CN107041897A - 一种用以制备改善恶病质的组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是有关于一种用以制备改善恶病质的组合物的用途，其中组合物是包含含硒微生物发酵液和/或含硒植物萃取液；其中制备方法是包含含硒微生物的发酵步骤及含硒植物萃取物的萃取步骤。

Description

一种用以制备改善恶病质的组合物及其制备方法
技术领域
本发明是有关于一种用以制备改善恶病质的组合物的用途，特别为一种用以制备改善恶病质的含硒微生物发酵液和/或含硒植物萃取液。
背景技术
近年来，癌症一直高居全球人类死亡原因的前几位，其中约30％～87％的癌症病人会有恶病质(cachexia)的症状，而其中又约有22％的癌症病人死于恶病质而非肿瘤本身。恶病质是癌症病患体内荷尔蒙、新陈代谢异常，或因食物摄取量减少所产生的结果。再者，癌症患者若合并化疗药物治疗虽可有效的抑制癌细胞生长，然亦伴随更严重的肌肉及脂肪的流失。
再者，亦有一些研究亦指出，硒可有效抑制乳癌、肺癌、小肠癌、大肠癌及肝癌的癌细胞生长，并引发癌细胞的程序性凋亡(apoptosis)。一些研究亦显示，于恶病质的治疗上，营养的补给并不能减缓病患体重的减少，例如癌症末期的患者，就算患者增加进食的量或提高营养的摄取，也无法预防或阻止患者体重的持续下降。
然目前市售微量元素如硒元素相关营养补充品，大多为无机态的硒元素，一个人若服用超过50微克就会有中毒危险，所以医师与药剂师皆会交待不可摄取过量。故有机态的的硒酵母，就愈来愈受到人们重视，前述硒酵母，可使矿物质硒在酿酒酵母体内转化为无毒的有机形态硒，不但不具毒性，对人体而言，其吸收度相较无机型态的亚硒酸钠为高。
然而，现有可将无机态的硒元素转化为有机形态硒的微生物，无论于菌种或菌株都相当有限。进一步，现有的微生物其有机硒的转化率、产率皆不高，故如何有效提升有机硒的转化率、产率便成为重要问题。另外，前述的有机硒除可作成锭剂或胶囊而方便人们服用外，若人们平日饮食中，即可藉由摄食蔬菜而补充人体所缺乏的有机硒，不仅补充方便，且有机硒摄食来源多样化，而更能提高因来源不同，有机硒与其它微量元素、蛋白质相结合的可能性，进而达到寓医于食、增进人体健康的目的。
发明内容
鉴于以上所述，如何提升有机硒于微生物细胞内的转化率、产率，亦提升有机硒于微生物萃取物、微生物发酵物、植物萃取液中的量，进而可大量生产，降低成本，提供人们方便取得而服用有机硒为一重要课题。
前述微生物萃取物的有机硒、微生物发酵液的有机硒、植物萃取液的有机硒给予癌症或经化疗所诱导恶病质患者，可改善前述患者因患癌症、或接受化疗所导致恶病质的现象。
因此，本发明的目的对于提升含硒有机物于微生物萃取物、微生物发酵液、植物萃取液的量而改善已知含硒有机物于微生物、植物中含量不足的缺点。此外，本发明亦对于减缓因癌症/肿瘤或因接受化疗药物所导致的恶病质具改善功效，进而改善恶病质患者因已知不易自微生物萃取物、微生物发酵液、植物萃取液取得足量的含硒有机微量元素而导致日常生活质量不佳的问题。
在本发明实施例中，提供一种用以制备改善恶病质的组合物，其中所述组合物选自含硒微生物萃取物、含硒微生物发酵液、含硒植物萃取液中的一种或多种。
在本发明实施例中，其中含硒微生物是选自含硒酿酒酵母、含硒乳酸菌、含硒樟芝菌丝体中的一种或多种。
在本发明实施例中，其中含硒微生物发酵液是选自含硒樟芝菌丝体发酵液、含硒酿酒酵母发酵液、含硒乳酸菌发酵液中的一种或多种。
在本发明实施例中，其中含硒酿酒酵母是选自含硒酿酒酵母C1(Saccharomycescerevisiae C1)、含硒酿酒酵母C2(Saccharomyces cerevisiae C2)、含硒酿酒酵母H1(Saccharomyces cerevisiae H1)、含硒酿酒酵母H2(Saccharomyces cerevisiae H2)、含硒酿酒酵母H3(Saccharomyces cerevisiae H3)中的一种或多种。
在本发明实施例中，其中含硒乳酸菌是选自含硒植物乳杆菌LP69(Lactobacillusplantarum LP69)、含硒植物乳杆菌Pi06(Lactobacillus plantarum Pi06)、含硒嗜酸乳杆菌LA1(Lactobacillus acidophilus LA1)、含硒芽孢乳酸杆菌SP1(Sporolacto bacillusSP1)、含硒嗜酸乳杆菌LA2(Lactobacillus acidophilus LA2)、含硒植物乳杆菌P1(Lactobacillus plantarum P1)、含硒副干酪乳杆菌J1(Lactobacillus paracasei J1)中的一种或多种。
