CN107513545B - 一种利用木质素降解菌强化废弃生物质水热预处理的方法 - Google Patents

一种利用木质素降解菌强化废弃生物质水热预处理的方法 Download PDF

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    • C12P2201/00—Pretreatment of cellulosic or lignocellulosic material for subsequent enzymatic treatment or hydrolysis

Abstract

本发明公开了一种利用木质素降解菌强化废弃生物质水热预处理的方法，具体涉及在废弃生物质水热法预处理的基础上，利用一种木质素降解菌(Cupriavidus basilensis B‑8，保藏编号CGMCC No.4240)以及通过改善培养条件进一步去除废弃生物质中的残余木质素，极大提高酶解糖化时的可及表面。该方法使水热法预处理的酶解效率提高约56％，且具有处理时间短、操作简单、无二次污染、成本低廉等优点。

Description

一种利用木质素降解菌强化废弃生物质水热预处理的方法
技术领域：
本发明属于生物质新能源技术领域，具体涉及一种利用木质素降解菌强化废弃生物质水热预处理的方法。
背景技术：
近年来，为了降低对化石燃料的依赖，各国政府和科研机构大力开展对可再生能源的开发和研究。废弃生物质中的木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，蕴藏着巨量的碳资源，成为第二代生物质能源，是当前生物乙醇、生物塑料、生物柴油等绿色产品生物发酵最重要的碳源。木质纤维素中的纤维素是由D-葡萄糖通过β-1,4糖苷键联结而成的长链分子，长链分子进一步通过氢键等作用力形成具有高度结晶区的超分子稳定结构。同时，半纤维素和木质素紧密镶嵌在纤维素的周围。由于木质纤维素结构的复杂稳定性，如不进行任何处理，其糖化发酵效率极低。因此，预处理成为了木质纤维素开发利用的首要环节，即疏松或破坏纤维素的致密结构以及木质素和半纤维素的包裹，使纤维素、半纤维素和木质素分离，从而提高酶对纤维素的可及度和作用效率。
目前的预处理工艺主要分为物理法、化学法和生物法。其中水热法是指在高温高压下，水解离出的H+和OH-催化半纤维素的水解去除。该方法具有药耗低、环境友好、纤维素损失小和操作简单等诸多优势，成为了最主要的木质纤维素预处理方法之一。然而，水热法难以高效去除木质纤维素中的木质素成分，阻碍了酶解效率的进一步提高。真菌由于含有木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，可直接作用于木质纤维素中的木质素成分。因此，真菌法和真菌-水热联合预处理逐渐受到了关注。然而，真菌法最大的缺点就是处理时间过长(10～50天)，不利于扩大化和工业化。与真菌相比，木质素降解细菌的数量虽然较少，但可大大缩短生物处理接种时间(<7天)，因此采用细菌替代真菌进行木质纤维素预处理具有重要意义。当前，国内外尚无水热-细菌联合预处理的相关报道。
由于木质素具有天然异质性、多变性和极强的稳定性，当水热反应条件较温和时，木质素难以高效去除，不仅降低了糖纯度，也给纤维素的后续酶解和生物转化造成阻碍。若改用高强度水热条件，提高了对设备的要求，又极易造成纤维素的过度破坏和流失。因此，减弱水热预处理条件，同时利用微生物深度去除渣中残留木质素是提高废弃生物质中碳源利用和资源化产率的关键。
此外，废弃生物质秸秆也就是原生木质纤维素，不仅包括木质素，还包括纤维素和半纤维素，三者紧密结合连接；其中的原生木质素高度聚合，木质素降解细菌作用原生木质纤维素时比纯的碱木质素要更加复杂，作用难度更大，因此，找寻合适的培养基成分以及条件，最大程度的去除水热预处理渣中残留木质素也是亟待解决的问题。
发明内容：
为了解决现有废弃生物质预处理技术存在的问题，本发明提供了一种利用木质素降解菌强化废弃生物质水热预处理的方法。
本发明的技术方案为：
一种利用木质素降解菌强化废弃生物质水热预处理的方法，包括以下步骤：
(1)水热预处理：将粉碎的废弃生物质加入至水中，进行水热反应，过滤分离，所得固体清洗至pH呈中性，烘干，得到水热法预处理废弃生物质；
(2)木质素降解菌强化预处理：将保藏编号为CGMCC No.4240的木质素降解菌Cupriavidus basilensis B-8接种于含水热法预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养后，过滤分离所得固体清洗，烘干，得到细菌强化水热预处理的废弃生物质。
步骤(1)所述的废弃生物质包括：水稻秸秆，玉米秸秆，小麦秸秆，甘蔗渣或柳枝稷等
步骤(1)将废弃生物质粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
步骤(1)水热预处理：将废弃生物质按固液比为1:5-1:15(g/ml)加入至超纯水中，静置于150-200℃恒温环境中10-40min后，过滤分离，所得固体用超纯水清洗至上清澄清，烘干至恒重，得到水热法预处理废弃生物质。
步骤(2)木质素降解菌强化预处理：将木质素降解菌接种于含水热法预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养1-2天后，过滤分离所得固体用超纯水清洗3次，烘干至恒重，得到细菌强化水热预处理的废弃生物质。
步骤(2)细菌培养条件为接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)5-15％，温度25-40℃，自然pH条件，培养时间1-2天。
步骤(2)所述的含水热法预处理废弃生物质的无菌培养基为：水热法预处理废弃生物质5～10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl20.01g/L，FeSO4·7H2O 0.015g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L。
本发明提供的预处理方法的优势在于：(1)利用木质素降解菌Cupriavidusbasilensis B-8不仅能破坏木质纤维素结构，还可实现水热预处理废弃生物质中木质素和半纤维素的深度去除，处理后木质纤维素呈现出空洞状，结构变得松散，大大增加了酶解糖化时的可及表面。(2)由于木质素具有天然异质性、多变性和极强的稳定性，当水热反应条件较温和时，木质素难以高效去除，不仅降低了糖纯度，也给纤维素的后续酶解和生物转化造成阻碍。若改用高强度水热条件，提高了对设备的要求，又极易造成纤维素的过度破坏和流失。因此，减弱水热预处理条件，同时利用微生物深度去除渣中残留木质素，提高废弃生物质中碳源利用和资源化产率。(3)废弃生物质秸秆中的原生木质素高度聚合，木质素降解细菌作用时比纯的碱木质素要更加复杂，作用难度更大，本发明找寻了合适的培养基成分以及条件，最大程度的去除了酸法预处理渣中残留木质素。(4)大幅提高酶解糖化效率，相比于经单一水热法预处理的木质纤维素，酶解效率提高为原来的1.56倍。(5)具有操作简单、无二次污染、处理时间短、成本低廉等优点。
本发明所使用的木质素降解菌(Cupriavidus basilensis B-8)，保藏编号CGMCCNo.4240，是由本申请人筛选的已经做过专利保藏和专利申请的菌株。
附图说明:
图1：实施例中处理后木质纤维素糖产量变化；
图2：实施例中预处理后木质纤维素各组分变化；
