CN107043812B - 一种基于焦磷酸测序检测双位点snp的方法 - Google Patents

一种基于焦磷酸测序检测双位点snp的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，该方法基于SNP位点之间的差异，设计对应的引物进行扩增后进行检测，可同时对两个SNP位点进行焦磷酸测序。本发明提供的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法可以同时检测两个SNP位点，随机成功率高，节约了一倍的人力物力，且结果可视化、准确率高，降低了检测成本，满足了临床上双位点同时检测的需要，也为未来多位点的焦磷酸测序检测SNP检测奠定了理论基础，具有良好的推广价值。

Description

一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法
技术领域
本发明涉及一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，属于单核苷酸多态性检测领域。
背景技术
单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是最为常见的一种遗传多态性，占所有已知多态性的的90％以上。现有公共数据库中已经报道了超过900万个SNP位点。开展SNP研究对遗传学、医学、药物开发与合理用药、临床诊断、法医学的发展均具有十分重要的意义。作为第三代遗传标记，SNP具有稳定遗传、高密度、容易规模化和自动化分析等前两代遗传标记无可比拟的优点。SNP分型检测工作，已成为当前国际上研究的热点。近年来，SNP检测方法和相关仪器的研发进展很快。目前，进行SNP分型检测的基本方法已达20余种。各种SNP分型检测方法可看成由等位基因特异性识别的原理方法和等位基因识别产物的分析检测两部分组成。等位基因特异性识别原理有引物延伸反应原理、序列杂交反应原理、酶连接反应原理、酶切割反应原理等；等位基因分析检测手段有质谱、荧光共振和偏振信号检测、化学发光检测、生物传感器检测等。为了提高方法的特异性和灵敏度，绝大多数的基因分型方法都需要对目标检测序列片段进行PCR扩增从而增加检测靶标分子的数目。等位基因识别反应在溶液中更为稳定，但在固相载体上捕获反应产物能够使大量检测平行进行，从而极大提高分析的通量。虽然两个部分操作可以在一定的条件下同时进行，但是为了提高检测的精确性和灵敏度，大多数的分型方法都将两个操作过程分离进行。
焦磷酸测序(preosequencing)技术是近年来发展起来的一种新的DNA序列分析技术，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。是一个理想的遗传分析技术平台，既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核苷酸多态性(SNP)检测及等位基因频率测定等，该项技术目前已被广泛应用于医学生物等各个领域。
焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine 5’phosphosulfate，APS)和荧光素。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。在每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化ASP和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，其高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。根据加入dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。在实验过程中用α-硫化的三磷酸腺苷(dATPαS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合酶利用，而不被虫荧光素识别。由于SpdATPαS可以降低dATPαS降解产物的浓度，近年来，单链DNA结合蛋白(single starnd DNA binding portein，SSBP)和纯化SpisomerdATPaS的使用dATPαS降解产物抑制双磷酸酶活性的这一问题得到较好解决，使得测序长度可达10bp，拓展了该技术在遗传学领域的应用范围。
