CN107058409A - 一种用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法。该方法是以特定益生菌的完整细胞作为生物催化剂，以弱酸性磷酸盐缓冲液作为介质，以天然花青素提取物作为底物，构成生物转化花青素体系。本发明方法条件温和，底物与产物专一，显著简化后续纯化工序，是一种利用微生物对花青素生物转化原儿茶酸的简易策略，且发酵过程不加入其他有机物，降低了对环境的可能污染。转化目标产物的原儿茶酸含量最高可达33mg/L。本发明对体外研究微生物代谢转化花青素的机制具有重要的意义，也为天然花青素转化产物直接应用于益生菌发酵食品提供一种理论依据。

Description

一种用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法和 应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地，涉及一种用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法和应用。

背景技术

原儿茶酸(Protocatechuic acid，PCA)即3,4二羟基苯甲酸，是重要的中药活性成分。国外已有报道天然花青素在猪肠道中转化为小分子代谢物-原儿茶酸。原儿茶酸有许多药理作用，主要为抗菌、抗肿瘤，预防哮喘，促进大鼠皮层神经元增值等药理作用，临床用于治疗慢性气管炎。原儿茶酸目前工业生产主要是由香草醛经碱熔、酸化而得。这种化学合成工艺中酸碱物质会造成一定环境污染压力，也无法直接添加于食品生产。目前制备天然来源原儿茶酸主要来源是从中草药叶茎中通过反复醇提和纯化得到分粉末晶体。现有技术中对天然花青素微生物催化转化原儿茶酸没有一般适用方法。

花青素(Anthocyanidin)是一类广泛地存在于植物中的水溶性天然色素，属于黄酮类化合物，是膳食中最丰富的多酚。其黄酮C6-C3-C6碳结构上有多个酚羟基，具有显著天然抗氧化和清除自由基等活性作用，显示出独特的药理学功效是人们对花青素的关注重点。比如，研究表明紫甘薯提取的花青素具有明显的抗氧化、抗突变、减轻肝功能障碍等生理功能。花青素作为一种安全无毒的天然色素，对人体具有许多保健功能，已被应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。

在体内肠道环境下花青素被肠道中的微生物种群利用，或被菌群分泌的酶系催化转化生成小分子代谢产物如原儿茶酸。然而，其体内转化途径和代谢机制仍不明确，目前构建模拟肠道的模型研究代谢途径仍具有一定复杂性。食品和植物来源的益生菌，除了具有公认的增强免疫作用外，也拥有丰富的酶体系，为探究体外生物转化花青素变成原儿茶酸提供了条件。专利CN201210364142介绍了一种将花色苷作为着色剂添加酸奶中发酵的方法，但没有具体描述花色苷是否被转化为其他组分如原儿茶酸。杨艳(《肠道益生菌生物转化桑椹花青素与应用研究》，江西农业大学，2014：60)报道了肠道微生物和四种益生菌对桑葚花青素的转化，但转化过程在MRS培养基中进行，培养基中复杂的碳源成分对花青素转化的影响较大。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用微生物全细胞催化天然花青素转化制备原儿茶酸的方法。该方法以花青素为碳源，克服了现有化学合成和物理提取制备原儿茶酸技术上的产生污染压力、无法直接添加于食品生产等问题，同时也有利于简化后续的纯化工序。该方法具有步骤简便、底物专一、条件温和的特点，在不引入其他化学与生物营养成分的前提下，可将催化花青素转化为原儿茶酸(PCA)。对体外研究微生物代谢转化花青素的机制具有重要的意义，也对直接应用益生菌转化发酵含花青素食品提供一种理论依据。

本发明另一目的是提供上述用微生物全细胞催化天然花青素的方法转化的原儿茶酸。

本发明再一目的是提供上述原儿茶酸的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法，包括以下具体步骤：

S1.在花青素提取物的培养基中接种微生物培养后，转移微生物培养液至无菌离心管中，离心后弃尽上清，得沉淀为微生物菌体；

S2.加入磷酸盐缓冲液到步骤S1的离心管中，重悬菌体沉淀，制成菌悬液；

S3.花青素提取物用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，将已除菌的花青素提取物添加到步骤S2的菌悬液中混合均匀，将菌悬液置于35～37℃静置培养；

S4.将培养后的菌悬液离心后取出上清液，即为微生物催化天然花青素转化原儿茶酸；

其中，所述的微生物为鼠李糖乳杆菌YYJP-2(L.rhamnosus YYJP-2)，该菌种于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMC C60115；或干酪乳杆菌KFL2(L.casei KFL2)，该菌种于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC60117)。