在本发明实施例中，其中含硒植物萃取液是选自含硒蔬菜萃取液、含硒水果萃取液、含硒稻米萃取液、含硒麦萃取液中的一种或多种。
在本发明实施例中，其中含硒蔬菜萃取液是选自含硒红凤菜萃取液、含硒地瓜叶萃取液、含硒小白菜萃取液、含硒甘蓝萃取液、含硒莴苣萃取液、含硒芥菜萃取液、含硒菠菜萃取液、含硒香菜萃取液、含硒茼蒿萃取液、含硒苋菜萃取液、含硒小青菜萃取液、含硒芹菜萃取液、含硒空心菜萃取液、含硒大白菜萃取液、含硒莲花白萃取液、含硒苜蓿芽萃取液、含硒豆芽菜萃取液中的一种或多种。
在本发明实施例中，其中含硒植物萃取液可为含硒植物发酵液，其中含硒植物发酵液是利用樟芝菌丝体、酿酒酵母或乳酸菌中的一种或多种进行发酵而成。
在本发明实施例中，其中所述恶病质是选自癌症诱导导致的恶病质或/和化疗药物诱导导致的恶病质。
在本发明实施例中，其中所述组合物有清除自由基的能力。
在本发明实施例中，其中所述自由基为DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基。
在本发明实施例中，其中所述组合物能缩小10％至98％肿瘤体积。
在本发明实施例中，其中所述组合物能缩小30％至95％肿瘤体积。
在本发明实施例中，其中所述组合物能降低癌症的恶病质个体的血清中的TNF-α含量为35pg/ml至75pg/ml。
在本发明实施例中，其中所述组合物能降低化疗药物的恶病质的个体的血清中的IL-6含量为1.8至16倍。
附图说明
图1为制备改善恶病质的组合物的制程流程图，其中：A为第一制程流程图；B为第二制程流程图。
图2显示于100L发酵槽中有机硒樟芝菌丝体的发酵情形。
图3显示于100L发酵槽中有机硒酿酒酵母的发酵情形。
图4显示于100L发酵槽中有机硒乳酸杆菌的发酵情形。
图5显示小鼠肺癌细胞在含硒酿酒酵母萃取物、含硒樟芝菌丝体萃取物、含硒红凤菜萃取液、含硒莴苣萃取液或含硒发酵液下的存活率。
图6显示含硒酿酒酵母萃取物、含硒樟芝菌丝体萃取物、含硒红凤菜萃取液、含硒莴苣萃取液或含硒发酵液清除DPPH自由基的能力。
图7显示含硒酵母发酵液、含硒樟芝发酵菌丝体、含硒红凤菜萃取液、含硒地瓜叶萃取液于不同的稀释倍数缩小肿瘤大小的能力。
附图标记说明：S101、含硒微生物；S103、含硒微生物发酵液；S105、含硒微生物萃取物；S201、含硒植物；S203、含硒植物萃取液；S205、含硒发酵混合液。
实施方式
本发明是提供一种制备具改善恶病质(cachexia)的包含微量元素有机物的组合物、其用途及其制备方法，其中达到微量元素有机物是选自含硒(Se)、钴(Co)、锰(Mn)、锌(Zn)的有机物，较佳为含硒有机物。
硒在自然界中一般以“有机”与“无机”两种型态存在。有机硒较无机硒更容易被生物利用，也是最佳的硒补充形式。有机硒化合物(organoselenium compounds)是指分子中含有硒的有机化合物，如生物体内的硒半胱氨酸(selenocysteine)即属于此类，这些有机硒的生体可利用率较无机硒高出甚多，且临床效果好，毒性低，副作用小，是硒摄取的最佳补充方式。有机硒具有抗氧化、提升免疫功能、排除人体内的毒素及对抗恶性肿瘤作用。
表一、有机硒与无机硒的比较
本发明所述微量元素有机物包括含微量元素的微生物、含微量元素的微生物发酵液、植物及/或植物萃取物。在实施例中，含微量元素的微生物为含硒微生物。含硒微生物包括，但不限于，含硒樟芝菌丝体、含硒酿酒酵母、含硒乳酸菌等。
本发明的含硒微生物发酵液包括含硒樟芝菌丝体发酵液、含硒酿酒酵母发酵液、及/或含硒乳酸菌发酵液。其中，所述含硒微生物发酵液于本发明中特别是指含硒微生物经发酵后的液体，且并无经离心处理。
在特定实施例中，酿酒酵母包括，但不限于，酿酒酵母C1(Saccharomycescerevisiae C1)、酿酒酵母C2(Saccharomyces cerevisiae C2)、酿酒酵母H1(Saccharomyces cerevisiae H1)、酿酒酵母H2(Saccharomyces cerevisiae H2)或酿酒酵母H3(Saccharomyces cerevisiae H3)。