由于单核苷酸位点多，一段表达蛋白的基因上可能存在多个SNP位点，但由于现有的SNP位点检测手段的限制，SNP位点检测均为单一检测，即各位点需要单独扩增后进行测序，无法在一个体系中对多个SNP位点同时进行检测。中国专利CN 10249166 B公开了一种利用人工熔点标签序列对待测SNP进行标记，实现了在一个单管中检测多个SNP位点，该方法采用荧光探针或熔点的差异来区分各SNP位点的基因型。该方法虽然可以实现在同一反应体系中检测多个SNP位点，但该方法制备样品复杂，制备过程繁琐，对反应温度的要求非常高，检测结果对反应体系的依赖度过高，检测所需仪器及试剂昂贵，提高了使用者的经济负担，不适合大规模推广使用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种利用焦磷酸测序的方法实现在同一检测体系中检测两个SNP位点的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，具体包括以下步骤：
a、将待检测DNA序列进行扩增、分离，其中待检测DNA序列为稳定的DNA单链；
b、将分离后的待测DNA单链样品加入反应体系，且同时加入双位点SNP对应的引物，经所述引物启动互补链扩增，且分别经焦磷酸测序检测与待测DNA单链互补碱基序列以确定待测SNP位点；
其中，所述对应不同位点的引物对应同一待测DNA序列的两个待测SNP位点的扩增起始端至SNP位点的碱基序列至少有n碱基不同或距SNP位点的距离不同，n≥1。
为了保证测序工作的正常进行，待测DNA序列需为稳定的DNA单链，不能稳定维持单链状态的DNA，如会配对形成发夹结构的DNA序列，链内自配对或待测链之间配对的DNA序列无法采用本发明中的检测方法进行测序。
作为一种优选的实施方式，对应不同位点的引物对应同一待测DNA序列的两个待测SNP位点的扩增起始端至SNP位点的碱基序列至少有1个或2个碱基不同或距SNP位点的距离不同。
至少1个碱基的不同可以保证最后的检测结果中对两个SNP位点进行区分，换言之，检测基于碱基之间的种类及位置差异对待测SNP位点进行区分，理论上1个碱基的差异即可实现，2个或2个以上碱基的不同可起到保证结果准确性的作用。
当两段检测片段中自检测起始位点至SNP位点的碱基的种类及排列方式均一样时，需通过不同的检测起始点来对两段SNP片段进行区分，起始点的选择方式在此不做赘述，可以实现本发明中双位点检测的选择方式均认为是可行的。
优选地，扩增起始位点为两个SNP位点的5’端，或两个SNP位点的3’端，或一个SNP位点的5’端与另一个SNP位点的3’端。
两段SNP位点在检测中的检测方向并不需要完全一致，只要被检测的序列之间有差异可以进行本发明中的双位点检测即可。
优选地，SNP位点为SNP位点或SNP位点互补链的配对碱基。
SNP位点根据其特征及不同位点之间的差异，位点本身的变化情况是已知的，换言之，检测结果的范围是已知的，本发明中的双位点SNP检测方法是基于单个SNP位点检测的效率低消耗大出发，根据SNP位点之间的差异进行设计检测，任何可以帮助实现双位点检测的设计方式均认为是可行的，包括上述的改变检测起始点、选择不同检测方向等，另一种优选的实施方式是可以选择SNP位点互补链进行检测，通过互补链的结果可以逆向得出SNP位点结果。
当SNP位点的两条链碱基均发生突变的极端情况时，检测方式不限，对两条链均进行SNP检测也是可行的。
优选地，同一体系中的两个SNP位点为同一段基因上的两个SNP位点。
优选地，同一体系中的两个SNP位点为两段基因上的单个SNP位点。
对于SNP位点的来源本发明不做限制，待测SNP位点可以为同一段基因上的双位点SNP，也可以是不同DNA片段的基因。
当SNP位点的数量大于两个时，本发明中的检测方法在可以设计出检测探针的情况下，仍可以进行SNP检测。
本发明采用焦磷酸测序的方法进行SNP双位点检测，优选的焦磷酸测序使用焦磷酸测序仪，测序仪包括样品区、反应区和检测区，所述样品区包括可旋转的分离盘，所述分离盘位于反应区的上方，所述分离盘包括至少一个DNA分离区，所述分离区包括内部设有滤膜的中空的过滤柱，连有亲和连接体的DNA单链和未连接亲和连接体的DNA单链经所述滤膜过滤后分离；所述反应区包括加样部和样品槽，所述加样部包括dNTP试剂槽、加样针架和安装于其上的多个加样针，所述分离盘位于试剂槽的侧上方；所述加样针架位于样品槽上；所述样品槽上设有多个槽位；所述检测区包括生物发光检测装置，所述槽位与生物发光检测装置连接；所述样品区、反应区和检测区安装在分析台上，所述分析台的侧面设有用于操作的机械手。
作为上述技术方案的进一步改进：
优选地，滤膜设于过滤柱的一端。换言之，滤膜构成了过滤柱的底端，DNA分离区的过滤面设于分离柱底，也就是说分离后的单链DNA在滤膜上。
进一步，作为一种优选的实施方式，过滤柱的外径等于收集管的内径，通过摩擦力可使过滤柱与收集管保持在一个相对稳定的状态，不需要外加结构为过滤柱进行限位固定。
另一种优选的方式，所述分离盘设有多个收集管，所述过滤柱安装于收集管中，所述滤膜位于过滤柱的非端部。
进一步，所述滤膜为高分子纳米微球结构，所述高分子纳米微球间的孔径小于亲和连接体的直径。
进一步，所述收集管设有可拆卸的上盖，所述上盖通过连接带与收集管连接。
