CN107058262A - 用于从淀粉植物的可溶部分获得β‑淀粉酶制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于从淀粉植物的可溶部分获得β‑淀粉酶制剂的方法，其特征在于淀粉植物的可溶部分是选自下组，该组由以下各项组成：小麦、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻、大麦、黑麦、荞麦、马铃薯以及甘薯，并且优选小麦和大麦的可溶部分，以这样一种方式进行所述可溶部分的澄清以从中除去不溶物质和胶体，以及任选地，以这样一种方式进行所述澄清的可溶部分的超滤以获得含有浓缩的β‑淀粉酶和超滤渗透物的超滤渗余物，渗滤所述含有浓缩的β‑淀粉酶的超滤渗余物并且回收生成的β‑淀粉酶。

Description

用于从淀粉植物的可溶部分获得β-淀粉酶制剂的方法
本申请为国际申请日2010年3月30日、国际申请号PCT/FR2010/050596于2011年9月30日进入中国国家阶段、申请号201080014957.1、发明名称“用于从淀粉植物的可溶部分获得β-淀粉酶制剂的方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种用于从来自淀粉工业的残渣获得β-淀粉酶制剂的方法。
背景技术
β-淀粉酶是从(α1→4)-连接的葡萄糖聚合物或低聚物的非还原端释放麦芽糖单元的外水解酶，该反应在遇到的第一个α1→6分支点处停止。
在发芽(谷类种子人工发芽)期间，“糖化力”的主要组分(对应于α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和脱支酶的结合活性)、以及从这种酶合剂(enzyme cocktail)中分离的β-淀粉酶活性对于生产麦芽糖或产生自淀粉的其他可发酵糖而言是必需的。
如此获得的麦芽糖和其他可发酵糖旨在用于，例如，经由酵母的乙醇发酵。
因此，仅仅β-淀粉酶的糖化活性并用于大量的应用中：
-在面包制作中，
-在麦芽工业中，
-作为一种食品添加剂，或甚至作为一种“消化”剂，
-用于生产麦芽糖和富含麦芽糖的糖浆(麦芽糖醇的前体和麦芽糖醇糖浆)，
-用于生产增甜剂，
-在药学中，用于生产疫苗。
谷类的β-淀粉酶、豆类的β-淀粉酶和块茎的β-淀粉酶关于它们的酶活性都是类似的。
然而，作为用于麦芽工业、或用于其他生物技术方法的β-淀粉酶的来源，一些淀粉植物优先于其他淀粉植物的事实取决于它们的种子关于β-淀粉酶的丰富度，并且取决于从这些富含多种酶活性的介质中可以分离它们的容易程度。
因此，清楚地鉴定了两种提取β-淀粉酶的来源。
第一种提取“常规的”β-淀粉酶的来源是小麦、大麦或黑麦的胚乳，这是已知用于主要生产大量β-淀粉酶的一种来源。
提取的第二种来源相应于人工发芽的种子。因此特别是β-淀粉酶的一种人工富集是通过引起发芽来进行的；然后使β-淀粉酶活性与其他淀粉酶和葡萄糖苷酶活性一起过表达。
本发明涉及的技术领域是提取的第一种来源，使得有可能像这样更有效地以更大的量生产β-淀粉酶。本发明的技术领域还涉及从淀粉工业中的植物加工所生成的残余可溶部分，这些植物如小麦、大麦、黑麦、玉米、高粱、荞麦、水稻、豌豆、蚕豆、马蚕豆、马铃薯、木薯、甘薯或魔芋。β-淀粉酶的第二种来源更具体地旨在用于制备酶合剂。
本领域的技术人员已经接受未发芽的大麦、黑麦或小麦种子都是用于大规模商业制备β-淀粉酶的生物材料的选择。
此外，本领域的技术人员还已知，可以从未发芽的大麦、小麦或黑麦种子中提取的一半的β-淀粉酶可以容易地通过用水和盐溶液提取以游离酶的形式获得。
另一半部分处于“结合”形式，对于它的提取需要添加还原剂或蛋白酶。
不可以直接提取的另一种β-淀粉酶部分被称为“潜在的”部分，也已经被描述：为了从谷类种子中将它提取，洗涤剂是必需的。
而且，根据预期的应用将描述于现有技术中的β-淀粉酶提取方法进行了调整。
更具体地，旨在用于淀粉糖化和用于实验测试的那些淀粉酶是集中地从植物来源(如大豆、小麦、大麦、燕麦、黑麦和甘薯)中提取的，或者是通过微生物(如多粘芽孢杆菌等)来生产的。
