CN107034255B - 一种利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法 - Google Patents

一种利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法，具体涉及在废弃生物质碳酸钠预处理的基础上，利用一种木质素降解菌(Cupriavidus basilensis B‑8，保藏编号CGMCC No.4240)以及通过改善培养条件进一步去除废弃生物质中的残余木质素和半纤维素，并将废弃生物质的稳固直杆状变得松散，表面呈现多孔片状，极大提高了酶解糖化时的可及表面。该方法可使碳酸钠预处理的酶解效率提高近40％，效果显著，兼具处理时间短、操作简单、二次污染小、成本低廉等优点。

Description

一种利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法
技术领域：
本发明属于生物质新能源技术领域，具体涉及一种利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法。
背景技术：
近年来，为了降低对化石燃料的依赖，各国政府和科研机构大力开展对可再生能源的开发和研究。废弃生物质中的木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，蕴藏着巨量的碳资源，成为第二代生物质能源，是当前生物乙醇、生物塑料、生物柴油等绿色产品生物发酵最重要的碳源。木质纤维素中的半纤维素和木质素紧密镶嵌在纤维素的周围，如不进行任何处理，其糖化发酵效率极低。因此，预处理成为了废弃生物质开发利用的首要环节，即疏松破坏纤维素的致密结构以及木质素和半纤维素的包裹，使纤维素、半纤维素和木质素分离，提高酶对纤维素的可及度和作用效率。
预处理主要有物理法、化学法和生物法。碳酸钠是一种强碱弱酸盐，近期被应用于废弃生物质预处理中(Reducing biomass recalcitrance via mild sodium carbonatepretreatment.Bioresource Technology.209(2016):386-390)。与氢氧化钠等传统碱法类似，碳酸钠预处理主要用于去除废弃生物质中的木质素和部分半纤维素。该方法具备了碱法预处理的诸多优势，同时可避免碱法的腐蚀、过度中和以及环境危害等问题。目前，已有人采用真菌法或真菌-化学联合预处理实现了废弃生物质中木质素的深度去除。但真菌生长所需时间过长(10～50天)，不利于工艺扩大化和商业化。与真菌相比，木质素降解细菌的数量虽然较少，但可大大缩短生物处理接种时间(<7天)，因此采用细菌替代真菌进行废弃生物质预处理具有重要意义。目前，国内外目前尚无木质素降解细菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的相关报道。
此外，废弃生物质秸秆也就是原生木质纤维素，不仅包括木质素，还包括纤维素和半纤维素，三者紧密结合连接；其中的原生木质素高度聚合，木质素降解细菌作用原生木质纤维素时比纯的碱木质素要更加复杂，作用难度更大，因此，找寻合适的培养基成分以及条件，最大程度的去除碳酸钠法预处理渣中残留木质素也是亟待解决的问题。
发明内容：
为了解决现有废弃生物质碳酸钠预处理技术存在的问题，本发明提供了一种利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法。
本发明的技术方案为：
一种利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法，包括以下步骤：
(1)碳酸钠预处理：将废弃生物质加入Na2CO3溶液中，加热反应后，过滤分离，所得固体清洗至pH呈中性，烘干，得到碳酸钠预处理废弃生物质；
(2)木质素降解菌强化预处理：将保藏编号为CGMCC No.4240的木质素降解菌Cupriavidus basilensis B-8接种于含碳酸钠预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养后，过滤分离所得固体，清洗，烘干，得到细菌强化碳酸钠预处理的废弃生物质。
步骤(1)所述的废弃生物质包括：水稻秸秆，玉米秸秆，小麦秸秆，甘蔗渣或柳枝稷等。
步骤(1)将废弃生物质粉碎后20-100目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
步骤(1)碳酸钠预处理：将废弃生物质按固液比为1:5-1:20(g/ml)加入浓度为2-10％的Na2CO3溶液中，静置于70℃-100℃恒温环境反应2-4h后，过滤分离，所得固体用超纯水清洗至pH呈中性，烘干至恒重，得到碳酸钠预处理废弃生物质。
步骤(2)木质素降解菌强化预处理：将木质素降解菌接种于含碳酸钠预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养1-2天后，过滤分离所得固体，用超纯水清洗3次，烘干至恒重，得到细菌强化碳酸钠预处理的废弃生物质。
步骤(2)所述的细菌培养条件为接种量5-15％(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，温度25-40℃，自然pH条件，培养时间1-2天。
步骤(2)所述的含碳酸钠预处理废弃生物质的无菌培养基为：碳酸钠预处理的废弃生物质5～15g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl20.01g/L，FeSO4·7H2O 0.015g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L。
本发明提供的预处理方法的优势在于：
(1)利用木质素降解菌强化碳酸钠预处理可实现碳酸钠预处理废弃生物质木质素和半纤维素的深度去除，同时破坏废弃生物质结构，使废弃生物质结构变得松散，增加了酶解糖化时的可及表面。
(2)现有技术中的化学处理方法强度大，能耗高、药剂使用量大；本发明实现了木质素的深度去除，同时降低了化学预处理的强度、能耗和药耗，提高了废弃生物质中碳源利用和资源化产率。
(3)废弃生物质秸秆中的原生木质素高度聚合，木质素降解细菌作用时比纯的碱木质素要更加复杂，作用难度更大，本发明找寻了合适的培养基成分以及条件，最大程度的去除了碳酸钠预处理渣中残留木质素。
(4)大幅提高酶解糖化效率，相比于未经预处理的废弃生物质，酶解效率提高为了至少6倍，比传统碳酸钠预处理提高了约40％。
(5)具有操作简单、二次污染小、处理时间短、成本低廉等优点。
本发明所使用的木质素降解菌(Cupriavidus basilensis B-8)，保藏编号CGMCCNo.4240，是由本申请人筛选的已经做过专利保藏和专利申请的菌株。
附图说明:
图1：实施例中预处理后废弃生物质糖产量变化；
图2：实施例中预处理后废弃生物质各组分变化；
图3：实施例中预处理的废弃生物质预处理前后扫描电镜分析，(a)为未处理的水稻秸秆，(b)为本发明条件下单独Na2CO3处理的水稻秸秆，(c)、(d)为Cupriavidusbasilensis B-8强化预处理后的水稻秸秆。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为8％的Na2CO3溶液，静置于80℃恒温环境中反应3h后，过滤分离得到湿渣A。
(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B。
(4)将保存在LB斜面的Cupriavidus basilensis B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm的光密度达到0.8-1.0)，得到Cupriavidus basilensisB-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(5)将上一步所得到的Cupriavidus basilensis B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(6)将收集的Cupriavidus basilensis B-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣B培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养2天，过滤分离得湿渣C；其中所述干渣B培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O0.01g，蒸馏水1L；
(7)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣C，置于60℃烘干至恒重得到干渣D。
(8)将干渣D按固液比1:40(g/ml)加入50mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)及纤维素酶12PFU/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到高纯度糖。
通过本实施例的实施，水稻秸秆各组分含量发生显著变化，木质素及半纤维素含量显著降低，而纤维素含量升高(如附图2)。木质素和半纤维素的去除，使得水稻秸秆的结构更容易被酶解糖化；扫描电镜图像(如附图3)所示，预处理前直杆状结构消失，原料呈现出多孔片状，废弃生物质结构变得十分松散，提高了酶解过程中的酶的可及表面。Cupriavidus basilensis B-8强化预处理后的酶解效率为未处理的8倍，比本发明条件下单独Na2CO3预处理提高了约38％(如附图1)，效果显著。
实施例2
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为6％的Na2CO3溶液，静置于80℃恒温环境中3h后，过滤分离得到湿渣A。
(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B。
(4)将保存在LB斜面的Cupriavidus basilensis B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm的光密度达到0.8-1.0)，得到Cupriavidus basilensisB-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(5)将上一步所得到的Cupriavidus basilensis B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(6)将收集的Cupriavidus basilensis B-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣B培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养2天，过滤分离得湿渣C；其中所述干渣B培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O0.01g，蒸馏水1L；
(7)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣C，置于60℃烘干至恒重得到干渣D。