优选地，步骤S1中所述的花青素提取物的培养基的配方为：花青素提取物1～10％、酪蛋白胨或胰蛋白胨或细菌蛋白胨8～12g/L、牛肉膏8～12g/L、酵母膏或酵母提取物3～5g/L、葡萄糖10～20g/L、吐温801.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L和硫酸锰0.05g/L；所述培养基的pH为5.5～6.0，所述微生物培养的时间为18～24h，所述离心的速率为5000～8000rpm。

优选地，步骤S2中所述的磷酸盐缓冲液包括磷酸二氢钾8.2～8.4g/L和磷酸氢二钾0.7～0.9g/L，所述磷酸盐缓冲液的pH为5.5～5.8；所述菌悬液的浓度>10⁵CFU/mL。

优选地，步骤所S3中所述花青素提取物为紫薯淀粉、新鲜紫薯、紫甘蓝、山竹壳、黑枸杞、桑葚的花青素原料的提取物。

上述花青素提取物的提取工艺为：配制40～80％乙醇溶液，加入浓HCl调节pH为3～4，再加入花青素原材料，花青素原材料和乙醇溶液的质量比为1：(10～40)，在50～60℃条件下超声波辅助提取30～120min，5000rpm离心10min，收集上清液，在压力0.8～0.9MPa和温度60℃条件下真空浓缩，即得到花青素提取物。

优选地，步骤S3中所述的已除菌的花青素提取物与菌悬液的体积比为1:(10～100)。

优选地，步骤S3中所述静置培养的时间为12～48h。

优选地，步骤S4中所述离心的速率为5000～10000rpm，所述离心的时间为10～15min。

上述微生物全细胞催化天然花青素的方法制备的原儿茶酸及其在益生菌发酵食品、添加天然色素的微生物发酵食和含原儿茶酸的特膳食品生产中的应用。

本发明是以弱酸性磷酸盐缓冲液作为转化介质，缓冲液的弱酸性有利于花青素结构稳定；同时弱酸性磷酸盐缓冲液，提供微生物(特别是大部分益生菌)细胞稳定的等渗环境而且不引入多余营养条件下；以益生菌完整细胞提供生物催化所需的酶系，以天然花青素提取浓缩液作为底物共同构成生物转化花青素体系。

全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行化学转化，本质是利用细胞内的酶进行催化。全细胞催化是介于发酵法和提取酶催化法之间的一种生物催化技术。全细胞催化中各酶系保持原有状态和位置，酶稳定性好，更易实现能量和辅酶的原位再生；细胞内可实现多酶体系的级联反应，弥补酶法催化中级联催化过程不易实现，酶活半衰期短等不足，提高了催化效率，省去了酶纯化过程，制备更加简单，生产成本更低，环境压力更小。本发明利用部分无毒可食用的微生物转化天然色素花青素，产物安全具有一定抗氧化性，可直接应用于食品生产中，提高营养效益。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明采用益生菌在弱酸性磷酸盐缓冲液条件下用全细胞催化转化天然花青素并获得原儿茶酸。弱酸性磷酸盐缓冲体系，有利于花青素和菌体的性质稳定，提供了安全无毒的催化条件，并且缓冲体系只含有无机盐，无其他营养成分对花青素转化造成干扰。该方法步骤简便，始终保证了天然色素的安全性和可食用性，可用于添加天然花青素的食品产品的研究和生产。

2.本发明省略了催化酶的提取和酶活保护的步骤，更易实现多酶体系的高效催化。微生物在生物转化前经过筛选和诱导培养，更利于微生物对代谢酶的表达，提高了生物转化率。

3.本发明以花青素为碳源，解决了现有化学合成和物理提取制备原儿茶酸技术上的产生污染压力、无法直接添加于食品生产等问题，同时也有利于后续的纯化工序。

附图说明

图1为实施例1中鼠李糖乳杆菌YYJP-2(GDMCC60115)菌种基因组指纹图谱。

图2为实施例2中鼠李糖乳杆菌YYJP-2(GDMCC60115)菌种基因组指纹图谱。

图3为实施例5中用鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus YYJP-2)催化紫薯花青素转化生成原儿茶酸的HPLC图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