在由淀粉制备麦芽糖的情况下，第一种束缚是要尽可能限制其他低聚糖(如葡萄糖和麦芽三糖)的伴随性产生。第二种束缚在于使用一种基本不含有真菌毒素、盐和低分子量蛋白质和肽(小于50kDa并且优选小于30kDa)，并且不会引起过敏的(具体是通过在制备方法中重亚硫酸盐的缺乏)的β-淀粉酶制剂，以允许富含麦芽糖的糖浆的迅速并且容易的纯化(过滤、脱色、脱矿质)以及获得更稳定的糖浆。
在麦芽工业中，例如，已知葡萄糖的存在通过抑制酵母生长而干扰酵母它们的发酵。
为了从麦芽糖糖浆商业生产麦芽糖醇，推荐的是要限制山梨醇和麦芽三糖醇的产生。
因此，本领域的技术人员将优选使得有可能获得尽可能纯的β-淀粉酶制剂的方法。当然这些方法将具有昂贵的缺点。
因此专利US 3 492 203描述了从麸皮中提取纯的β-淀粉酶用于制备富含麦芽糖的糖浆。
因此避免了从麦芽(还含有难于从β-淀粉酶中分离的α-淀粉酶)开始的方法。
那么麸皮具有较价廉的优点，并且作为培养基是可回收的，但是特别选择它是因为它的占优势的β-淀粉酶含量。
该方法在于这种情况：在20℃与40℃之间的温度下用水提取纯的β-淀粉酶。
然而，这一方法使得有可能从麸皮中仅仅有效地回收一半的可获得的β-淀粉酶。
而且，这种方法的主要缺点是它提供了一种细菌学不稳定的β-淀粉酶：因此，生产的β-淀粉酶必须即时用于糖化淀粉。未进行巴斯德灭菌。
在专利US 3 801 462中，β-淀粉酶是从甘薯，更具体地是从在锉磨甘薯的步骤之后的洗涤水中提取的。
该实际的提取方法由在pH 4-4.5的处理以及处于沉淀物形式的β-淀粉酶的回收组成。当温度被调整至55℃时提取率更高。
然而，α-淀粉酶和麦芽糖酶活性仍污染这个富集β-淀粉酶的部分，这当然使得获得一种纯的制剂变得复杂。
专利US 4 675 296提出了通过一种用水提取的方法(在5℃与50℃之间的温度，持续5至70h)用于制备商品β-淀粉酶的一种方法，但是这需要从完整的或部分脱壳的大麦粒开始。
所述方法是难于实现的，因为它是基于使用谷粒的表面作为一种会阻留所述谷粒的除了β-淀粉酶之外的所有组分的半透膜。
然而，添加一种还原剂以促进β-淀粉酶的释放是有用的，所述还原剂是基于二氧化硫或硫酸的。
而且，推荐用盐、多元醇、糖或酸来稳定该酶。
在文献中的其他方法推荐使用酶以促进β-淀粉酶的提取。
因此在国际专利申请WO 02/062980中，在具有纤维素酶、半纤维素酶和β-葡聚糖酶活性的多种酶的复方合剂的存在的条件下，在一种水性介质中从谷类提取了β-淀粉酶。所获得的提取物必须被精细地纯化以分离因此从反应混合物中回收的β-淀粉酶。
选择的谷类是大麦和小麦。
在还原条件下(含有亚硫酸盐的水)，以明确定义的比例，在清楚设定的温度和反应时间范围的条件下，并且在pH 6.5下进行提取。
在US 3 769 168中，富集β-淀粉酶的提取物的纯化途径是优选的。
用一种膨润土或高岭土型吸附剂处理从麸皮、从大豆或从甘薯制备的粗提取物。
吸附这些β-淀粉酶然后使用一种具有大于0.5μ的离子强度以及超过5的pH值的溶液洗脱。
根据上述内容，对于提供一种简单并且相对价廉的用于获得β-淀粉酶制剂的方法仍有未满足的需要，这些制剂具有足够的质量以允许特别是富含麦芽糖的糖浆的有效生产。
因此，本发明的目的是要满足这一需要，并且值得称道的是，在很多研究之后，本申请公司已经发现这一目标可以针对所有预期而达到，只要使用来自淀粉工业的残渣，特别是来自淀粉工业的液体残渣(也称为“可溶部分”，虽然它们仍然含有不同且多样的残余不溶物质、颗粒以及胶体)。
发明内容
本发明涉及一种从淀粉植物的组分(淀粉、蛋白质以及纤维)的湿法提取期间产生的液体残渣(也称为“可溶部分”，虽然它们还含有不同且多样的残余不溶物质、颗粒以及胶体)获得β-淀粉酶制剂的方法。
为了本发明的目的，术语“淀粉植物”旨在表示在淀粉工业中能够被加工的为了从其中提取淀粉的植物，如特别是玉米、马铃薯、甘薯、小麦、水稻、豌豆、蚕豆、马蚕豆、木薯、高粱、魔芋、黑麦、荞麦以及大麦。在一个具体的实施方案中，这些“淀粉植物”包括玉米、马铃薯、小麦、水稻、豌豆、蚕豆、马蚕豆、木薯、高粱、魔芋以及大麦。