又，「乳酸菌」是指能够代谢糖类、产生50％以上乳酸之细菌，具有这些功能的细菌包括乳酸杆菌(Lactobacillus)等。在本发明特定实施例中，乳酸菌包括，但不限于，植物乳杆菌LP69(Lactobacillus plantarum LP69)、植物乳杆菌Pi06(Lactobacillus plantarumPi06)、嗜酸乳杆菌LA1(Lactobacillus acidophilus LA1)、芽孢乳酸杆菌SP1(Sporolactobacillus SP1)、嗜酸乳杆菌LA2(Lactobacillus acidophilus LA2)、植物乳杆菌P1(Lactobacillus plantarum P1)、副干酪乳杆菌J1(Lactobacillus paracasei J1)。
此外，本发明所述的植物较佳为可食用植物，例如蔬菜、水果、稻米、麦等，较佳为蔬菜。
在实施例中，含微量元素的植物，如含硒的植物，包括，但不限于含硒的红凤菜、地瓜叶、小白菜、甘蓝、莴苣、芥菜、菠菜、香菜、茼蒿、苋菜、小青菜、芹菜、空心菜、大白菜、莲花白、苜蓿芽或豆芽菜。
本发明所述的植物萃取液是一个或多个植物的萃取液，较佳为蔬菜萃取液。
在实施例中，植物萃取液包括，但不限于红凤菜、地瓜叶、小白菜、甘蓝及/或莴苣萃取液。
本发明的微量元素有机物可为发酵液产品。
在实施例中，将红凤菜萃取液、地瓜叶萃取液、小白菜萃取液、甘蓝萃取液、莴苣萃取液及/或樟芝菌丝体以酿酒酵母、及/或乳酸菌发酵而获得发酵液产品。
在本发明中，本发明含硒有机物的使用方式包括口服或注射。
此外，本发明的组合物可单独给药，或是在包括有药学上可接受的载体、稀释剂及/或赋形剂的组合物中给药。上述载体可为溶剂、散布媒剂(dispersion media)、涂层(coatings)、抗菌剂、抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂等。稀释剂可为制菌注射水(bacteriostatic water for injection，BWFI)、磷酸缓冲液、Ringer溶液或葡萄糖溶液等。赋形剂可为碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸钠、乳醣、淀粉、明胶、藻酸、硬脂酸或硬脂酸镁等。
本发明另提供一种降低肿瘤体积/治疗癌症的方法，包括给予一个体有效剂量的本发明含硒有机物。在一实施例中，每日给予0.01-100mg/kg，较佳为1-100mg/kg以上，更佳为每日给予5-60mg/kg。
不仅如此，本发明所给予的剂量可依照不同的参数做适当的调整。上述参数包括，但不限于，个体的种类，个体的大小、疾病的严重性。本发明的活性成分可以一次给予或24小时内多次给予或连续给予。
本发明中所述的“个体”是指人类或非人类的动物，如，狗、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、或灵长类动物，特别为实验动物、家畜、及驯养的动物。在一实施例中，动物可为人类。在另一实施例中，动物可为啮齿目动物，例如，小鼠或大鼠。
本发明的含硒有机物具抗氧化能力，可清除自由基。自由基包括，但不限于，NO－、O－、HO－、HOO－、HSO4 －及其类似物。在一实施例中，自由基为DPPH自由基。
在另一实施例中，本发明组合物可有效降低肿瘤体积，其可减少10％以上，较佳为20％～99％。较佳地，本发明组合物可降低肿瘤体积30％至95％。例如，于一实施例中，含硒红凤菜萃取物与含硒地瓜叶萃取物可将癌症个体的肿瘤缩小至10％以下。
本发明组合物具有预防及/或治疗癌症的效果，因此可给药投予至癌症患者、接受化疗或放疗的个体、癌症高危险族群等。且本发明的组合物具有高度的安全性，不会对人体造成影响，因此也可作为长期的饮食补充品。
本发明组合物可有效地治疗及/或预防癌症，包括良性前列腺肥大、前列腺癌、乳癌、子宫癌、血癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、大肠直肠癌、睪丸癌、淋巴癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、胰脏癌、肺癌、脑部肿瘤、皮肤癌、胃癌、口腔癌、肝癌、喉癌、胆癌、甲状腺癌、肝癌、肾脏癌以及鼻咽癌等，较佳为大肠癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、子宫颈癌或肝癌。