在实施例1-5中：

所述的高效液相色谱检测条件为：进样20μL，波长245nm，流速1mL/min，流动相A：1％甲酸水。流动相B：乙腈。洗脱方法：0～4minA相保持95％；4～16minA相95％降到88％；16～30minA相保持70％；30～35minA相从70％升到95％。

所述总花青素初始浓度的测试采用pH示差法。

实施例1鼠李糖乳杆菌YYJP-2的分离与鉴定

1.菌株分离

(1)鼠李糖乳杆菌YYJP-2(L.rhamnosus YYJP-2)是从传统白酒发酵酒曲分离获得。具体分离方法如下：以无菌蒸馏水充分震荡酒曲得到悬浊液，采用倍比稀释法将上述悬浊液稀释成10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的样液，涂布在MRS平板上培养，2d后挑去取单菌落平板划线法纯化两次，斜面保藏菌种备用。

(2)上述分离得到鼠李糖乳杆菌YYJP-2(L.rhamnosus YYJP-2)属于革兰氏阳性菌，在MRS平板上具有大的、奶油白色、不透明、表面湿润光滑的菌落，在MRS肉汤试管中产生大量粘稠糖类物质，表现为丰富的胞外多糖。

2.菌株鉴定

提取上述分离的菌株基因组DNA，通过常规PCR扩增16S rDNA片段并测序分析，测序结果如SEQ ID NO：1所示。显示其与鼠李糖乳杆菌同源99％以上相似，属于Lactobacillaceae科Lactobacillus属rhamnosus种。

同时，结合其他鉴定数据结果显示，该菌株为鼠李糖乳杆菌菌种的一个新菌株，将该菌株命名为鼠李糖乳杆菌YYJP-2(L.rhamnosus YYJP-2)，2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC60115，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

Rep-PCR指纹图谱是一种揭示菌株和种属遗传差异和多样性的分析技术。原理是利用特定的引物扩增细菌基因组的进化过程中高度保守的短重复序列，得到系列的特定谱带，即细菌基因的指纹图谱，对细菌进行鉴定和多态性研究。对上述分离的菌株基因组DNA进行Rep-PCR扩增得到鼠李糖乳杆菌YYJP-2(GDMCC60115)菌种基因组指纹图谱如图1所示。其中，鼠李糖乳杆菌YYJP-2基因指纹图谱，泳道1为BOX-PCR谱带；泳道2为(GTG)5-PCR谱带；泳道3为Rep-PCR谱带；泳道M为DNAMarker III。从图1中可知，李糖乳杆菌YYJP-2特有的Box-PCR主条带约9条，(GTG)₅-PCR主条带为8～10条，Rep-PCR主条带为7～10条，大小集中在0.3k～4kbp之间，由此指纹图谱可对该鼠李糖乳杆菌YYJP-2进一步鉴定和多态性研究。

实施例2干酪乳杆菌KFL2(L.casei KFL2)的分离与鉴定

1.菌株分离

(1)干酪乳杆菌KFL2(L.casei KFL2)是从传统白酒发酵酒曲分离获得。具体分离方法如下：以无菌蒸馏水充分震荡酒曲得到悬浊液，采用倍比稀释法将上述悬浊液稀释成10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的样液，涂布在MRS平板上培养，2d后挑去取单菌落平板划线法纯化两次，斜面保藏菌种备用。

(2)上述分离得到干酪乳杆菌KFL2(L.casei KFL2)属于革兰氏阳性菌，在MRS平板上具有边缘整齐、白色、不透明、表面光滑的菌落，稍有酸味。

2.菌株鉴定

提取上述分离的菌株基因组DNA，通过常规PCR扩增16S rDNA片段并测序分析，测序结果如SEQ ID NO：2所示，显示其与干酪乳杆菌同源99％相似，Lactobacillaceae科Lactobacillus属L.casei种。

同时，结合其他鉴定数据结果显示，该菌株为干酪乳杆菌菌种的一个新菌株，将该菌株命名为干酪乳杆菌KFL2(L.casei KFL2)，2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC60117，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

对上述分离的菌株基因组DNA进行Rep-PCR扩增得到干酪乳杆菌KFL2(GDMCC60117)菌种基因组指纹图谱如图2所示。其中，泳道1为BOX-PCR 谱带；泳道2为(GTG)5-PCR谱带；泳道3为Rep-PCR谱带；泳道M为DNA Marker III。从图2可知，干酪乳杆菌KFL2特有的Box-PCR主条带约4条，(GTG)₅-PCR主条带为10～12条，Rep-PCR主条带为10～13条，大小集中在0.3k～2.5kbp之间，由此指纹图谱可对该干酪乳杆菌KFL2细菌进一步鉴定和多态性研究。