本发明还涉及所述方法，该方法包括可溶部分的澄清的一个第一步骤、以及然后任选地一个超滤的第二步骤从而获得关于β-淀粉酶的纯化的(从不含有它的盐的意义而言)和/或浓缩的制剂。在一个优选的实施方案中，本发明还涉及所述方法，该方法包括可溶部分的澄清的一个第一步骤、一个超滤的第二步骤、以及然后一个渗滤的第三步骤从而获得关于β-淀粉酶的纯化(从它被排除盐的意义而言)且浓缩的制剂。
最后，本发明使得有可能提供一种β-淀粉酶制剂，它具有一种质量这样有可能以与纯化的β-淀粉酶相同的方式来使用它，特别是用于生产富含麦芽糖的糖浆。
更具体地，用于获得根据本发明的β-淀粉酶制剂的方法在于选择是β-淀粉酶的来源的介质、在于澄清所述介质、进而任选地在于进行超滤以回收或甚至浓缩它们所包含的β-淀粉酶，这些介质来自下组，该组由以下各项组成：小麦、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻、大麦、黑麦、荞麦、甘薯以及马铃薯的可溶部分，优选小麦、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻、大麦以及马铃薯的可溶部分，更优选小麦和大麦的可溶部分。
优选地，用于获得根据本发明的β-淀粉酶制剂的方法在于选择是β-淀粉酶的来源的介质、在于澄清所述介质、进而在于进行超滤和渗滤以回收并且浓缩它们所包含的β-淀粉酶，这些介质来自下组，该组由以下各项组成：小麦、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻、大麦、黑麦、荞麦、马铃薯以及甘薯的可溶部分，优选小麦和大麦的可溶部分。在用于获得根据本发明的β-淀粉酶制剂的方法中，不进行pH值校正，该pH值天然地约为4.5。
值得称道的是，本申请公司已经发现，来自在除了发酵(作为氮源)的领域或动物营养(与产生自小麦的产物混合)的领域之外的领域中的开发很差的淀粉工业的这些残渣可以构成一种选择的介质，用于以足以用于目标应用(例如制备富含麦芽糖的糖浆)的质量水平来容易地提取感兴趣的酶(并且更具体是β-淀粉酶)。
根据本发明的方法的特征在于：
a)淀粉植物的可溶部分是选自下组，该组由以下各项组成：小麦、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻、大麦、黑麦、荞麦、甘薯以及马铃薯，优选小麦、马铃薯、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻以及大麦，并且更优选小麦和大麦的可溶部分，
b)以这样一种方式进行所述可溶部分的澄清，以从中除去不溶物质和胶体，
c)任选地，以这样一种方式进行所述澄清的可溶部分的超滤，以获得含有浓缩的β-淀粉酶和超滤渗透物的超滤渗余物，
d)回收生成的浓缩的β-淀粉酶。
优选地，根据本发明的方法的特征在于：
a)淀粉植物的可溶部分是选自下组，该组由以下各项组成：小麦、马铃薯、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻、大麦、黑麦、荞麦以及甘薯，并且优选小麦和大麦的可溶部分，
b)以这样一种方式进行所述可溶部分的澄清，以从中特别地除去不溶物质、胶体和微生物材料，
c)以这样一种方式进行所述澄清的可溶部分的超滤，以获得含有浓缩的β-淀粉酶和超滤渗透物的超滤渗余物(也称为滤液)，
d)进行含有浓缩的β-淀粉酶的所述超滤渗余物的渗滤，
e)回收生成的浓缩的β-淀粉酶。
该超滤渗透物还可以与步骤b)的不溶物质和胶体混合。
因此根据本发明的方法只涉及物理提取技术的组合，例如过滤或离心技术，并且并不涉及任何酶提取步骤。因此不需要含有纤维素酶、半纤维素酶和/或β-葡聚糖酶的酶合剂。也不需要进行pH校正。
根据本发明的方法的第一步骤在于选择淀粉植物的可溶部分，这些可溶部分来自下组，该组由以下各项组成：小麦、马铃薯、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻、大麦、黑麦、荞麦以及甘薯，优选小麦、马铃薯、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻以及大麦，并且更优选小麦和大麦的可溶部分。
