CN107058268A - 一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法，包括以下步骤：玉米芯粉碎制玉米芯粉、玉米芯粉的酸处理、玉米芯粉的碱处理，最终得到的碱处理玉米芯粉即为用作木霉生产纤维素酶的诱导物。此外，本发明还提供了一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物在木霉生产纤维素酶中的应用。本发明制备出的用作木霉生产纤维素酶诱导物以玉米芯为原料，分别采用酸处理和碱处理后将其应用于发酵产酶培养基中，能够诱导木霉产生大量的纤维素酶，尤其是能够提高滤纸酶的产量，从而提高了木霉的产纤维素酶的能力，降低生产成本，具有广泛的应用前景。

Description

一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法其及应用。
背景技术
纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中成药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸和生物能源等工业应用上具有重要地位。利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇，可以避免对粮食作物的大量损耗，引起了各国政府和研究机构的重视。
纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌、真菌等都能产生纤维素酶，目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，研究得较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中丝状真菌中的木霉属(包括里氏木霉、康氏木霉及绿色木霉等)是目前发现的对纤维素降解最有效的种属之一。目前用于产纤维素酶的诱导物主要有微晶纤维素、滤纸、羧甲基纤维素钠、玉米芯等，但是利用这些产纤维素酶诱导物制备出的纤维素酶的活性低，对天然木质素的分解能力弱、生产周期长以及价格昂贵，严重的制约了其工业化应用。
发明内容
本发明提供了一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法，解决了现有技术中产纤维素酶诱导物制备出的纤维素酶的活性低，对天然木质素的分解能力弱、生产周期长以及价格昂贵，严重的制约其工业化应用的问题。
本发明的第一个目的是提供一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将玉米芯粉碎后过筛，得到玉米芯粉；
步骤2，将步骤1中得到的玉米芯粉与稀H2SO4溶液按照1g：10～15mL的比例混合，然后以250～300r/min的速度搅拌15～30min，搅拌完毕后静置10～30min，得到玉米芯粉的酸处理混合物，将玉米芯粉的酸处理混合物在85～95℃下保温2h，保温结束后采用滤膜过滤，得到的滤饼用水洗至中性，得到酸处理玉米芯粉；
步骤3，将步骤2中得到的酸处理玉米芯粉与NaOH溶液按照1g：10～15mL的比例混合后置于55～65℃的水浴中保温3～5h，保温结束后趁热采用滤膜过滤，得到的滤饼先用质量百分比浓度为0.3～0.6％的NaOH溶液洗至洗脱液为无色，再用水洗至中性，得到碱处理玉米芯粉，将碱处理玉米芯粉烘干至含水率≤10％，即得到所述用作木霉生产纤维素酶的诱导物。
优选的，所述步骤1中玉米芯粉碎后过40目筛。
优选的，所述步骤2中所用稀H2SO4的体积百分比浓度为0.3～0.6％。
优选的，所述步骤2、所述步骤3中所用滤膜孔径均为0.45μm。
优选的，所述步骤3中所用NaOH溶液的质量百分比浓度为0.3～0.6％。
本发明的第二个目的是提供一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物在木霉生产纤维素酶中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明用作木霉生产纤维素酶的诱导物以玉米芯为原料，分别采用酸处理和碱处理后将其应用于发酵产酶培养基中，能够诱导木霉产生大量的纤维素酶，尤其是能够提高滤纸酶的量，从而提高木霉的产纤维素酶能力，降低了生产成本，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中所用里氏木霉菌购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，下述各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用试剂如无特殊说明，均为常规试剂。