所有说明书中所揭示的发明技术特点可以任意方式组合。说明书中揭示的每一技术特点可以提供相同、等同或相似目的的其他方式替换。因此，除非另有特别说明，文中所有揭示的特点均只是等同或相似特点的一般系列的实例。
无需进一步详尽说明，本技术领域的人员可根据以上描述，使用本发明至其最大限度。下面的具体实施方式，其应解释为仅是说明性的，且不可用于限制本发明。本文所引用的文献均并入本发明。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
实施例
1.制备方法
如图1所示，图式图1为本发明一种用以制备改善恶病质的组合物的制备方法的流程图，其中图1A为第一制程的含硒微生物的发酵方法，含硒微生物(s101)是藉由微生物于发酵步骤中加入亚硒酸钠而得含硒微生物发酵液(s103)，含硒微生物发酵液(s103)进一步以菌萃取步骤而得含硒微生物萃取物(s105)。图1B为第二制程的含硒植物萃取方法，包含将含硒植物(s201)藉由萃取步骤而得含硒植物萃取液(s203)，含硒植物萃取液(s203)藉加入微生物进行发酵且可进一步再加入另一微生物或同一微生物而得含硒发酵混合液(s205)。
1-1含有机硒樟芝菌丝体发酵液/萃取液的制备
将樟芝菌丝体自-80℃冰箱中取出解冻后，取单一菌落至10mL的YM broth培养基，于30℃，150rpm震荡培养16-24小时进行活化。
取活化后的菌液7.5mL至150mL YM broth培养基中，于30℃，150rpm培养16-24小时进行第一次继代培养。接着，将第一次继代培养菌液150mL接种入3L种菌培养基(如一种培养好氧反硝化菌的富集培养基FM)中，150rpm震荡培养16-24小时做为种菌。
将150mL含种菌的新鲜培养基以无菌操作倒入灭菌的血清瓶中，将种菌接入发酵槽中进行培养。发酵槽所使用的发酵培养基含有70g/L葡萄糖、15g/L酵母蛋白胨(Yeastpeptone)、MgSO4.1.7g/L 7H2O、2.5g/L KH2PO4及6.5g/L(NH4)2SO4。在樟芝菌丝体对数生长期初期(约种菌接入发酵槽的第3.5小时)添加3mL的亚硒酸钠溶液(Na2SeO3，浓度为30mg/mL)至3L发酵培养基中(使发酵培养液中亚硒酸钠溶液的最终浓度为30μg/mL。
参阅图2，发酵时间为11天，以100L发酵槽生产可得有机硒樟芝菌丝体有机硒转化率为88％，胞内硒(Se)浓度可达732mg/kg，菌体重量可达2600g/100L。
另外，本发明是藉由感应耦合电浆质谱仪(Inductively Coupled Plasma MassSepectrometry，ICP-MS)测定硒含量。举例而言，本发明利用感应耦合电浆质谱仪而测定含有机硒(含硒)樟芝菌丝体、含有机硒(含硒)酿酒酵母、含有机硒(含硒)乳酸菌的菌体细胞的硒含量。另外，本发明有机硒转化率(％)则定义为：(菌体重量×有机硒含量/无机硒总量)×100％。
1-2含有机硒酿酒酵母的制备
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)-80℃冰箱取出并于37℃下解冻，取单一菌落于10mL YM broth培养基中，于30℃，以150rpm震荡培养16－24小时进行活化。
取活化后的菌液7.5mL接种于150mL YM broth培养基中，于30℃，150rpm震荡培养16-24小时进行第一次继代培养。
将第一次继代培养的种菌150mL倒入灭菌的血清瓶中，接着利用泵将种菌接入发酵槽中开始进行培养，使用的发酵培养基含有70g/L葡萄糖、15g/L酵母蛋白胨(Yeastpeptone)、1.7g/L MgSO4.7H2O、2.5g/L KH2PO4、6.5g/L(NH4)2SO4。于酿酒酵母的对数生长期初期(约种菌接入发酵槽的第3.5小时)添加3mL亚硒酸钠溶液(Na2SeO3，浓度为30mg/mL)至3L培养基中(使亚硒酸钠溶液于发酵培养液最终浓度为30μg/mL)，总添加量为3mL。
参照图3及表二，使用100L发酵槽，发酵时间为1天，所获得的含有机硒(含硒)酿酒酵母的有机硒转化率为37-77％，胞内硒浓度可达537-792mg/kg，菌体重量可达1400-2200g/100L。