在本发明中，术语“可溶部分”旨在表示在淀粉植物的贵重组分的湿法提取期间所产生的残留水。术语“贵重组分”在这里旨在表示在常规淀粉工业(并且特别是根据该淀粉植物)中开发的组分：淀粉(无论它是哪一种淀粉)、蛋白质、纤维、胶质。因此根据本发明的所述可溶部分不包括，或基本不包括这些贵重组分。出于这个原因，这些可溶部分也称为残留水或可替代地称为液体残余物。
小麦的可溶部分或小麦可溶物，例如源自在湿小麦淀粉工业方法中，从淀粉的分离产生的小麦“B”淀粉分离流。B-淀粉或第二淀粉是实质上由优势比例的小淀粉颗粒或损坏的颗粒组成的淀粉。根据本发明，由淀粉精炼水组成的小麦可溶物通常具有5％的干物质，特别是小于8％的干物质。
通过回收在淀粉提取的开始从块茎破碎所产生的可溶部分而获得马铃薯、甘薯或木薯的可溶部分，或马铃薯、甘薯或木薯可溶物。
豌豆的可溶部分或豌豆可溶物从豌豆浸渍水产生并且是在破碎和分离不同的豌豆组分之前回收的。
蚕豆的可溶部分或蚕豆可溶物从蚕豆浸渍水产生并且是在破碎和分离不同的蚕豆组分之前回收的。
马蚕豆的可溶部分或马蚕豆可溶物从马蚕豆浸渍水产生并且是在破碎和分离不同的马蚕豆组分之前回收的。
水稻的可溶部分或水稻可溶物从水稻浸渍水产生并且是在破碎和分离不同的水稻组分之前回收的。
大麦、黑麦或荞麦的可溶部分，或大麦、黑麦或荞麦可溶物从“B”-淀粉分离流产生，该分离流从在大麦淀粉工业方法中的淀粉分离产生。B-淀粉或第二淀粉是实质上由优势比例的小淀粉颗粒或损坏的颗粒组成的淀粉。
这些可溶部分还含有高分子量蛋白质，其中的一些具有感兴趣的酶活性，但是它们与所有类型的不溶碎片(特别是纤维、痕量的淀粉、等)、胶体物质(特别是磷脂、糖蛋白、胚乳的外层细胞(也称为糊粉层)、等)以及微生物材料(微生物、细菌、等)相混杂。
本申请公司确实面临直到现在所描述的现有技术的偏见，这些可溶部分由本领域的技术人员仅仅使用在具有低附加值的两个应用领域中：
-一种在发酵中的氮源，在蛋白酶处理之后，已经使残余高分子量蛋白组分可被微生物同化，
-家畜动物的营养源，并且进一步与纤维物质(例如在小麦可溶物的情况下的麸皮)一起添加。
因此根据本发明的方法的第二个步骤在于以这样一种方式进行所述可溶部分的澄清的步骤，以从中除去不溶物质和胶体。
通过在每次进行了处理之后测量溶液的浊度来验证这一澄清步骤。
浊度表示就使它浑浊的物质而言的液体的含量。它是由吸收、散射和/或反射光的胶体颗粒引起的。
使用实验室比浊计(或浊度计)进行浊度测量。
这一方法被标准化(NF EN ISO 7027)；使用福尔马肼的两个浊度测量单位作为标准品。
-FNU(福尔马肼浊度单位)，或NFU被使用于2001年12月20日的法令号2001-1220中。这种单位度量了在波长860nm处在90°的角度的浊度。
-FAU(福尔马肼衰减单位)度量透射光(180°)。
环境保护局(EPA-USA)推荐的浊度单位是NTU(比浊法浊度单位)。该测量是在以90°散射的但是在不同于860nm的波长下的光中进行的。
关于酶活性的测量，它在于测定糖化淀粉酶(diastase)活性，是一种常规用于测定大麦芽或其他酶制剂的淀粉酶活性的测量(参考文章DIASTASE ACTIVITY-DIASTATICPOWER-Food Chemical Codex 6的General Tests and Assay/Appendix部分V/pp 1117-1118)。
糖化淀粉酶活性表示为糖化力的度数(°DP)，定义为当在20℃下将所述样品置于100ml的底物中持续1h时，足以还原5ml的费林液体(Fehling liquor)的包含在0.5ml 5％酶制剂的样品溶液中的酶的量。
由于糖化力使得有可能测量所有淀粉酶类型的酶活性，本申请公司借助其他的更特异的酶法(例如使用对于α-淀粉酶特异的Megazyme测定试剂盒，由Ceralpha Method销售)证实根据本发明的β-淀粉酶制剂不含有其他污染活性。
同样地，如同将要在下文中例证的那样，在实验室中使用根据本发明的酶制剂的糖化作用测试显示出高麦芽糖含量，而没有任何葡萄糖的显著存在。