图3：实施例中预处理的木质纤维素预处理前后扫描电镜分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
(2)将木质纤维素置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入超纯水，分别静置于160℃、180℃和200℃的恒温环境中30min后，过滤分离得到湿渣A。
(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣B。
(4)将保存在-80℃冰箱中的Cupriavidus basilensis B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm的光密度达到0.8-1.0)，得到Cupriavidusbasilensis B-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L。
(5)将上一步所得到的Cupriavidus basilensis B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体。
(6)将收集的Cupriavidus basilensis B-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣B培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养2天，过滤分离得湿渣C；其中干渣B培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO42.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O 0.01g，蒸馏水1L。
(7)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣C，置于60℃烘干至恒重得到干渣D。
(8)将干渣D按固液比1:40(g/ml)加入50mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)及纤维素酶12PFU/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到高纯度糖。
结果表明，与本发明条件下单一水热法相比，Cupriavidus basilensis B-8强化预处理使木质纤维素的酶解效率显著提高。例如，当水热180℃处理时，Cupriavidusbasilensis B-8的进一步作用后，酶解还原糖浓度为4.53g/L，是未处理水稻秸杆的酶解效率(1.6g/L)的2.83倍，是本发明条件下单一水热法预处理的水稻秸杆酶解效率(2.90g/L)的1.56倍，即提高了56％，效果显著(如附图1)。附图2表明，Cupriavidus basilensis B-8作用后，废弃生物质中的半纤维素和木质素含量降低，而木质素含量显著提高。扫描电镜结果表明(附图3)，Cupriavidus basilensis B-8可将水热法产生的表面颗粒状物质去除，形成大量空洞，使木质纤维素表面变得疏松多孔。另外，当水热强度较高时(200℃)，水热法本身即可产生多孔表面，此时Cupriavidus basilensis B-8会进一步对表面木质素作用使其去除，从而暴露出大量无定型纤维素，总的来说，Cupriavidus basilensis B-8处理可去除部分木质素和半纤维素，还可使木质纤维素的表面变得十分松散，极大提高了酶解过程中酶的可及表面。
对比例1
对比例1为仅用高强度水热法处理水稻秸秆，具体条件如水热温度160℃、固液比1:10、反应时间20min，在此基础上进行O2加压，当压力为0.6MPa时，所得处理渣的酶解效率是未处理的约2.64倍。实施例1中细菌强化的未加压水热法(160℃)的情况，所得处理渣的酶解效果达到了未处理的2.56倍。由此可见，本发明采用的细菌强化水热法预处理可避免采用加压等复杂的反应条件，同时还可达到较好的木质纤维素预处理效果，具有显著的技术优势。
对比例2
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法，仅包括本发明细菌Cupriavidusbasilensis B-8预处理过程，具体步骤如下：
(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重得到干渣B。
(2)将保存在LB斜面的Cupriavidus basilensis B-8菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm的光密度达到0.8-1.0)，得到Cupriavidus basilensisB-8的种子液；其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(3)将上一步所得到的Cupriavidus basilensis B-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(4)将收集的Cupriavidus basilensis B-8菌体按20％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于水稻秸秆培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养3天，过滤分离得湿渣；其中所述水稻秸秆培养基各成分配比为：干渣B 10.0g，K2HPO4 1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.01g，FeSO4·7H2O 0.015g，MnSO4·H2O0.01g，蒸馏水1L；
(5)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣，置于60℃烘干至恒重得到干渣C；
(6)将干渣C按固液比1:40(g/ml)加入50mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)及纤维素酶12PFU/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。
经本对比例预处理后的水稻秸秆的还原糖产量约为2.2g/L，略高于未处理水稻秸秆(1.6g/L)，但远远低于实施例中的还原糖产量。说明单独采用Cupriavidus basilensisB-8预处理未能达到理想效果。而本发明在水热法预处理的基础上，通过Cupriavidusbasilensis B-8的作用产生了意想不到的效果。
对比例3
本对比例中采用的木质纤维素预处理方法与实施例中的过程相同，仅将实施例步骤(6)中的大部分培养基成分改为与专利(申请号：201610569477.0)相同，以本发明实施例制备的干渣B10.0g/L，代替碱木质素1-6g，其他组分为：(NH4)2SO4 0.28g，K2HPO4 1g，MgSO40.2g，CaCl20.1g，FeSO40.05g，MnSO40.02g，KH2PO41g，蒸馏水1000mL。结果发现，利用专利(申请号：201610569477.0)中的培养基条件后，细菌生物量显著减少，预处理后的水稻秸秆的酶解效果仅约为实施例中的1/2。对比说明本发明经过培养基成分和条件的筛选，得到了适合于本发明废弃生物质预处理的培养基成分和方法。