再者，如前述，各种酿酒酵母于培养时经添加亚硒酸钠溶液，而后得含硒酿酒酵母如含硒酿酒酵母C1(Saccharomyces cerevisiae C1)、含硒酿酒酵母C2(Saccharomycescerevisiae C2)、含硒酿酒酵母H1(Saccharomyces cerevisiae H1)、含硒酿酒酵母H2(Saccharomyces cerevisiae H2)、含硒酿酒酵母H3(Saccharomyces cerevisiae H3)(如表二所示)。又，如前述，本發明所使用的酿酒酵母其筛选的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照相关产品进行。
表二、各种酿酒酵母的硒浓度及转化率
1-3有机硒乳酸杆菌的制备
将乳酸菌(如本發明實施例的植物乳杆菌LP69(Lactobacillus plantarumLP69)、植物乳杆菌Pi06(Lactobacillus plantarum Pi06)、嗜酸乳杆菌LA1(Lactobacillus acidophilus LA1)、芽孢乳酸杆菌SP1(Sporolacto bacillus SP1)、嗜酸乳杆菌LA2(Lactobacillus acidophilus LA2)、植物乳杆菌P1(Lactobacillus plantarumP1)、副干酪乳杆菌J1(Lactobacillus paracasei J1)-80℃冰箱取出并于37℃下解冻，取单一菌落于10mL MRS broth培养基(MRS肉汤培养基)中，于30℃，以150rpm震荡培养16－24小时进行活化。
取活化后的菌液7.5mL接种于150mL MRS broth培养基中，于30℃，150rpm震荡培养16-24小时进行第一次继代培养。
将第一次继代培养的种菌150mL倒入灭菌的血清瓶中，接着利用泵将种菌接入发酵槽中开始进行培养，使用的发酵培养基含有10g/L蛋白胨、10g/L牛肉抽出物、5g/L酵母抽出物、20g/L葡萄糖、1g/L聚山梨醇脂80、2g/L K2HPO4、5g/L醋酸钠、2g/L柠檬酸铵、0.1g/LMgSO4.7H2O、0.05g/L MnSO4.4H2O。于乳酸菌的对数生长期初期(约种菌接入发酵槽的第3.5小时)添加3mL亚硒酸钠溶液(Na2SeO3，浓度为30mg/mL)至3L培养基中(使发酵培养液最终浓度为30μg/mL)，总添加量为3mL。
参照图4，使用100L发酵槽，发酵时间为1天，所获得的含有机硒(含硒)乳酸菌有机硒转化率为56-92％，胞内硒浓度可达682-1471mg/kg，菌体重量可达1200-1782g/100L。
再者，如前述，各种乳酸菌于培养时经添加亚硒酸钠溶液，而后得含硒乳酸菌如含硒植物乳杆菌LP69(Lactobacillus plantarum LP69)、含硒植物乳杆菌Pi06(Lactobacillus plantarum Pi06)、含硒嗜酸乳杆菌LA1(Lactobacillus acidophilusLA1)、含硒芽孢乳酸杆菌SP1(Sporolacto bacillus SP1)、含硒嗜酸乳杆菌LA2(Lactobacillus acidophilus LA2)、含硒植物乳杆菌P1(Lactobacillus plantarum P1)、含硒副干酪乳杆菌J1(Lactobacillus paracasei J1)。又，如前述，本發明所使用的酿酒酵母其筛选的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照相关产品进行。
表三、各种乳酸菌的硒浓度及转化率
1-4含硒有机蔬菜的制备
将上述发酵废液加至80kg篦麻粕原料，将氮、磷、钾比例调整为1:2:1。拌入篦麻粕原料，混合搅拌与升温至90℃，将蔬果残渣水分降低至70％，降温至50℃后加入菌根菌菌酛(如摩西球囊霉(Glomus mosseae)、幼套球囊霉(Glomus etunicatum)、根内球囊霉(Glomusintraradices)、近明球囊霉(Glomus claroideum)、沾屑球囊霉(Glomus spurcum)、垦丁内养囊霉(Entrophospora kentinensis)、莫氏无梗囊霉(Acaulospora morrowiae)及黑色盾巨孢囊霉(Scutellospora nigra)中的一种或多种)，使前述菌根菌菌酛的比例为5％，浓度达109CFU/mL。将此原料于30℃下反应60分钟，并在90分钟内逐渐升温至100℃后维持10分钟，以获得有机硒微生物固肥。