实施例1
一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将玉米芯粉碎后过40目筛，得到玉米芯粉；
步骤2，将步骤1中得到的玉米芯粉与体积百分比浓度为0.5％的稀H2SO4溶液按照1g：10mL的比例混合，然后以250r/min的速度搅拌15min，搅拌完毕后静置30min，得到玉米芯粉的酸处理混合物，将玉米芯粉的酸处理混合物在90℃下保温2h，保温结束后过0.45μm滤膜，得到的滤饼用水洗至中性，得到酸处理玉米芯粉；
步骤3，将步骤2中得到的酸处理玉米芯粉与质量百分比浓度为0.5％的NaOH溶液按照1g：10mL的比例混合后置于60℃的水浴中保温3h，保温结束后趁热过0.45μm滤膜，得到的滤饼首先用质量百分比浓度为0.5％的NaOH溶液洗至洗脱液为无色，再用水洗至中性，得到碱处理玉米芯粉，将碱处理玉米芯粉烘干至含水率为3％，即得到用作木霉生产纤维素酶的诱导物。
实施例2
一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法,包括以下步骤：
步骤1，将玉米芯粉碎后过40目筛，得到玉米芯粉；
步骤2，将步骤1中得到的玉米芯粉与体积百分比浓度为0.3％的稀H2SO4溶液按照1g：12mL的比例混合，然后以280r/min的速度搅拌20min，搅拌完毕后静置20min，得到玉米芯粉的酸处理混合物，将玉米芯粉的酸处理混合物在85℃下保温2h，保温结束后过0.45μm滤膜，得到的滤饼用水洗至中性，得到酸处理玉米芯粉；
步骤3，将步骤2中得到的酸处理玉米芯粉与质量百分比浓度为0.3％的NaOH溶液按照1g：12mL的比例混合后置于55℃的水浴中保温4h，保温结束后趁热过0.45μm滤膜，得到的滤饼首先用质量百分比浓度为0.3％的NaOH溶液洗至洗脱液为无色，再用水洗至中性，得到碱处理玉米芯粉，将碱处理玉米芯粉烘干至含水率为5％，即得到用作木霉生产纤维素酶的诱导物。
实施例3
一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法,包括以下步骤：
步骤1，将玉米芯粉碎后过40目筛，得到玉米芯粉；
步骤2，将步骤1中得到的玉米芯粉与体积百分比浓度为0.6％的稀H2SO4溶液按照1g：15mL的比例混合，然后以300r/min的速度搅拌30min，搅拌完毕后静置10min，得到玉米芯粉的酸处理混合物，将玉米芯粉的酸处理混合物在95℃下保温2h，保温结束后过0.45μm滤膜，得到的滤饼用水洗至中性，得到酸处理玉米芯粉；
步骤3，将步骤2中得到的酸处理玉米芯粉与质量百分比浓度为0.6％的NaOH溶液按照1g：15mL的比例混合后置于65℃的水浴中保温5h，保温结束后趁热过0.45μm滤膜，得到的滤饼首先用质量百分比浓度为0.6％的NaOH溶液洗至洗脱液为无色，再用水洗至中性，得到碱处理玉米芯粉，将碱处理玉米芯粉烘干至含水率为8％，即得到用作木霉生产纤维素酶的诱导物。
实施例1～3均制备出了性能良好的用作木霉生产纤维素酶的诱导物，为了说明实施例1～3制备出的用作木霉生产纤维素酶的诱导物的效果，下面仅以实施例1制备出的用作木霉生产纤维素酶的诱导物在木霉生产纤维素酶中的使用效果进行说明，具体试验步骤如下：
1、活化菌种：配制PDA培养基，采用中间点种的方式在PDA培养基中接种里氏木霉菌，然后于28℃斜面接种培养48h，得到新鲜种子斜面；
2、用灭菌后的接种环将新鲜种子斜面上的孢子洗下来，制成浓度为1×107个/mL的孢子悬液，按照5％的接种量将孢子接种至含有45mL液体发酵产酶培养基的250mL锥形瓶中，在转动速度为180r/min、温度为28℃的条件下培养72h，培养结束后收集发酵滤液，并将发酵滤液以12000r/min的转速离心5min，取上清液作为待测酶液，然后测定待测酶液中纤维素酶的酶活力大小；
其中，每升液体发酵产酶培养基由下述组分组成：8g麸皮、2g实施例1制备出的用作木霉生产纤维素酶的诱导物、2g的KH2PO4、1.6mg的MnSO4、4.9g蛋白胨、0.3g的CaCl2、5mg的FeSO4·7H2O、1.7mg的ZnCl2、0.3g的MgSO4、2.0mg的CoCl2，余量为去离子水，pH为5.5；
3、羧甲基纤维素酶(CMC)活力的测定
取4支洁净干燥的20mL的酶解管，按照0、1、2、3的顺序将其标号，往每支酶解管中均加入1.5mLpH为5.0的羧甲基纤维素钠醋酸缓冲液，将0号酶解管作为空白对照，向其中加入0.5m待测酶液，煮沸10min，使其失活后再往其中加入1.5mL的DNS溶液，然后于50℃水浴中同时预热四支酶解管5min，再将除空白对照之外的三只酶解管均加入0.5mL待测酶液，将四只酶解管均置于50℃的水浴锅里加热30min，取出后趁热向四支酶解管中分别加入1.5mL的DNS溶液来阻止酶的继续反应，加入DNS溶液后将四支酶解管充分摇匀后沸水浴5min，取出后在冰上使温度降至室温后用蒸馏水定容至20mL，然后将空白对照作为对照调节零点，用分光光度计在540nm波长下测定各酶解管中液体的OD值，记录实验结果；
