac cctcagattg tatatgtagt ctcctagatt ctctttcagg atttgtatga 17100
ttttaaggtt ttcatttttt ttttaaagcc agtcaaattt agcagttggg ggttgtgtac 17160
caactttagt gacaataatg tcactacccg ctaccatcag agcagcctaa ggttcttatt 17220
ttcatgcatt aaatctttgt atacagtgta agacaagcat gcaattttat ttcctctcgg 17280
atgaatgcta ttataattat gccactacat actacatacc cgcatctttt acccccagaa 17340
ttgaactacc aacttcaaca tacatcgtat tctcatattt aatagatttt aagacttcaa 17400
aacgacacaa agaggatcag aacccgtatg tgatattttt gtgcgtcctg tctggtgacc 17460
gttggttcac cttatctctg tttccctttc aggtgctgct agctgaggag gggatagctc 17520
ctctttcttc tgcaggacca gggaaagagg agaaactcct gtttggagaa gggttttctc 17580
ctttgcttcc agttcagact atcaaggagg aagaaatcca gcctggggag gaaatgccac 17640
acttagcgag acccatcaaa gtggagagcc ctcccttgga agagtggccc tccccggccc 17700
catctttcaa agaggaatca tctcactcct gggaggattc gtcccaatct cccaccccaa 17760
gacccaagaa gtcctacagt gggcttaggt ccccaacccg gtgtgtctcg gaaatgcttg 17820
tgattcaaca cagggagagg agggagagga gccggtctcg gagaaaacag catctactgc 17880
ctccctgtgt ggatgagccg gagctgctct tctcagaggg gcccagtact tcccgctggg 17940
ccgcagagct cccgttccca gcagactcct ctgaccctgc ctcccagctc agctactccc 18000
aggaagtggg aggacctttt aagacaccca ttaaggaaac gctgcccatc tcctccaccc 18060
cgagcaaatc tgtcctcccc agaacccctg aatcctggag gctcacgccc ccagccaaag 18120
tagggggact ggatttcagc ccagtacaaa cctcccaggg tgcctctgac cccttgcctg 18180
accccctggg gctgatggat ctcagcacca ctcccttgca aagtgctccc ccccttgaat 18240
caccgcaaag gctcctcagt tcagaaccct tagacctcat ctccgtcccc tttggcaact 18300
cttctccctc agatatagac gtccccaagc caggctcccc ggagccacag gtttctggcc 18360
ttgcagccaa tcgttctctg acagaaggcc tggtcctgga cacaatgaat gacagcctca 18420
gcaagatcct gctggacatc agctttcctg gcctggacga ggacccactg ggccctgaca 18480
acatcaactg gtcccagttt attcctgagc tacagtagag ccctgccctt gcccctgtgc 18540
tcaagctgtc caccatcccg ggcactccaa ggctcagtgc accccaagcc tctgagtgag 18600
gacagcaggc agggactgtt ctgctcctca tagctccctg ctgcctgatt atgcaaaagt 18660
agcagtcaca ccctagccac tgctgggacc ttgtgttccc caagagtatc tgattcctct 18720
gctgtccctg ccaggagctg aagggtggga acaacaaagg caatggtgaa aagagattag 18780
gaacccccca gcctgtttcc attctctgcc cagcagtctc ttaccttccc tgatctttgc 18840
agggtggtcc gtgtaaatag tataaattct ccaaattatc ctctaattat aaatgtaagc 18900
ttatttcctt agatcattat ccagagactg ccagaaggtg ggtaggatga cctggggttt 18960
caattgactt ctgttccttg cttttagttt tgatagaagg gaagacctgc agtgcacggt 19020
ttcttccagg ctgaggtacc tggatcttgg gttcttcact gcagggaccc agacaagtgg 19080
atctgcttgc cagagtcctt tttgcccctc cctgccacct ccccgtgttt ccaagtcagc 19140
tttcctgcaa gaagaaatcc tggttaaaaa agtcttttgt attgggtcag gagttgaatt 19200
tggggtggga ggatggatgc aactgaagca gagtgtgggt gcccagatgt gcgctattag 19260
atgtttctct gataatgtcc ccaatcatac cagggagact ggcattgacg agaactcagg 19320
tggaggcttg agaaggccga aagggcccct gacctgcctg gcttccttag cttgcccctc 19380
agctttgcaa agagccaccc taggccccag ctgaccgcat gggtgtgagc cagcttgaga 19440
acactaacta ctcaataaaa gcgaaggtgg acatg 19475
<210> 2
<211> 1574
<212> PRT
<213> 人源
<400> 2
Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu
1 5 10 15
Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro
20 25 30
Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys
35 40 45
Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile
50 55 60
Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn
65 70 75 80
Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys
85 90 95
Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly
100 105 110
Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys
130 135 140
Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys
145 150 155 160
Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile
165 170 175
Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp
180 185 190
Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn
195 200 205
Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro
210 215 220
Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr
225 230 235 240
Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met
245 250 255
Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe
260 265 270
Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu
275 280 285
Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val
290 295 300
Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp
305 310 315 320
Gln Val Phe Lys Gln Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg
325 330 335
Asn Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met
340 345 350
Lys Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe
355 360 365
Pro Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu
370 375 380
Pro Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys
385 390 395 400
Arg Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala
405 410 415
Pro Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly
420 425 430
Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu
435 440 445
Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val
450 455 460
Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys
465 470 475 480
Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro
485 490 495
Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val
500 505 510
Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg
515 520 525
Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu
530 535 540
Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu
545 550 555 560
Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser
565 570 575
Gln Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro
580 585 590
Ile Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser
595 600 605
Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro
610 615 620
Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly
625 630 635 640
Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu
645 650 655
Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val
660 665 670
Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly
675 680 685
Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr
690 695 700
Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu
705 710 715 720
Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp
725 730 735
Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln Ala Ala Lys Ala
740 745 750
Lys Ala Ala Ala Ala Lys Gly Gly Gly Gly Pro Met Lys Thr Ser Pro
755 760 765
Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu Pro Leu Pro Val Gln
770 775 780
Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro Lys Arg Ser Pro Ala
785 790 795 800
Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys Glu Val Ala Glu Ser
805 810 815
Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile Ile Asn His Pro Thr
820 825 830
Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn Asn Ala Asn Ile His
835 840 845
Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys Glu Ser Gly Ser Ser
850 855 860
Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro Thr Gln
865 870 875 880
Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Asp Ala Lys Arg
885 890 895
Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys Pro Ala Ala Arg Asp
900 905 910
Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys Arg Glu
915 920 925
Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn Ser Leu
930 935 940
Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu Gly Ser
945 950 955 960
Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His Leu Glu
965 970 975
Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala Ser Trp
980 985 990
Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala Met Ile
995 1000 1005
Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu Lys
1010 1015 1020
Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His
1025 1030 1035
Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser
1040 1045 1050
Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val
1055 1060 1065
Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu
1070 1075 1080
Asp Gln Val Phe Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro
1085 1090 1095
Glu His Leu Glu Ser Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg
1100 1105 1110
Arg Asn Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg
1115 1120 1125
Lys Met Lys Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro
1130 1135 1140
Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val
1145 1150 1155
Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu
1160 1165 1170
Ala Arg His Ser Lys Arg Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Phe Gly
1175 1180 1185
Glu Gln Val Val Phe Gly Tyr Met Ser Lys Phe Phe Ser Gly Asp
1190 1195 1200
Leu Arg Asp Phe Gly Thr Pro Ile Thr Ser Leu Phe Asn Phe Ile
1205 1210 1215
Phe Leu Cys Leu Ser Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro
1220 1225 1230
Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly
1235 1240 1245
Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu
1250 1255 1260
Glu Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile
1265 1270 1275
Lys Val Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro
1280 1285 1290
Ser Phe Lys Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln
1295 1300 1305
Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser
1310 1315 1320
Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu
1325 1330 1335
Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro
1340 1345 1350
Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser
1355 1360 1365
Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser
1370 1375 1380
Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val Gly Gly Pro
1385 1390 1395
Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser Thr Pro
1400 1405 1410
Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu Thr
1415 1420 1425
Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr
1430 1435 1440
Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met
1445 1450 1455
Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser
1460 1465 1470
Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val
1475 1480 1485
Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro
1490 1495 1500
Gly Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser
1505 1510 1515
Leu Thr Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser
1520 1525 1530
Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro
1535 1540 1545
Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu
1550 1555 1560
Gln Ala Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ala Ala Lys
1565 1570
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcccagcag tctcttacct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctacccacct tctggcagtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcaccgtcaa ggctgagaac 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tggtgaagac gccagtgga 19

Claims (8)

1.骨髓细胞中的分子标志物FOXM1基因在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测FOXM1基因表达水平以诊断多发性骨髓瘤的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述用RT-PCR诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增FOXM1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增FOXM1基因的引物；所述用免疫检测诊断多发性骨髓瘤的产品包括：与FOXM1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断多发性骨髓瘤的产品包括：与FOXM1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断多发性骨髓瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片，其中蛋白芯片包括与FOXM1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与FOXM1基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述用实时定量PCR诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增FOXM1基因的引物，序列如：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
5.一种用于诊断多发性骨髓瘤的工具，其特征在于所述工具能够检测样本中FOXM1基因的表达。
6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。
7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于所述芯片包括基因芯片或蛋白质芯片，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测FOXM1基因转录水平的针对FOXM1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的FOXM1蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测FOXM1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括FOXM1蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测FOXM1基因转录水平的试纸；所述高通量测序平台包括用于检测FOXM1基因转录水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于所述检测FOXM1基因转录水平的试剂包括针对FOXM1基因的引物和/或探针。
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