分离后的单链DNA在滤膜上为连接有亲合体的单链，需要该条链可对滤膜进行洗脱，滤液中含有不带亲和连接体的另一条互补链，需要反向测序时可对滤液内的单链DNA进行收集。当需要收集滤膜上的带亲和连接体的一条链的时候，收集管可采用回收的收集管，此时收集管仅起到回收废液的作用，回收使用降低成本，并且环保减少白色污染的产生。
优选地，所述试剂槽设有多个反应位，所述试剂槽的侧下方设有底物供给部，所述底物供给部通过输送管道向反应位输送dNTP的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种核酸底物。
优选地，所述加样针架为圆盘形，所述加样针架通过移动部可沿试剂槽和样品槽之间做往复运动；所述加样针架通过转轴做旋转运动。
优选地，所述移动部包括通过安装架固定在分析台上方的滑轨以及所述加样针架底端的滑块。
优选地，所述转轴设有驱动电机。
优选地，所述加样针为实心针，所述加样针固定于加样针架的通孔中。
优选地，所述加样部还包括干燥槽和清洗槽。
优选地，所述槽位沿样品槽的圆心呈一系列同心圆均匀排列，所述槽位由透明材质构成，所述槽位延伸入生物发光检测装置。
优选地，所述生物发光检测装置包括固定壳和相机，所述相机可旋转的位于固定壳中，所述相机位于所有槽位围设的中轴线上，相机通过旋转可以拍摄所有槽位中的反应情况。
与现有技术相比，本发明采用的双位点SNP检测方法，根据SNP位点特异性地设计底物的添加顺序，保证了检测的准确性，采用焦磷酸测序方法，不仅节约底物及酶系的用量，还提高了检测效率，特异性的引物添加方式减化了检测过程，针对性的降低了dNTP的用量，大大节约了成本。
总之，本发明提供的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法可以同时检测两个SNP位点，随机成功率高，节约了一倍的人力物力，且结果可视化、准确率高，降低了检测成本，满足了临床上双位点同时检测的需要，也为未来多位点的焦磷酸测序检测SNP检测奠定了理论基础，具有良好的推广价值。
附图说明
图1是本发明提供的一种实施例的焦磷酸测序检测结果图。
图2是本发明提供的一种实施例的焦磷酸测序检测结果图。
图3是本发明提供的一种实施例的焦磷酸测序检测结果图。
图4是本发明提供的一种实施例的焦磷酸测序检测结果图。
图5是本发明提供的一种实施例的焦磷酸测序检测结果图。
图6是本发明提供的一种实施例的焦磷酸测序检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。
本实施例以同一段DNA片段上的2个SNP位点为例进行双位点SNP检测，检测过程采用焦磷酸测序的方式进行，实施例中未详细说明的扩增及测序步骤可参照现有技术进行，本领域普通技术人员根据其已掌握的知识均可以得到本实施例中的步骤及结果，故在此不做赘述。
本实施例以ApoE基因为例，人ApoE基因用于表达载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)，载脂蛋白E是血浆中重要的载脂蛋白之一。ApoE主要在肝脏合成、分泌和代谢，参与脂质的运输、储存及排泄，有修复组织、抑制血小板聚集、免疫调节等作用。ApoE编码胆固醇代谢的关键载脂蛋E，通过调控和加速Aβ蛋白代谢、以及直接通过ApoE受体调控脑部脂质代谢和突触功能，在阿尔茨海默病的发病中起到重要作用。根据ApoE表型提出ApoE基因模型，认为ApoE的合成是由位于一个基因位点上的三个等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三种杂合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六种常见表型。ApoE3/3型又称野生型。ApoE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交换决定了异构体的种类。ApoE4在这两个位置上都是Arg；E2都是Cys；112位为Cys和158位是Arg者为ApoE3异构体。
实施例1
图1至6为ApoE基因的6种等位基因SNP的焦磷酸测序结果，本实施例中连接了扩增位点的ApoE4基因序列如SEQ ID NO:1所示。ApoE基因在整段基因上有两个SNP位点，因此采用本发明中所述的焦磷酸测序检测双位点SNP时，即为同时对ApoE基因一条链上的两个SNP位点进行检测，具体过程如下：
(1)ApoE基因样本的获取及扩增过程参考现有技术，其中ApoE基因5’端引物为带生物素标记的引物，序列如SEQ ID NO:2所示；3’端引物为不带生物素的引物，序列如SEQID NO:3所示；
(2)纯化单链样本，采用DNA单链分离器，先进行碱解后对单链DNA进行分离，生物素为30μm的微球，单链分离器滤膜孔径为10μm，过滤后滤膜上方留有带生物素标记的DNA单链，洗脱收集DNA单链样本；
本实施例中的DNA单链分离器的过滤柱滤膜设于过滤柱底端，也就是说分离柱仅具有一个腔室，单链DNA经过滤膜，过滤后的滤膜上方留有带生物素标记的DNA单链，在过滤柱内加入洗脱收集液，轻柔反复吹打后吸出，得到DNA单链。