亦可将上述发酵废液直接加入菌根菌菌酛(摩西球囊霉(Glomus mosseae)、幼套球囊霉(Glomus etunicatum)、根内球囊霉(Glomus intraradices)、近明球囊霉(Glomusclaroideum)、沾屑球囊霉(Glomus spurcum)、垦丁内养囊霉(Entrophosporakentinensis)、莫氏无梗囊霉(Acaulospora morrowiae)及黑色盾巨孢囊霉(Scutellospora nigra)中的一种或多种)，使前述菌根菌菌酛的比例为5％，浓度达109CFU/mL。将此原料于30℃下反应60分钟，并在90分钟内逐渐升温至100℃后维持10分钟，以获得有机硒微生物液肥。
其中，前述菌根菌菌酛的分离、培养与繁殖是参考美国西维吉尼大学的国际菌根菌保存中心(West Virginia University，INVAM)等菌根菌研究、农业应用单位其作业程序而进一步改良、应用。
利用此有机含硒微生物肥料种植红凤菜、莴苣、地瓜叶、小白菜、甘蓝、芥菜、菠菜、香菜、茼蒿、苋菜、小青菜、芹菜、空心菜、大白菜、莲花白、苜蓿芽、豆芽菜等，以获得含硒蔬菜，并分别制作成含硒红凤菜萃取液、含硒莴苣萃取液、含硒地瓜叶萃取液、含硒小白菜萃取液、含硒甘蓝萃取液、含硒芥菜萃取液、含硒菠菜萃取液、含硒香菜萃取液、含硒茼蒿萃取液、含硒苋菜萃取液、含硒小青菜萃取液、含硒芹菜萃取液、含硒空心菜萃取液、含硒大白菜萃取液、含硒莲花白萃取液、含硒苜蓿芽萃取液、含硒豆芽菜萃取液等。
2.含硒有机物的抗癌效果
在本实施例中，使用(a)含硒酿酒酵母萃取物(硒含量715mg/kg)、(b)含硒樟芝菌丝体萃取物(硒含量732mg/kg)、(c)含硒红凤菜萃取液(硒含量10mg/kg)、(d)含硒莴苣萃取液(硒含量10mg/kg)、(e)含硒发酵混合液(硒含量10mg/kg)，将含硒红凤菜萃取液或/和含硒莴苣萃取液或/和含硒小白菜萃取液或/和含硒甘蓝萃取液的含硒蔬菜萃取液经酿酒酵母或乳酸菌而混合发酵后加入0.5(w/w)％樟芝菌丝体进行试验。于本发明的含硒发酵混合液其中一实施例(参阅图1)，特别是指将含硒红凤菜萃取液、含硒莴苣萃取液、含硒小白菜萃取液、含硒甘蓝萃取液经酿酒酵母或乳酸菌混合发酵30天后，加入0.5(w/w)％樟芝菌丝体进行试验。
含硒蔬菜萃取液亦可选自含硒地瓜叶萃取液、含硒甘蓝萃取液、含硒芥菜萃取液、含硒菠菜萃取液、含硒香菜萃取液、含硒茼蒿萃取液、含硒苋菜萃取液、含硒小青菜萃取液、含硒芹菜萃取液、含硒空心菜萃取液、含硒大白菜萃取液、含硒莲花白萃取液、含硒苜蓿芽萃取液或含硒豆芽菜萃取液，另外，亦可选择酿酒酵母、含硒酿酒酵母、乳酸菌、含硒乳酸菌、樟芝菌丝体、含硒樟芝菌丝体进行发酵并混合。将含硒量稀释为10mg/kg，以平衡含硒量所造成的结果差异。分别将此(a)含硒酿酒酵母萃取物、(b)含硒樟芝菌丝体萃取物、(c)含硒红凤菜萃取液、(d)含硒莴苣萃取液、(e)含硒发酵混合液5种含硒物质稀释100、200、400及800倍。
2.1细胞毒性试验
利用MTS试验测试上述5种含硒有机物对于小鼠肺癌细胞(line-1)的细胞毒性。参阅图5，稀释100倍的含硒酿酒酵母萃取物、含硒樟芝菌丝体萃取物、含硒红凤菜萃取液、含硒莴苣萃取液与含硒发酵混合液对于肺癌细胞(小鼠肺癌细胞)的生长具有抑制能力。在各组中，将含硒有机物稀释200-800倍可抑制70％-40％的肺癌细胞生长。5种含硒有机物皆可作为有效抑制肺癌细胞的物质，且具有剂量依赖性。
2.2抗氧化试验
取100μl的含硒有机物加入100μl由甲醇所配制的1mM1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH自由基)，均匀混合静置30分钟，使用分光光度计检测517nm吸光值。空白组以100μl的甲醇代替。吸光值越低表示样品清除DPPH自由基能力越强。清除率(Scavenging effect)＝(1-(样品517nm吸光值/空白组517nm吸光值))×100％。
参阅图6，含硒发酵混合液清除DPPH自由基效果最好，经100倍稀释后，DPPH自由基清除率约为90％；而含硒酿酒酵母萃取物与含硒樟芝菌丝体萃取物则约为30-35％；含硒蔬菜汁其清除率约为60％。
2.3恶病质动物试验一
将6至8周大的BALB/cByJ小鼠，依体重平均分配至各组。小鼠饲料为一种商业基础饲料(例如的5001Laboratory Rodent Diet)，其经高温高压灭菌，采任意食用的方式喂食。动物模式包括(1)肿瘤诱导恶病质的动物模式及(2)化疗动物模式。
