CN107034169A - 一种肠杆菌10‑17及其在产乙醇中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种肠杆菌10‑17及其在产乙醇中的应用。一种Enterobacter xiangfangensis 10‑17，已于2017年3月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017152。本菌株10‑17能利用葡萄糖、蔗糖等多种糖发酵生成乙醇，在乙醇生产领域鲜有报道。
Description
技术领域
本发明涉及一种肠杆菌，具体涉及一株从湖南省怀化市盛产的米刺葡萄表面分离得到的能利用葡萄糖、蔗糖等多种糖为原料发酵产生乙醇的Enterobacterxiangfangensis 10-17。
背景技术
刺葡萄(Vitis davidii)又被称为山葡萄，是葡萄科(vitiaceae)葡萄属植物。随着刺葡萄的栽种技术逐渐达到成熟化，在湖南凤凰、吉首、怀化等地已经有了较大的种植基地，刺葡萄的品质较好，产量较高且稳定。仅湖南省怀化市中方县葡萄的种植面积已达4.15万亩，年产量可达8.2万吨。刺葡萄的果肉晶莹剔透、质感细腻，果皮的颜色为黑紫色，含有丰富的营养物质。由于刺葡萄的果实较小，皮厚而肉甜，而不适宜鲜食，但却是酿造葡萄酒的优质原材料，由刺葡萄所酿制的红葡萄酒，颜色深红艳丽，风味品质极佳。然而目前在刺葡萄酒的发酵过程中通常采用的是活性干酵母，使得发酵过程高效并且便于控制，但也导致市场上的产品出现高度的相似化，丧失独特的风味，使得消费者逐渐失去了新鲜感。研究表明，在葡萄酒的自然发酵过程中，该种葡萄产区的微生物群体也可以参与到发酵中，使得葡萄酒有特殊的风味。目前研究者们正力求从葡萄酒的自然发酵料液中、葡萄酒厂的土壤中、葡萄的果皮果肉等多个分离源分离筛选出具有优良发酵性能的野生菌种，使适宜本地葡萄酒的发酵酿造中能酿造出风味独特、品质较佳的葡萄酒。
在酒的酿造中常用的是酵母菌，利用酵母菌生产乙醇的优点是乙醇得率高，转化率高，受污染的危险小，副产物生成少。缺点是基质的利用范围窄，菌体生成量多。近年来有研究表明不少细菌在好氧或厌氧的条件下能产生乙醇，并且可利用的基质较为广泛，其优点是可直接发酵淀粉和纤维素，葡萄糖为原料时转化率很高，发酵时的菌体生成量少，容易保持无菌状态，能够进行真空发酵等。缺点是有机酸生成较多、耐酒精度低、酒精得率中等、耐酸能力不强等。随着对细菌产乙醇的研究及应用的发展，将细菌投用于生产乙醇的研究越来越多，并且发现在工业运用方面具有潜在的应用价值，如用于燃料乙醇、酶制剂以及酒类生产等。如今，无论是将产乙醇细菌应用于饮料酒生产过程中，还是对菌种进行诱变改良或者基因工程改良以提高乙醇得率、耐酸能力等问题，首先都是建立在筛选出具有产乙醇潜质的细菌的基础上。因此，筛选及发现能够发酵产生乙醇的细菌并对其进行改良对今后葡萄酒酿造业的发展及微生物研究应用具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对目前在葡萄酒酿造过程中使用活性干酵母而造成独特风味缺失的不足，而野生菌种经过自然选择在酿造本地葡萄酒时具有优势，而提供一种可利用葡萄糖或蔗糖等发酵产生乙醇的肠杆菌10-17。
本发明所述的肠杆菌10-17，其分类命名为Enterobacter xiangfangensis 10-17，已于2017年3月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2017152。
将本发明菌株10-17接种到含糖源(如葡萄糖、蔗糖或麦芽糖)的发酵培养基中进行发酵培养，能产生乙醇。发酵培养的条件为：接种量为4-6％、温度为27-29℃、时间为24-48h。表明该菌株10-17能利用葡萄糖、蔗糖等多种糖发酵生成乙醇。该株细菌10-17在乙醇生产领域鲜有报道，本发明为首次发现Enterobacter xiangfangensis具有产乙醇的能力。
附图说明
图1是本发明菌株的菌落形态图。
图2是本发明菌株的菌体形态(100×)图。
图3是本发明菌株的生长曲线图。
图4是本发明菌株16SrDNA PCR扩增电泳图。
图5是本发明菌株的系统发育树。
图6是本发明菌株不同时间的甲基红实验结果图。
具体实施方式
实施例1