可以以三种不同的方式来进行根据本发明的方法的澄清的该第一个步骤：
1)在根据本发明的方法的一个第一实施方案中，这些可溶部分的澄清是借助于选自下组的技术通过过滤来进行的，该组由以下各项组成：前置过滤、加压过滤以及真空过滤。
开始的可溶部分具有高浊度，不能测量给予它们高负载的胶体颗粒和剩余不溶物的该浊度。
在使用加压过滤器的情况下，使这些可溶部分通过这个预加载有微晶纤维素的过滤器。根据所使用的纤维素的类型，出自该过滤器的产物于是具有约20至60NTU的浊度。
在真空过滤的情况下，本申请公司推荐使用带式过滤器或旋转滤器进行过滤。
例如，使用在真空下的预加载有一层纤维素的预备层过滤器。
2)在根据本发明的方法的一个第二实施方案中，这些可溶部分的澄清是通过离心来进行的。
根据离心沉淀的流速和浓度，来自该可溶物的离心的上清液于是也具有20至60NTU的浊度(离心机的加速度越高，存在于该上清液中的产物的浊度就越低)。
更具体地，本申请公司推荐使用以下设备进行这个离心步骤：
-一台N47自动清洗或喷嘴分离器型盘式离心机，或
-一台BTUX高性能涡旋喷嘴分离器型盘式离心机(这两种类型的离心机NA7或BTUX分别由Westfalia和AlfaLaval公司销售)。
但是任选地在离心之后，为了尽可能减少可溶部分的加载，可能是有用的是进行一个额外的“安全”过滤。所选择的过滤器是一台水平板式加压过滤器。
该过滤器加载有具有细粒度的纤维素的一个预备层。
于是将过滤的这些可溶部分加入(通过用纤维素或多或少地大量注满)。
该滤液的浊度因此下降到在5与10NTU之间的一个值。
3)在根据本发明的方法的一个第三实施方案中，可溶部分的澄清是通过切向膜过滤来进行的。
更具体地，本申请公司推荐通过用多层膜(例如陶瓷膜，具有从0.1至1μm的孔隙率)的切向微孔过滤来进行该膜过滤。
在这种情况下的渗透物有利地具有一个约0NTU的浊度。
然而，这种技术会导致吸附到这些膜上的β-淀粉酶的损失。然而，相对于最初存在于这些可溶部分中的量，这个损失是可以忽略的。
根据本发明的方法的这个澄清步骤可以由这三种实施方案中的任何一种组成(过滤、离心或切向膜过滤)，或者由这三种实施方案中的两种或三种的任何组合组成。
任选地，可以在这个澄清步骤之前通过任何本领域的技术人员已知的技术进行一个絮凝这些胶体颗粒的步骤，而且，如同将在下文举例说明。
为了得到一种不含有污染性残余盐的制剂并且浓缩所述关于β-淀粉酶的制剂，以这样一种方式进行所述澄清的可溶部分的超滤以获得含有β-淀粉酶和一种超滤渗透物的超滤渗余物。然后以这样一种方式以恒定的体积透析该超滤渗余物以降低在所述渗余物中杂质的浓度。
更具体地，本申请公司推荐使用具有从10 000Da至50 000Da的截断阈值(优选具有30 000Da(也用30kDa表示)的截断阈值)的膜进行该超滤。
在配备有在盒式超滤器(cassette)中的实验室规模的具有30 000Da截断阈值的聚磺酸化膜(polysulfonated membrane)以及中试规模(pilot scale)的具有30 000Da截断阈值的聚磺酸化螺旋膜的模块上超滤这些可溶部分。
随着体积浓缩因子(VCF)的增加，在该渗余物中的酶变得浓缩。
对于十升的定量测定为22°DP/ml的起始溶液，对于VCF为5时，获得两升110°DP/ml的渗余物和八升不具有糖化力的渗透物。
依照根据本发明的方法，以恒定的体积渗滤该超滤渗余物。这是因为具有高纯度的大分子的获得需要实行这样一个渗滤步骤以便使得不被膜阻留的溶质从该超滤渗余物中去除(通过稀释和渗透)。
根据本发明的方法的最后步骤可以在于将该超滤渗透物与步骤b)的不溶物和胶体混合。使这种混合物与来自淀粉工业的未处理的可溶部分再结合。
如将被举例说明的那样，并且令人惊讶和出乎意料地的是，如此制备的制剂具有这样一种品质，使得有可能照原样作为旨在用于制备富含麦芽糖糖浆的酶的来源而使用它，无需额外的处理。
具体实施方式
实例1：从小麦可溶物中获得一种β-淀粉酶的第一制剂-实验室规模
在从小麦制造淀粉的过程中，在可溶物蒸发器的入口处收集了60升的可溶部分，在浓缩后按惯例进行用于家畜饲料的一个步骤，由本申请公司以名称销售。