在前述(1)肿瘤诱导恶病质的动物模式中，对照组以皮下注射1×105(产生中度恶病质)与5×105(产生重度恶病质)肺癌细胞line-1至BALB/cByJ小鼠，制造肺癌的恶病质急性反应，控制组则是注射0.1ml PBS(磷酸盐缓冲液)，实验组则以管灌/喂食0.1mL/天的含硒发酵混合液(10mg/kg)。
肿瘤诱导恶病质的动物模式实验结果显示，肿瘤小鼠的增重率显着低于正常小鼠。中度恶病质组别的小鼠的体重下降15.6％，重度组则下降19.1％。摄食率各组间则无显着差异(P>0.05)，如表四所示。由此结果可知，恶病质的体重减轻症状是由肿瘤所引起，属于癌因性厌食。此外，肿瘤小鼠的血清白蛋白显着降低，此结果与恶病质的恶化程度具有负相关性(表四)。在重度恶病质小鼠中，血清中发炎激素TNF-α含量显着增加(表四)。实验组小鼠的体重、血清白蛋白、发炎激素TNF-α及IL-6与正常小鼠无显着差异，此结果可显示含硒发酵混合液有助于降低肿瘤诱导动物的恶病质产生。亦即，本发明的含硒发酵混合液能降低癌症的恶病质个体的血清中TNF-α含量为35pg/ml至75pg/ml。
表四、肿瘤诱导恶病质的动物模式实验
*P<0.01；n为动物只数
在(2)化疗动物模式中，以腹腔连续注射多西他赛(docetaxel)2次(低剂量组，产生中度恶病质)与4次(高剂量组，产生重度恶病质)至BALB/cByJ小鼠，制造化疗诱导的恶病质急性反应。控制组则是注射0.1ml PBS，实验组则灌/喂食0.1mL/天的含硒发酵混合液(10mg/kg)。
化疗诱导的恶病质的动物模式实验结果显示，多西他赛(docetaxel)处理的小鼠其增重率、摄食率与血清白蛋白量显着低于正常小鼠，且随着施打次数增加其严重度越高，如表五所示。低剂量组别的小鼠其体重流失5.5％，高剂量组则流失了11.6％。化疗药物(docetaxel)会引起厌食现象，显示由化疗引起的体重流失有一部分是由于厌食所引起。在docetaxel处理小鼠血清中，发炎激素TNF-α含量各组间无显着差异，但是IL-6含量是正常鼠的2至3倍。临床上恶病质症状，包括低白蛋白与高发炎激素表现，皆与动物模式所发现的特征吻合。实验组小鼠的体重、血清白蛋白、发炎激素TNF-α及IL-6与正常小鼠无显着差异，此结果可显示含硒发酵混合液有助于降低化学诱导动物的恶病质产生。亦即，本发明的含硒发酵混合液能降低化疗药物诱导恶病质的个体的血清中IL-6含量为1.8至16倍。
表五、Docetaxel诱导恶病质的动物模式实验
*P<0.01；n为动物只数
2.4恶病质动物试验二
选用六到八周龄C57BL/6雄性小鼠，并依体重将小鼠随机分为：对照组，喂食生理食盐水；实验一组，给予含硒酵母发酵液；实验二组，给予含硒樟芝菌丝体萃取物；实验三组，给予含硒红凤菜萃取液；实验四组，给予含硒地瓜叶萃取液。于此实施例的对照组与实验组中，是将1×105LLC细胞(肺癌细胞)注射至C57BL/6小鼠右脚背皮下而诱导肿瘤发生，并对应前述各实验组而每日分别给予20或40毫克/公斤体重的含硒酵母发酵液、含硒樟芝发酵菌丝体、含硒红凤菜萃取液、含硒地瓜菜萃取液。如图7，其中如含硒红凤菜萃取液、含硒地瓜叶萃取液于稀释100倍时，实验组小鼠的肿瘤相较对照组缩小90％以上。再者，前述各实验组使用本发明前述的含硒有机物皆可抑制肿瘤大小达60％以上。
综上所述，本发明藉由提供含微量元素的微生物、含微量元素的微生物发酵液、植物及/或植物萃取物，能有效改善生物体恶病质的情形，进而提升有恶病质患的生活质量。
发明所揭露的所有特征应可以任何结合方式实现。本发明所揭露的每一特征应可以相同、均等或相似目的的取代物所取代。因此，除非有明确的指定，否则所揭露的每一个特征仅仅只是均等物或相似特征的一个种类的一实施例。
由上述内容可知，任何所属本领域技术人员，将可轻易从本发明所揭露的内容中了解到本发明的特征，在不偏离随附权利要求书所界定的本发明的精神与范围下，当可在此进行各种改变、取代以及修正。因此，其他实施例亦落于本发明权利要求书所要求保护的范围之内。

Claims (20)