Claims (3)

1.一种利用木质素降解菌强化废弃生物质水热预处理的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)水热预处理：将粉碎的废弃生物质按固液比为1g:5-15ml加入至超纯水中，静置于150-200℃恒温环境中10-40min后，过滤分离，所得固体用超纯水清洗至上清澄清，烘干至恒重，得到水热法预处理废弃生物质；所述的废弃生物质为水稻秸秆，
(2)木质素降解菌强化预处理：将保藏编号为CGMCCNo.4 2 4 0的木质素降解菌Cupriavidus basilensis B-8接种于含水热法预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养后，过滤分离所得固体清洗，烘干，得到细菌强化水热预处理的废弃生物质；步骤(2)所述的含水热法预处理废弃生物质的无菌培养基为：水热法预处理废弃生物质5～10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4·7H2O0.015g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L；
步骤(2)细菌培养条件为接种量5-15％，温度25-40℃，自然pH条件，培养时间1-2天。
2.根据权利要求1所述的利用木质素降解菌强化废弃生物质水热预处理的方法，其特征在于，步骤(1)将废弃生物质粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。
3.根据权利要求1所述的利用木质素降解菌强化废弃生物质水热预处理的方法，其特征在于，步骤(2)木质素降解菌强化预处理：将木质素降解菌接种于含水热法预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养1-2天后，过滤分离所得固体用超纯水清洗3次，烘干至恒重，得到细菌强化水热预处理的废弃生物质。
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