(8)将干渣D按固液比1:40(g/ml)加入50mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)及纤维素酶12PFU/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到高纯度糖。
经本实施例细菌强化预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量从2.3g/L提高到12.4g/L，酶解效率提高为未处理的6倍(如附图1)，较本发明条件下单独Na2CO3预处理提高了约24％。
实施例3
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为4％的Na2CO3溶液，静置于80℃恒温环境中反应3h后，过滤分离得到湿渣A。
(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B。
(4)将保存在LB斜面的Cupriavidus basilensis B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm的光密度达到0.8-1.0)，得到Cupriavidus basilensisB-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(5)将上一步所得到的Cupriavidus basilensis B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(6)将收集的Cupriavidus basilensis B-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣B培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养2天，过滤分离得湿渣C；其中所述干渣B培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O0.01g，蒸馏水1L；
(7)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣C，置于60℃烘干至恒重得到干渣D。
(8)将干渣D按固液比1:40(g/ml)加入50mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)及纤维素酶12PFU/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到高纯度糖。
经本实施例细菌强化预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量从2.3g/L提高到10.7g/L，酶解效率提高为未处理的5倍(如附图1)，较本发明条件下单独Na2CO3预处理提高了约24％。
对比例1
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法，仅包括高温条件下碳酸钠预处理过程，具体步骤如下：
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为2％的Na2CO3溶液，静置于121℃恒温环境中反应1h后，过滤分离得到湿渣A。
(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B；
(4)将干渣B按固液比1:40(g/ml)加入50mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)及纤维素酶12PFU/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
经此对比例预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量为10.4g/L低于实施例(11.6～12.9g/L)，说明高温条件下碳酸钠预处理效果不及本发明温和条件下Na2CO3加细菌强化预处理。
对比例2
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法，仅包括本发明条件下碳酸钠预处理过程，具体步骤如下：
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为4％的Na2CO3溶液，静置于80℃恒温环境中反应3h后，过滤分离得到湿渣A。
(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B；
(4)将干渣B按固液比1:40(g/ml)加入50mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)及纤维素酶12PFU/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
经此对比例温和碳酸钠化学条件预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量为8.6g/L，处理后木质素含量为(14％)远高于实施例(6％～9％)，不仅降低了糖纯度，也给纤维素的后续酶解和生物转化造成阻碍。
对比例3
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法，仅本发明包括细菌Cupriavidusbasilensis B-8预处理过程，具体步骤如下：
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重得到干渣B。
(2)将保存在LB斜面的Cupriavidus basilensis B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm的光密度达到0.8-1.0)，得到Cupriavidus basilensisB-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(3)将上一步所得到的Cupriavidus basilensis B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(4)将收集的Cupriavidus basilensis B-8菌体按20％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于水稻秸秆培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养3天，过滤分离得湿渣；其中水稻秸秆培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O0.01g，蒸馏水1L；
(5)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣，置于60℃烘干至恒重得到干渣C。
(6)将干渣C按固液比1:40(g/ml)加入50mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)及纤维素酶12PFU/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
经本对比例预处理后的水稻秸秆的还原糖产量约为2.4g/L，略高于未处理水稻秸秆(2.3g/L)，但远远低于实施例中的还原糖产量。说明单独采用Cupriavidus basilensisB-8预处理未能达到理想效果。而本发明在碳酸钠法预处理的基础上，通过Cupriavidusbasilensis B-8的作用产生了意想不到的效果。
对比例4
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法为细菌Cupriavidus basilensis B-8强化高强度碳酸钠预处理过程，具体步骤如下：
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)将废弃生物质置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为2％的Na2CO3溶液，静置于121℃恒温环境中反应1h后，过滤分离得到湿渣A。
(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B。
(4)将保存在LB斜面的Cupriavidus basilensis B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm的光密度达到0.8-1.0)，得到Cupriavidus basilensisB-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(5)将上一步所得到的Cupriavidus basilensis B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(6)将收集的Cupriavidus basilensis B-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣B培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养2天，过滤分离得湿渣C；其中干渣B培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO42.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O 0.01g，蒸馏水1L；
(7)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣C，置于60℃烘干至恒重得到干渣D。
(8)将干渣D按固液比1:40(g/ml)加入50mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)及纤维素酶12PFU/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
经本实施例经过细菌强化预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量为11.7g/L，较单独高强度Na2CO3预处理仅提高了约12％，但不及本发明温和条件下Na2CO3加细菌强化预处理的提高量(25％)，说明高强度条件极易造成纤维素的过度破坏和流失，影响了后续微生物处理的效果。
对比例5
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法与实施例中的过程相同，仅将实施例步骤(6)中的大部分培养基成分改为与专利(申请号：201610569477.0)相同，以本发明实施例制备的干渣B10.0g/L，代替碱木质素1-6g，其他组分为：(NH4)2SO4 0.28g，K2HPO4 1g，MgSO40.2g，CaCl20.1g，FeSO40.05g，MnSO40.02g，KH2PO41g，蒸馏水1000mL。结果发现，利用专利(申请号：201610569477.0)中的培养基条件后，细菌生物量显著减少，预处理后的水稻秸秆的酶解效果仅约为实施例中的1/2。对比说明本发明经过培养基成分和条件的筛选，得到了适合于本发明废弃生物质预处理的培养基成分和方法。