1.一种用以制备改善恶病质的组合物，其特征是，所述组合物是包含含硒微生物发酵液和/或含硒植物萃取液。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征是，所述含硒微生物发酵液进一步以菌萃取步骤而得含硒微生物萃取物。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征是，所述含硒微生物发酵液的含硒微生物是选自含硒酿酒酵母、含硒乳酸菌或含硒樟芝菌丝体中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征是，所述含硒酿酒酵母是选自含硒酿酒酵母C1(Saccharomyces cerevisiae C1)、含硒酿酒酵母C2(Saccharomyces cerevisiae C2)、含硒酿酒酵母H1(Saccharomyces cerevisiae H1)、含硒酿酒酵母H2(Saccharomycescerevisiae H2)、含硒酿酒酵母H3(Saccharomyces cerevisiae H3)中一种或多种。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征是，所述含硒酿酒酵母的胞内硒浓度为530-800mg/kg。
6.如权利要求3所述的组合物，其特征是，所述含硒乳酸菌是选自含硒植物乳杆菌LP69(Lactobacillus plantarum LP69)、含硒植物乳杆菌Pi06(Lactobacillus plantarumPi06)、含硒嗜酸乳杆菌LA1(Lactobacillus acidophilus LA1)、含硒芽孢乳酸杆菌SP1(Sporolacto bacillus SP1)、含硒嗜酸乳杆菌LA2(Lactobacillus acidophilus LA2)、含硒植物乳杆菌P1(Lactobacillus plantarum P1)、含硒副干酪乳杆菌J1(Lactobacillusparacasei J1)中的一种或多种。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征是，所述含硒乳酸菌的胞内硒浓度为670-1480mg/kg。
8.如权利要求3所述的组合物，其特征是，所述含硒樟芝菌丝体的胞内硒浓度为725-740mg/kg。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征是，所述含硒植物萃取液为含硒植物发酵液，其中所述含硒植物发酵液是利用樟芝菌丝体、酿酒酵母或乳酸菌中的一种或多种进行发酵。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征是，所述组合物进一步包含樟芝菌丝体、酿酒酵母或乳酸菌。
11.如权利要求1所述的组合物，其特征是，所述含硒植物萃取液是选自含硒蔬菜萃取液、含硒水果萃取液、含硒稻米萃取液或含硒麦萃取液。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征是，所述含硒蔬菜萃取液是选自含硒红凤菜萃取液、含硒地瓜叶萃取液、含硒小白菜萃取液、含硒甘蓝萃取液、含硒莴苣萃取液、含硒芥菜萃取液、含硒菠菜萃取液、含硒香菜萃取液、含硒茼蒿萃取液、含硒苋菜萃取液、含硒小青菜萃取液、含硒芹菜萃取液、含硒空心菜萃取液、含硒大白菜萃取液、含硒莲花白萃取液、含硒苜蓿芽萃取液或含硒豆芽菜萃取液。
13.一种改善恶病质的组合物的制备方法，其特征是，所述制备方法包含第一制程或/及第二制程，其中所述第一制程是包含含硒微生物的发酵步骤及所述第二制程是包含含硒植物萃取物的萃取步骤。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征是，所述第一制程更进一步包括菌萃取步骤而得含硒微生物萃取物。
15.如权利要求13所述的制备方法，其特征是，所述第一制程的所述含硒微生物为含硒酿酒酵母、含硒乳酸菌以及含硒樟芝菌丝体。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征是，所述含硒樟芝菌丝体的发酵步骤于第3.5小时加入亚硒酸钠溶液，培养9～12天。
17.如权利要求15所述的制备方法，其特征是，所述含硒酿酒酵母、所述含硒乳酸菌的发酵步骤于第3.5小时加入亚硒酸钠培养0.5～2天。
18.如权利要求13所述的制备方法，其特征是，所述第二制程进一步包含将所述含硒植物萃取液加入微生物进行发酵。
19.如权利要求18所述的制备方法，其特征是，所述第二制程的所述微生物为酿酒酵母、乳酸菌以及樟芝菌丝体。
20.如权利要求19所述的制备方法，其特征是，所述第二制程的加入所述微生物进行发酵系培养30天。
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