实施例3

配制pH＝3的60％乙醇溶液1000mL，按料液比1：40加入紫薯淀粉25g，60℃条件下超声波辅助热提取120分钟，10000rpm离心10分钟，收集上清液在压力0.9MPa、温度55℃条件下真空浓缩即可得紫薯天然花青素浓缩液。

取紫薯诱导培养基中的生长对数期的鼠李糖乳杆菌YYJP-2(L.rhamnosus YYJP-2，GDMCC60115)，转移1mL菌液到10mL离心管，离心弃尽上清。用4.9mL的磷酸盐缓冲液(pH＝5.8)重悬菌沉淀，加入0.1mL已用0.2μm微孔滤膜过膜的花青素浓缩液。37℃培养48h取出立即12000rpm离心后取1mL上清，即为微生物催化天然花青素转化原儿茶酸。以pH示差法测总花青素初始浓度20.5mg/L，48h后浓度11.4mg/L，花青素转化原儿茶酸的转化率为44.3％。

实施例4

配制pH＝3的40％乙醇溶液100mL，按料液比1:10加入烘干的山竹壳10g，50℃条件下热提取60分钟，10000rpm离心10分钟，收集上清液在压力0.9MPa、温度50℃条件下真空浓缩，即山竹壳天然花青素提取液。

取含山竹壳提取液的诱导培养基中的生长对数期的酪乳杆菌KFL2(L.caseiKFL2)，转移1mL菌液到10mL离心管，离心弃尽上清。用4.9mL的磷酸盐缓冲液(pH＝5.8)重悬菌沉淀，加入0.1mL已用0.2μm微孔滤膜过膜的花青素浓缩液。37℃培养24h，取出立即12000rpm离心后取1mL上清液，即为微生物催化天然花青素转化原儿茶酸。以pH示差法测总花青素，浓度初始浓度3.53mg/L，24h后浓度2.34mg/L，花青素转化原儿茶酸的的转化率为33.7％。

实施例5

按照上述实施例3中的方法制备天然花青素浓缩液备用。

取紫薯诱导培养基中的生长对数期的鼠李糖乳杆菌YYJP-2(L.rhamnosus YYJP-2，GDMCC60115)，转移1mL菌液到10mL离心管，离心弃尽上清液。用4.9mL的磷酸盐缓冲液(pH＝5.8)重悬菌沉淀，加入0.1mL过膜的花青素浓缩液。CK空白对照组是无菌的4.9mL的磷酸盐缓冲液(pH＝5.8)加入0.1mL已用0.2μm微孔滤膜过膜的花青素浓缩液。37℃培养48h。取出立即12000rpm离心后取1mL上清液，即为微生物催化天然花青素转化原儿茶酸，过膜后-20℃保存备用。

图3为实施例5中的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus YYJP-2)转化紫薯花青素生成原儿茶酸的HPLC图。其中，(a)L.rhaYYJP-2为鼠李糖乳杆菌YYJP-2株(L.rhamnosus YYJP-2)在48h产物中原儿茶酸的信号峰；(b)PCA+CK为原儿茶酸标品混空白对照；(c)CK为空白对照。原儿茶酸标准品的信号峰和鼠李糖乳杆菌YYJP-2产物的信号峰对应保留时间分别17.2min和16.9min，可知为原儿茶酸，根据峰面积计算L.rhaYYJP-2催化紫薯花青素产原儿茶酸的含量为33mg/L。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1433