这些可溶部分具有的pH值为4并且β-淀粉酶活性为约25°DP/ml。
在一台由Westfalia公司销售的SA1除渣式盘式离心机中，以40升/小时的流速离心这些60升的可溶部分。
从离心回收45升的上清液。测量的浊度为60NTU。
然后在一台56cm2的Choquenet实验室箱板过滤器(chamber sheet filter)、一台预加载有Clar-O-Cel 13/6(CECA)和Vitacel L10(J.Rettenmaier und )纤维素的布过滤器上将它们过滤。
用这些纤维素以1g/l的速率还进行连续注满。
回收40升具有8NTU的浊度和22°DP/ml的β-淀粉酶活性的滤液。
然后在具有多层0.18m2的膜的微孔实验室模块上将该滤液进行超滤。
回收39.5升的超滤滤液以及在因子为75的情况下的浓缩的渗余物，具有在1500与1600°DP/ml之间的β-淀粉酶活性。
用2.5倍体积的水以这样一种方式以恒定的体积连续透析该超滤渗余物，使得在因子为10的情况下降低这些可溶物的杂质的浓度。
然后在+4℃下储存生成的β-淀粉酶制剂。
实例2：从小麦可溶物获得一种β-淀粉酶的第一制剂-用絮凝剂的实验室规模
在从小麦制造淀粉的过程中，在可溶物蒸发器的入口处收集了pH值为4.3的120升的可溶部分。
然后用20ppm的Fe3+和25ppm的聚合Flopam AN 923 PWG阴离子絮凝剂(SNF)以这样一种方式将它们进行处理以絮凝这些不溶性颗粒和胶体颗粒。
然后在实例1的条件下以40升/小时的流速离心如此处理的这些可溶部分。
获得90升的如此离心的可溶部分。它们具有约17NTU的浊度以及21°DP/ml的β-淀粉酶活性。
以与实例1相同的方式，使这个部分在一台箱板过滤器上经受精滤。
获得80升的具有5NTU浊度的过滤溶液。
然后在具有0.18m2的具有30kDa的截断阈值的膜的微孔实验室模块上进行超滤。
回收79升的超滤滤液以及在因子为80的情况下的浓缩的渗余物，具有在1500与1600°DP/ml之间的β-淀粉酶活性。
用2.5倍体积的水以这样一种方式以恒定的体积连续透析该超滤渗余物，使得在因子为10的情况下降低这些可溶物的杂质的浓度。
然后在+4℃下储存生成的β-淀粉酶制剂。
实例3：从小麦可溶物中获得一种β-淀粉酶的第一制剂-中试规模
中试由在其中如实例2中收集和制备的10m3的小麦可溶部分的测试组成。
通过在一台NA7离心机上以自净操作方式离心，去除这些不溶颗粒和胶体颗粒。
回收7m3的具有22NTU的浊度的上清液。
随后在一台加载有预定义的纤维素的0.3m2AMAFILTER过滤器上通过前置过滤对这种上清液进行过滤。用1g/l的纤维素将其注满。
一经过滤，该溶液具有5NTU的浊度。
在一台由具有30kDa的截断阈值的聚磺酸化螺旋膜组成的设备上进行超滤。
于是获得了75升的在因子约为95的情况下浓缩的并且具有约2000°DP/ml的β-淀粉酶活性的渗余物。
用2.5倍体积的水以这样一种方式以恒定的体积连续透析该超滤渗余物，使得在因子为10的情况下降低这些可溶物的杂质的浓度。
为了使酶稳定，加入50kg由本申请公司以商标销售的、含有99.5％的干物质的山梨糖醇粉末。
最终的制剂具有1550°DP/ml的β-淀粉酶活性。
实例4：从大麦可溶物中获得β-淀粉酶制剂
将100kg的大麦粉和72升的水加入到一台捏合机中从而获得一种硬面团。
在环境温度下静置30分钟之后，在由本申请公司制造的旋转筛中以逆流的方式用水洗涤该面团，从而将淀粉从麸质中分离出。
收集200升的淀粉悬浮液，并且在一个100μm的第一振动筛上进行筛分，然后在63μm的第二振动筛上进行筛分，以去除纤维、胶质以及残余麸质。
然后在一台在名称SEDICANTER下以商标FLOTTWEG销售的沉降式离心机上以高流速(200l/h)以这样一种方式离心该滤液，以分离在浓缩物中的A-淀粉(大颗粒)和在上清液中的B-淀粉(小颗粒)。
在SA1盘式除渣式分离机(WESTFALIA)上以减小的流速(40l/h)以这样一种方式再次离心B-淀粉悬浮液溢流，以分离在浓缩物中的B-淀粉以及在上清液中的可溶部分。pH值为4.5。