(3)选择该ApoE基因的互补链进行反向焦磷酸测序，112位点的SNP为待测链1，158位点的SNP为待测链2，待测链1的测序起始位点为SNP位点的前一个碱基序列，待测链2的测序起始位点为SNP位点；
(4)如图4所示，按序加入dNTP，与待测链1及待测链2进行反应，dNTP的加入顺序已提前根据两段SNP序列的特征进行设计，以保证检测结果的单一对应；本实施例中具体顺序如下：
加入dGTP时，待测链2配对后单链延伸，待测链1由于不碱基不配对，故待测链1封闭未延伸，检测出一倍发光，证明待测链2碱基为C；
加入dATP，待测链1和2均不配对不延伸，检测无发光；
加入dCTP，待测链1与待测链2均碱基配对后延伸，检测2倍发光，证明待测链1和待测链2的碱基均为G；
加入dGTP，待测链1和2均不配对不延伸，检测无发光；
加入dATP时，待测链1配对后单链延伸，待测链2由于不碱基不配对，故待测链2封闭未延伸，检测出一倍发光，证明待测链1碱基为T；
加入dCTP，待测链1配对后单链延伸，待测链2由于不碱基不配对，故待测链2封闭未延伸，检测出一倍发光，证明待测链1碱基为G；
加入dTTP，待测链2的两个碱基相同，均在碱基配对后延伸，检测2倍发光，证明待测链2的碱基为AA；
综上，待测链1的序列为GTG，T为SNP位点；待测链2的序列为CGAA，C为SNP位点。
实施例2
本实施例中连接了扩增位点的ApoE6基因序列如SEQ ID NO:1所示。具体检测过程如下：
(1)ApoE基因样本的获取及扩增过程参考现有技术，其中ApoE基因5’端引物为带生物素标记的引物，序列如SEQ ID NO:2所示；3’端引物为不带生物素的引物，序列如SEQID NO:3所示；
(2)纯化单链样本，采用DNA单链分离器，先进行碱解后对单链DNA进行分离，生物素为30μm的微球，单链分离器滤膜孔径为10μm，过滤后滤膜上方留有带生物素标记的DNA单链，洗脱收集DNA单链样本；
本实施例中的DNA单链分离器的过滤柱滤膜设于过滤柱的非端面，也就是说分离柱具有两个腔室，单链DNA经过滤膜，过滤后的滤膜上方留有带生物素标记的DNA单链，将过滤柱两头调转，带生物素标记的DNA单链位于滤膜下方，在过滤柱内加入洗脱收集液，离心后即可得到DNA单链。
(3)选择该ApoE基因的互补链进行反向焦磷酸测序，112位点的SNP为待测链1，158位点的SNP为待测链2，待测链1的测序起始位点为SNP位点的前一个碱基序列，待测链2的测序起始位点为SNP位点；
(4)如图6所示，按序加入dNTP，与待测链1及待测链2进行反应，dNTP的加入顺序已提前根据两段SNP序列的特征进行设计，以保证检测结果的单一对应；本实施例中具体顺序如下：
加入dGTP时，待测链2配对后单链延伸，待测链1由于不碱基不配对，故待测链1封闭未延伸，检测出一倍发光，证明待测链2碱基为C；
加入dATP，待测链1和2均不配对不延伸，检测无发光；
加入dCTP，待测链1与待测链2均碱基配对后延伸，检测2倍发光，证明待测链1和待测链2的碱基均为G；
加入dGTP，待测链1配对后单链延伸，检测出一倍发光，待测链2由于不碱基不配对，故待测链2封闭未延伸，证明待测链1碱基为C；
加入dATP时，待测链1与待测链2均不延伸不发光；
加入dCTP，待测链1配对后单链延伸，待测链2由于不碱基不配对，故待测链2封闭未延伸，检测出一倍发光，证明待测链1碱基为G；
加入dTTP，待测链2的两个碱基相同，均在碱基配对后延伸，检测2倍发光，证明待测链2的碱基为AA；
综上，待测链1的序列为GCG，C为SNP位点；待测链2的序列为CGAA，C为SNP位点。
根据焦磷酸测序的原理，采用本发明中方法所述的双位点SNP检测中，dNTP的加入顺序是需要提前根据两段SNP位点进行设置的，设置的dNTP加入顺序可以保证结果的单一对应准确；也就是说，在两条待测链中有一条正好在检测SNP位点时，加入的dNTP仅能使两条待测链中的SNP位点进行反应，检测过程中两个SNP位点的测序是不同时的；当在待测SNP位点的前后碱基处检测时，加入的dNTP仅能使两条待测链中的至多两条链同时反应，当无法碱基配对扩增时，反应被阻断，在加入可以配对的dNTP后，反应继续进行，单链得到延伸。
ApoE1～ApoE3、ApoE5的检测方法同上述实施例，加入dNTP的顺序一致，检测结果如图1～3和图5所示，其他相同的部分在此不做赘述。
SNP位点可位于整个检测过程中的起点，也可以作为检测的中间及终点，只要可以满足两个SNP位点的检测，选择SNP位点所在单链或其互补链均是可行的，待测SNP位点的前后碱基个数也为可调的，在此不做限制，也就是说，检测ApoE基因的SNP位点的其他可以实现的dNTP加样顺序也应认为落入本发明的保护范围之内。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Figure BDA0001230635830000111