Claims (4)

1.一种利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)碳酸钠预处理：将废弃生物质按固液比为1:5-1:20(g/ml)加入浓度为2-10％的Na2CO3溶液中，静置于70-100℃恒温环境反应2-4h后，过滤分离，所得固体用超纯水清洗至pH呈中性，烘干至恒重，得到碳酸钠预处理废弃生物质；
(2)木质素降解菌强化预处理：将保藏编号为CGMCC No.4240的木质素降解菌Cupriavidus basilensis B-8接种于含碳酸钠预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养后，过滤分离所得固体，清洗，烘干，得到细菌强化碳酸钠预处理的废弃生物质；
步骤(1)所述的废弃生物质为水稻秸秆；步骤(2)所述的含碳酸钠预处理废弃生物质的无菌培养基为：碳酸钠预处理的废弃生物质5～15g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/ L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.015g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L。
2.根据权利要求1所述的利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法，其特征在于，步骤(1)将废弃生物质粉碎后20-100目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
3.根据权利要求1所述的利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法，其特征在于，步骤(2)木质素降解菌强化预处理：将木质素降解菌接种于含碳酸钠预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养1-2天后，过滤分离所得固体，用超纯水清洗3次，烘干至恒重，得到细菌强化碳酸钠预处理的废弃生物质。
4.根据权利要求3所述的利用木质素降解菌强化废弃生物质碳酸钠预处理的方法，其特征在于，步骤(2)所述的细菌培养条件为接种量5-15％，温度25-40℃，自然pH条件，培养时间1-2天。
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