以湖南省怀化市内盛产的湘酿1号、紫葡萄、米刺葡萄和高山刺葡萄这四种刺葡萄为筛选原料，在刺葡萄的种植园中随机摘取不同植株不同部位的新鲜成熟的刺葡萄果实后进行标记，并将其保存于低温环境中运输至实验室4℃保藏。对四种刺葡萄进行果实表面菌种分离，分别取25g新鲜完整的葡萄果实放入225ml的已灭菌的生理盐水中，在24℃40KHz的超声清洗器中超声2min制成混浊液。分别取1ml的混浊液以10倍递增稀释后，从10-5、10-6、10-7这三个梯度的稀释液中取100μL均匀涂布在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，于28±1℃倒置培养3-5d。观察菌落生长情况，挑取具有典型特征的菌落进行革兰氏染色后镜检，鉴别菌落为细菌或真菌并进行平板反复划线纯化后，将其接到斜面培养基中保藏。
将斜面培养基上保藏的菌株用无菌水以10倍递增稀释，取10-4的梯度稀释液100μL分别接至TTC底层培养基(即马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上并且均匀涂布，在28℃恒温条件下倒置培养48h，待菌落充分长成后，缓慢倒入一层较薄的TTC上层培养基将底层培养基完全覆盖，然后在28℃条件下培养48h，观察菌落生长情况及菌落颜色的变化。初步选择在培养相同时间后菌落颜色较深的菌株。
将选择的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行划线，于28℃的恒温培养箱中培养3d，然后将活化后的菌种在无菌条件下分别挑取两环接种于3瓶每瓶30ml的发酵培养基中，以在28℃条件下发酵48h后测定的发酵液中的乙醇含量进行复筛以筛选出发酵能力最好的菌株，实验设置3个重复，即得本发明菌株。
实施例2
1.将实施例1筛选得到的本发明菌株10-17在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上划线，28℃培养3d，菌落呈规则的圆形，白色，菌落表面光滑且凸起，菌落直径达1.5mm-2.0mm，菌落形态如图1所示。革兰氏染色并拍照。在油镜下观察到本发明菌株的菌体形态如图2所示，菌体形态特征见下表1，菌株呈短杆状，革兰氏阴性。
表1本发明菌株的菌体形态特征
| 菌种 | Enterobacter xiangfangensis 10-17 |
| 大小(长×宽，单位μm) | 0.8-1×1-1.5μm |
| 形状 | 杆状 |
| 芽孢 | 无 |
| 革兰氏染色 | - |
| 运动性 | + |
注：“-”代表阴性，“+”代表阳性。
2.本发明菌株的生长曲线如图3所示。
3.本发明菌株的生理生化鉴定过程及结果如下所示：
3.1碳源同化试验
采用的碳源有：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、鼠李糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、柠檬酸、可溶性淀粉、甘露醇、纤维二糖、山梨醇、棉子糖。
将12.5％的豆芽汁培养基进行分装，每只试管中装入10ml豆芽汁培养基，并于121℃灭菌20min，待培养基冷却至40-50℃时，加入625μL 10％的无菌糖溶液。然后将本发明菌株10-17进行活化后，按照5％的接种量接入到已准备好的豆芽汁培养基中，28℃培养3-5d，观察是否出现浑浊，如果培养基出现浑浊则为阳性，反之则为阴性。以不含糖的试管为阴性对照管，设置三个重复。实验结果见表2。
表2碳源同化试验
注：“+”表示培养基中出现浑浊；“-”表示培养基中无浑浊。
3.2氮源同化试验
采用的氮源有：L-赖氨酸、硝酸钾、亚硝酸钠、硝酸铵、天门冬素。在无氮培养基上分别加入以上氮源作为培养基的唯一氮源，加入量为0.078％(w/w)，并于115℃灭菌20min。按5％的接种量将以活化的本发明菌株10-17接入已制备好的培养基中，于28℃培养48h。实验设置三个重复，以不加入氮源的无氮培养基作为阴性对照。根据本发明菌株在不同氮源培养基上生长情况，判断氮源是否能够被本菌株同化。实验结果见表3。
表3氮源同化试验
注：“+”表示培养基上有菌落长成；“-”表示培养基上无菌落长成。
3.3甲基红试验