Figure BDA0001230635830000121
Figure BDA0001230635830000131
序列表
<110> 武汉菲思特生物科技有限公司
<120> 一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法
<130> 2017
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 267
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ApoE基因序列
<400> 1
ggcacggctg tccaaggagc tgcaggcggc gcaggcccgg ctgggcgcgg acatggagga 60
cgtgtgcggc cgcctggtgc agtaccgcgg cgaggtgcag gccatgctcg gccagagcac 120
cgaggagctg cgggtgcgcc tcgcctccca cctgcgcaag ctgcgtaagc ggctcctccg 180
cgatgccgat gacctgcaga agcgcctggc agtgtaccag gccggggccc gcgagggcgc 240
cgagcgcggc ctcagcgcca tccgcga 267
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ApoE引物序列1
<400> 2
tcgcggatgg cgctga 16
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ApoE引物序列2
<400> 3
ggcacggctg tccaagga 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ApoE-112-seq
<400> 4
ctgcaccagg cggccg 16
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ApoE-158-seq
<400> 5
tggtacactg ccaggc 16

Claims (7)

1.一种基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a、将待检测DNA序列进行扩增、使用内部设有滤膜的中空的过滤柱进行DNA单链分离，其中待检测DNA序列为稳定的DNA单链；稳定的DNA单链为滤膜上收集的连接有亲合体的DNA单链或者滤液中收集的不带有亲合体的单链DNA；
b、将分离后的待测DNA单链样品加入反应体系，且同时加入双位点SNP对应的引物，经所述引物启动互补链扩增，且分别经焦磷酸测序检测与待测DNA单链互补碱基序列以确定待测SNP位点；
其中，所述对应不同位点的引物对应同一待测DNA序列的两个待测SNP位点的扩增起始端至SNP位点的碱基序列至少有n碱基不同或距SNP位点的距离不同，n≥1。
2.根据权利要求1所述的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，其特征在于：n为1或2。
3.根据权利要求1所述的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，其特征在于：扩增起始位点为两个SNP位点的5’端，或两个SNP位点的3’端，或一个SNP位点的5’端与另一个SNP位点的3’端。
4.根据权利要求1所述的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，其特征在于：SNP位点的测序起始端设计有引物，其中一段引物带有特定识别基团。
5.根据权利要求1所述的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，其特征在于：SNP位点为SNP位点或SNP位点互补链的配对碱基。
6.根据权利要求1所述的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，其特征在于：同一体系中的两个SNP位点为同一段基因上的两个SNP位点。
7.根据权利要求1所述的基于焦磷酸测序检测双位点SNP的方法，其特征在于：同一体系中的两个SNP位点为两段基因上的单个SNP位点。
CN201710097160.6A 2017-01-12 2017-02-22 一种基于焦磷酸测序检测双位点snp的方法 Active CN107043812B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

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