4、纤维素滤纸酶活力(FPA)的测定
取4支洁净干燥的20mL的酶解管，按照0、1、2、3的顺序将其标号后均加入1.5mL的pH为4.6的醋酸缓冲液，将0号酶解管作为空白对照，向其中加入0.5mL的离心后的待测酶液，煮沸10min使其失活后加入1.5mL的DNS溶液；在50℃水浴中同时预热四支酶解管5min，将除对照之外的三只管均加入离心后的待测酶液0.5mL后，再分别加入大小为1×6cm的烘干的滤纸条，将四只酶解管都放在50℃的水浴锅里水浴60min，取出后趁热向除空白对照之外的3只酶解管中分别加入DNS溶液1.5mL来阻止酶的继续反应，加入DNS溶液后将四支酶解管充分摇匀后沸水浴10min，取出后在冰上降低温度至室温后用蒸馏水定容至20mL，然后将空白对照作为对照调节零点，用分光光度计在540nm波长下测定各酶解管中液体的OD值，记录实验结果。
通过检测得出，羧甲基纤维素酶活力最大可达到118.06U/mL，滤纸酶活力最大可达到152.72U/mL，而使用未经处理的玉米芯作为木霉生产纤维素酶的诱导物时，得到的羧甲基纤维素酶活力最大仅为98.08U/mL，滤纸酶活力最大仅为110.54U/mL，由此可见，利用本发明的制备方法处理过的玉米芯作为诱导物时，得到的羧甲基纤维素酶的活力提高了20.37％，滤纸酶的活力提高了38.2％；滤纸酶酶活占总酶活比例由原来52.99％增加到56.40％，说明本发明制备出的用作木霉生产纤维素酶的诱导物具备优异的诱导效果，不仅提高总酶活，也提高了滤纸酶活的比例。
纤维素酶是滤纸酶、羧甲基纤维素酶和β-糖苷酶等几种酶的总称，这几种酶共同酶解纤维素原料，它们的比例分配是评价酶制剂最关键的因素，适宜的比例是酶制剂能够发挥最佳效率的关键，也是生产酶制剂的最佳经济效益的基础，其中滤纸酶是较难提高产量的一种酶，获得产酶微生物产生更多的滤纸酶，是纤维素酶制剂的关键。本发明获得的产酶诱导物能够诱导更高的滤纸酶和更适宜的酶比例。
本发明制备的诱导物本质上是一种玉米芯纤维素，当发酵产酶培养基里碳源缺乏时，它作为唯一碳源能够诱导木霉产生大量的纤维素酶，尤其是能够提高滤纸酶的量。市售的结晶纤维素常用作木霉纤维素酶诱导物，其价格十分昂贵，本发明制备的诱导物可以替代结晶纤维素，且价格仅为结晶纤维素价格的30％，这使工业化大规模降低纤维素酶生产成本成为可能。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例1-3相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将玉米芯粉碎后过筛，得到玉米芯粉；
步骤2，将步骤1中得到的玉米芯粉与稀H2SO4溶液按照1g：10～15mL的比例混合，然后以250～300r/min的速度搅拌15～30min，搅拌完毕后静置10～30min，得到玉米芯粉的酸处理混合物，将玉米芯粉的酸处理混合物在85～95℃下保温2h，保温结束后采用滤膜过滤，得到的滤饼用水洗至中性，得到酸处理玉米芯粉；
步骤3，将步骤2中得到的酸处理玉米芯粉与NaOH溶液按照1g：10～15mL的比例混合后置于55～65℃的水浴中保温3～5h，保温结束后趁热采用滤膜过滤，得到的滤饼先用质量百分比浓度为0.3～0.6％的NaOH溶液洗至洗脱液为无色，再用水洗至中性，得到碱处理玉米芯粉，将碱处理玉米芯粉烘干至含水率≤10％，即得到所述用作木霉生产纤维素酶的诱导物。
2.根据权利要求1所述的用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法，其特征在于，所述步骤1中玉米芯粉碎后过40目筛。
3.根据权利要求1所述的用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法，其特征在于，所述步骤2中所用稀H2SO4的体积百分比浓度为0.3～0.6％。
4.根据权利要求1所述的用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法，其特征在于，所述步骤2、所述步骤3中所用滤膜孔径均为0.45μm。
5.根据权利要求1所述的用作木霉生产纤维素酶的诱导物的制备方法，其特征在于，所述步骤3中所用NaOH溶液的质量百分比浓度为0.3～0.6％。
6.根据权利要求1所述方法制备出的用作木霉生产纤维素酶的诱导物在木霉生产纤维素酶中的应用。
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