<212> DNA

<213> Lactobacillus属

<400> 1

CACCGGCTTC GGGTGTTACA AACTCTCATG GTGTGACGGG CGGTGTGTAC AAGGCCCGGG 60

AACGTATTCA CCGCGGCGTG CTGATCCGCG ATTACTAGCG ATTCCGACTT CGTGTAGGCG 120

AGTTGCAGCC TACAGTCCGA ACTGAGAATG GCTTTAAGAG ATTAGCTTGA CCTCGCGGTC 180

TCGCAACTCG TTGTACCATC CATTGTAGCA CGTGTGTAGC CCAGGTCATA AGGGGCATGA 240

TGATTTGACG TCATCCCCAC CTTCCTCCGG TTTGTCACCG GCAGTCTTAC TAGAGTGCCC 300

AACTAAATGC TGGCAACTAG TCATAAGGGT TGCGCTCGTT GCGGGACTTA ACCCAACATC 360

TCACGACACG AGCTGACGAC AACCATGCAC CACCTGTCAT TTTGCCCCCG AAGGGGAAAC 420

CTGATCTCTC AGGTGATCAA AAGATGTCAA GACCTGGTAA GGTTCTTCGC GTTGCTTCGA 480

ATTAAACCAC ATGCTCCACC GCTTGTGCGG GCCCCCGTCA ATTCCTTTGA GTTTCAACCT 540

TGCGGTCGTA CTCCCCAGGC GGAATGCTTA ATGCGTTAGC TGCGGCACTG AAGGGCGGAA 600

ACCCTCCAAC ACCTAGCATT CATCGTTTAC GGCATGGACT ACCAGGGTAT CTAATCCTGT 660

TCGCTACCCA TGCTTTCGAG CCTCAGCGTC AGTTACAGAC CAGACAGCCG CCTTCGCCAC 720

TGGTGTTCTT CCATATATCT ACGCATTTCA CCGCTACACA TGGAGTTCCA CTGTCCTCTT 780

CTGCACTCAA GTTTCCCAGT TTCCGATGCA CTTCCTCGGT TAAGCCGAGG GCTTTCACAT 840

CAGACTTAAA AAACCGCCTG CGCTCGCTTT ACGCCCAATA AATCCGGATA ACGCTTGCCA 900

CCTACGTATT ACCGCGGCTG CTGGCACGTA GTTAGCCGTG GCTTTCTGGT TGGATACCGT 960

CACGCCGACA ACAGTTACTC TGCCGACCAT TCTTCTCCAA CAACAGAGTT TTACGACCCG 1020

AAAGCCTTCT TCACTCACGC GGCGTTGCTC CATCAGACTT GCGTCCATTG TGGAAGATTC 1080

CCTACTGCTG CCTCCCGTAG GAGTTTGGGC CGTGTCTCAG TCCCAATGTG GCCGATCAAC 1140

CTCTCAGTTC GGCTACGTAT CATTGCCTTG GTGAGCCGTT ACCTCACCAA CTAGCTAATA 1200

CGCCGCGGGT CCATCCAAAA GCGATAGCTT ACGCCATCTT TCAGCCAAGA ACCATGCGGT 1260

TCTTGGATTT ATGCGGTATT AGCATCTGTT TCCAAATGTT ATCCCCCACT TAAGGGCAGG 1320

TTACCCACGT GTTACTCACC CGTCCGCCAC TCGTTCAAAA TTAAATCAAG ATGCAAGCAC 1380

CTTTCATATA CATCGTATGA ACTCGTACGA CTGCATGTAG TAGCACGCCG CAC 1433

<210> 2

<211> 1463

<212> DNA

<213> Lactobacillus属

<400> 2

TGCCTATACA TGCAAGTCGA ACGAGTTCTC GTTGATGATC GGTGCTTGCA CCGAGATTCA 60

ACATGGAACG AGTGGCGGAC GGGTGAGTAA CACGTGGGTA ACCTGCCCTT AAGTGGGGGA 120

TAACATTTGG AAACAGATGC TAATACCGCA TAGATCCAAG AACCGCATGG TTCTTGGCTG 180

AAAGATGGCG TAAGCTATCG CTTTTGGATG GACCCGCGGC GTATTAGCTA GTTGGTGAGG 240

TAATGGCTCA CCAAGGCGAT GATACGTAGC CGAACTGAGA GGTTGATCGG CCACATTGGG 300

ACTGAGACAC GGCCCAAACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAG GGAATCTTCC ACAATGGACG 360

CAAGTCTGAT GGAGCAACGC CGCGTGAGTG AAGAAGGCTT TCGGGTCGTA AAACTCTGTT 420

GTTGGAGAAG AATGGTCGGC AGAGTAACTG TTGTCGGCGT GACGGTATCC AACCAGAAAG 480

CCACGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTATCCGGAT 540

TTATTGGGCG TAAAGCGAGC GCAGGCGGTT TTTTAAGTCT GATGTGAAAG CCCTCGGCTT 600

AACCGAGGAA GCGCATCGGA AACTGGGAAA CTTGAGTGCA GAAGAGGACA GTGGAACTCC 660

ATGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGATATATG GAAGAACACC AGTGGCGAAG GCGGCTGTCT 720

GGTCTGTAAC TGACGCTGAG GCTCGAAAGC ATGGGTAGCG AACAGGATTA GATACCCTGG 780

TAGTCCATGC CGTAAACGAT GAATGCTAGG TGTTGGAGGG TTTCCGCCCT TCAGTGCCGC 840

AGCTAACGCA TTAAGCATTC CGCCTGGGGA GTACGACCGC AAGGTTGAAA CTCAAAGGAA 900

TTGACGGGGG CCCGCACAaG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA TTCGAAGCaA CGCGAAGAAC 960