所有这些现有步骤使得有可能获得一种根据本发明的可溶部分，即不含有贵重组分，特别是不含有淀粉(无论它是哪一种淀粉)、蛋白质、纤维和胶质。取60升的具有120NTU的浊度的所述可溶部分。
根据实例号2的絮凝方法处理该可溶部分。
在一台前述的除渣离心机上以40l/h的流速进行离心，并且回收40升的具有28°DP/ml的β-淀粉酶活性和21NTU的浊度的可溶部分。
在一台预加载有Clar-O-Cel 13/6(CECA)和Vitacel L10(J.Rettenmaier und)纤维素的箱板过滤器上将这个可溶部分进行过滤。
用1g/l的纤维素将该可溶部分注满。
获得40升具有6NTU的浊度和27°DP/ml的β-淀粉酶活性的滤液。
如在实例2中所述，在一台具有0.18m2的30KDa膜的微孔实验室模块上进行超滤。
在约为65的因子的情况下进行浓缩。
最后获得0.6升的具有1700°DP/ml的β-淀粉酶活性的浓缩酶溶液。
用2.5倍体积的水以这样一种方式以恒定的体积连续透析该超滤渗余物，使得在因子为10的情况下降低这些可溶物的杂质的浓度。
用400g的由本申请公司以商标销售的、含有99.5％的干物质的山梨糖醇粉末来将其稳定化。
于是该酶制剂具有1400°DP/ml的β-淀粉酶活性。
实例5：获得富含麦芽糖的糖浆，使用商购的纯化β-淀粉酶作为对照
a)单独通过β-淀粉酶的作用获得麦芽糖糖浆
在实验室中使用从GENENCOR公司(OPTIMALT BBA)商购的纯化β-淀粉酶以及使用根据实例1制备的依照本发明的β-淀粉酶制剂进行糖化的比较。
将处于4‰的浓度的β-淀粉酶(基于干淀粉的商购的酶)添加到一种含有30％的干物质的液化淀粉的溶液中，该溶液具有为6的葡萄糖当量水平(具有DE 6的麦芽糊精的溶出度)。
有意调高该剂量以检测可能存在的寄生酶活性(parasitic enzymaticactivity)。
在58℃的温度和pH值5的条件下进行该反应24小时。
该结果表示为由β-淀粉酶作用产生的葡萄糖单体和低聚物的％，低聚物具有等于2以及更大的聚合度(通过钠型高压液相色谱法测定)。
DP2对应于麦芽糖，DP1对应于葡萄糖并且DP3对应于麦芽三糖。
这些结果证明，根据本发明的β-淀粉酶制剂可以有效地代替商购的β-淀粉酶。
b)在实验室中，通过与支链淀粉酶和麦芽糖生产酶(maltogenase)结合的β-淀粉酶制剂的作用获得了一种富含麦芽糖的糖浆
在以上条件下进行这些测试，其区别在于，2种酶是随着该β-淀粉酶制剂的添加而同时添加的。
它们是特异性地水解淀粉的α1→6键的由ABM公司销售的支链淀粉酶、以及特异性地水解α1→4键的由NOVOZYMES公司在名称下销售的生麦芽糖α-淀粉酶。
这些酶也是以4‰的比例添加的(基于干淀粉的商购酶)。
作为对照，一种源自麦芽提取物的β-淀粉酶制剂(＝主要由β-淀粉酶组成的多种酶的合剂)被用作β-淀粉酶来源。
同时使用纯化的β-淀粉酶与使用根据本发明的β-淀粉酶制剂所获得的碳水化合物特征曲线是等效的，由此证明了根据本发明的所述制剂的优异行为，使用麦芽提取物所获得的碳水化合物特征曲线产生了高得多的葡萄糖含量。
c)通过工业规模的与支链淀粉酶和麦芽糖生产酶结合的β-淀粉酶制剂的作用而获得了一种富含麦芽糖的糖浆
实例号3的制剂被用来进行工业测试。
糖化是在200m3的含有30％的干物质的液化淀粉溶液上进行的，该溶液具有为6的葡萄糖当量水平。在以下条件下同时添加β-淀粉酶制剂(1‰，基于干基重)、支链淀粉酶以及麦芽糖生产酶：pH值5，55℃。
在66小时后获得以下结果(表示为产生的％DP-通过钠HPPLC进行测量)：
DP>3 DP3 DP2 DP1
6 1.1 88.3 4.3
可以纯化、氢化和结晶这种富含麦芽糖的糖浆，从而获得具有与通过常规途径所获得的那些品质相同的麦芽糖醇。
d)通过超滤的和渗滤的β-淀粉酶制剂的作用而获得麦芽糖糖浆
在实验室中使用根据实例1制备的依照本发明的β-淀粉酶制剂(实例1的β-淀粉酶)，并且使用根据实例1澄清的但不经受超滤和渗滤步骤的β-淀粉酶制剂(未经UF的β-淀粉酶)进行了糖化作用的比较。
对于用“实例1的β-淀粉酶”制剂的糖化作用，将4‰(基于干淀粉的商购酶)浓度的所述“实例1的β-淀粉酶”制剂添加到一种含有30％的干物质的液化淀粉的溶液中，该溶液具有为6的葡萄糖当量水平(具有DE 6的麦芽糊精的溶出度)。于是该酶制剂具有1.8°DP/ml的β-淀粉酶活性。在58℃的温度和pH值5的条件下进行该反应24h。
对于用“未经UF的β-淀粉酶”制剂的糖化作用，取1L的实例1的8NTU的滤液(既没有超滤也没有渗滤的滤液)。稀释所述8NTU的滤液至1/15th从而获得浓度为1.8°DP/ml的β-淀粉酶。将pH值调至5。取700ml的所述稀释滤液并且添加300g的具有DE 6的麦芽糊精。在58℃的温度下进行该反应24h。
获得以下结果(表示为产生的％DP-通过钠HPPLC进行测量)：
这些结果证明，未超滤和未渗滤的β-淀粉酶制剂(未经UF的β-淀粉酶)使得有可能获得一种含有2.2％的葡萄糖的富含麦芽糖的糖浆。不像“实例1的β-淀粉酶”制剂(获得的含有0.4％葡萄糖的富含麦芽糖的糖浆)，因此“未经UF的β-淀粉酶”制剂被酶杂质污染。
为了评估使用两种制剂(“实例1的β-淀粉酶”和“未经UF的β-淀粉酶”)而获得的富含麦芽糖的糖浆的纯度(特别是它们的含盐量)，在一台来自Millipore公司的具有1μm孔隙率的盘式过滤器上过滤这些糖浆之后，在20℃的条件下测量了所述糖浆的传导性(由Mettler公司销售的CDM210仪器)。
结果如下：
传导性(μS)
未经UF的β-淀粉酶 200
实例1的β-淀粉酶 20
与借助“未经UF的β-淀粉酶”制剂获得的富含麦芽糖的糖浆相比，超滤和渗滤的制剂(“实例1的β-淀粉酶”)使得有可能获得含盐量低得多的富含麦芽糖的糖浆。因此，与借助“实例1的β-淀粉酶”制剂获得的糖浆相比，借助“未经UF的β-淀粉酶”制剂获得的糖浆的纯化(过滤、脱色、脱矿质)将是更困难的。

Claims (7)

1.一种用于从淀粉植物的可溶部分获得β-淀粉酶制剂的方法，其特征在于：
a)淀粉植物的可溶部分是选自下组，该组由以下各项组成：小麦、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻、大麦、黑麦、荞麦、甘薯以及马铃薯，并且优选小麦和大麦的可溶部分，其中所述可溶部分是在淀粉植物的贵重组分的湿法提取期间所产生的残留水，
b)以这样一种方式进行所述可溶部分的澄清，以从中除去不溶物质和胶体，其中该澄清是通过过滤和离心来进行的，
c)以这样一种方式进行所述澄清的可溶部分的超滤，以获得含有浓缩的β-淀粉酶和超滤渗透物的超滤渗余物，其中该超滤是使用具有从10 000Da至50 000Da、优选具有30000Da的截断阈值的膜来进行的，
d)对含有浓缩的β-淀粉酶的所述超滤渗余物进行渗滤，以及
e)回收生成的浓缩的β-淀粉酶，
其中，所述方法不包括沉淀β-淀粉酶的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于该过滤是通过选自下组的技术来进行的，该组由以下各项组成：前置过滤、加压过滤以及真空过滤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于该真空过滤是使用带式过滤器或旋转过滤器来进行的。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于该离心是使用自净型或喷嘴分离器型盘式离心机、或高性能涡旋喷嘴分离器型盘式离心机来进行的。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于该过滤是通过切向膜过滤来进行的。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于该切向膜过滤是一种具有在0.1与1μm之间的截断阈值的微孔过滤。
7.根据如权利要求1至6的任何一项所述的方法获得的β-淀粉酶制剂用于制备富含麦芽糖的糖浆的用途。
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