CTTACCAGGT CTTGACATCT TTTGATCACC TGAGAGATCA GGTTTCCCCT TCGGGGGCAA 1020

AATGACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG 1080

CAACGAGCGC AACCCTTATG ACTAGTTGCC AGCATTTAGT TGGGCACTCT AGTAAGACTG 1140

CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGACCTG 1200

GGCTACACAC GTGCTACAAT GGATGGTACA ACGAGTTGCG AGACCGCGAG GTCAAGCTAA 1260

TCTCTTAAAG CCATTCTCAG TTCGGACTGT AGGCTGCAAC TCGCCTACAC GAAGTCGGAA 1320

TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCACGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC 1380

GCCCGTCACA CCATGAGAGT TTGTAACACC CGAAGCCGGT GGCGTAACCC TTTTAGGGAG 1440

CGAGCCGTCT AAGTGACAAA TGG 1463

Claims (10)

1.一种用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

S1.在花青素提取物的培养基中接种微生物培养后，转移微生物培养液至无菌离心管中，离心后弃尽上清，得沉淀为微生物菌体；

S2.加入磷酸盐缓冲液到步骤S1的离心管中，重悬菌体沉淀，制成菌悬液；

S3.花青素提取物用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，将已除菌的花青素提取物添加到步骤S2的菌悬液中混合均匀，将菌悬液置于35～37℃静置培养；

S4.将培养后的菌悬液离心后取出上清液，即为微生物催化天然花青素转化原儿茶酸；

其中，所述的微生物为鼠李糖乳杆菌YYJP-2(L.rhamnosus YYJP-2)，该菌种于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMC C60115；或干酪乳杆菌KFL2(L.casei KFL2)，该菌种于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC60117。

2.根据权利要求1所述的用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法，其特征在于，步骤S1中所述的花青素提取物的培养基的配方为：花青素提取物1～10％、酪蛋白胨或胰蛋白胨或细菌蛋白胨8～12g/L、牛肉膏8～12g/L、酵母膏或酵母提取物3～5g/L、葡萄糖10～20g/L、吐温801.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L和硫酸锰0.05g/L；所述培养基的pH为5.5～6.0，所述微生物培养的时间为18～24h，所述离心的速率为5000～8000rpm。

3.根据权利要求1所述的用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法，其特征在于，步骤S2中所述的磷酸盐缓冲液包括磷酸二氢钾8.2～8.4g/L和磷酸氢二钾0.7～0.9g/L，所述磷酸盐缓冲液的pH为5.5～5.8；所述菌悬液的浓度>10⁵CFU/mL。

4.根据权利要求1所述的用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法，其特征在于，步骤所S3中所述花青素提取物为紫薯淀粉、新鲜紫薯、紫甘蓝、山竹壳、黑枸杞、桑葚的花青素原料的提取物。

5.根据权利要求4所述的用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法，其特征在于，所述花青素提取物的提取工艺为：配制40～80％乙醇溶液，加入浓HCl调节pH为3～4，再加入花青素原材料，花青素原材料和乙醇溶液的质量比为1：(10～40)，在50～60℃条件下超声波辅助提取30～120min，5000rpm离心10min，收集上清液，在压力0.8～0.9Mpa和温度60℃条件下真空浓缩，即得到花青素提取物。

6.根据权利要求1所述的用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法，其特征在于，步骤S3中所述的已除菌的花青素提取物与菌悬液的体积比为1:(10～100)。

7.根据权利要求1所述的用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法，其特征在于，步骤S3中所述静置培养的时间为12～48h。

8.根据权利要求1所述的用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法，其特征在于，步骤S4中所述离心的速率为5000～10000rpm，所述离心的时间为10～15min。

9.一种由权利要求1-8任一项所述用微生物全细胞催化天然花青素的方法转化的原儿茶酸。

10.权利要求9所述的原儿茶酸在益生菌发酵食品、添加天然色素的微生物发酵食和含原儿茶酸的特膳食品的生产中的应用。