挑取少量新鲜的本发明菌株10-17接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中，于28℃恒温培养3-5d，从第48h后每日取培养液加入甲基红试剂1-2滴，立即观察现象。直至发现阳性或第5天仍为阴性即可判定结果。滴入指示剂，呈鲜红色或橘红色为阳性；橘黄色或黄色为阴性“-”，实验结果见图6。
3.4耐乙醇试验
向带有杜氏小管且已灭菌的发酵培养基中添加乙醇，使发酵培养基中的乙醇浓度(v/v)达到10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，混匀后接入已活化好的本发明菌株10-17，28℃培养2-3d，观察菌体生长情况和产气情况。通过试验结果缩小耐受限值范围，并再进行试验确定。实验结果见表4、表5。
表4本发明菌株10-17在不同体积分数乙醇中的产气情况
注：“-”表示不产气，“+”表示产气量为杜氏小管的1/5，“++”表示产气量为杜氏小管的2/5，“+++”表示产气量为杜氏小管的3/5，“++++”表示产气量为杜氏小管的4/5，“+++++”表示气体量充满杜氏小管。
表5乙醇耐受限度
注：“-”表示不产气，“+”表示产气量为杜氏小管的1/5。
3.5耐高渗透压试验
将经过隔夜活化的本发明菌株10-17划线接种于糖浓度(v/v)为25％、30％、35％、40％、45％的PDA培养基上，放置于28℃恒温培养箱中培养4周，进行检查。实验过程中需采取蜡纸封口等措施预防培养基干燥。实验结果见表6。
表6高渗透压试验
注：“-”表示无菌落长成，“+”表示有菌落长成。
4.采用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取本发明菌株的DNA，对提取的DNA以通用引物27-F/1492-R进行PCR扩增16SrDNA，得到片段长度为1502bp的16SrDNA片段，如图4所示。委托武汉华联科生物技术有限公司完成16SrDNA测序，获得DNA测序结果。将测序得到的基因序列在NCBI上进行BLAST比对，从中选取同源性高的菌株，再使用MEGA7.0软件，使用邻接法构建系统进化树(见图5)。经形态观察、生理生化反应和16S rDNA分子鉴定，确定本菌株为Enterobacter xiangfangensis，命名为Enterobacter xiangfangensis 10-17。
实施例3
将本发明菌株10-17在无菌条件下接种5％于3瓶每瓶30ml的发酵培养基(以葡萄糖为糖源)中，在28℃条件下发酵48h后测定发酵液中的乙醇含量，实验设置3个重复。结果显示，三个重复实验的测定结果为10.0(v/v)、10.7(v/v)、11.3(v/v)，所以其发酵液中乙醇体积分数可达到10.67％(v/v)。表明，本发明菌株10-17能发酵葡萄糖生产乙醇。
乙醇含量的测定方法：在无菌条件下，从3瓶发酵培养基中各取10ml的发酵液，采用直径为13mm孔径为0.22μm的水系微孔滤膜进行过滤除菌，将滤液装入已灭菌的离心管中待测。采用手持酒精浓度计(LAL1T)对滤液的酒精浓度进行测定，先用蒸馏水对酒精计进行校准后再进行测定，将3个重复试验的结果记录后计算平均值，得出乙醇含量。
本说明书中提及的培养基如下：
(1)TTC上层培养基：胰蛋白胨17.0g，大豆胨3.0g，葡萄糖6.0g，氯化钠2.5g，硫代硫酸钠0.5g，琼脂15g，L-胱氨酸-盐酸0.25g，维生素K 1g，亚硫酸钠0.1g，TTC 0.5g，蒸馏水1000ml。
(2)TTC底层培养基(即马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：马铃薯浸出粉300g，葡萄糖20g，琼脂15g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml，最终pH6.0±0.2。
(3)发酵培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
(4)12.5％豆芽汁培养基：称取125g黄豆芽放入1L水中，煮沸0.5h后冷却过滤至1000ml容量瓶中，并补充蒸馏水至1L，即成12.5％豆芽汁,并在121℃灭菌20min。
(5)无氮培养基：葡萄糖10g，磷酸二氢钾0.2g，七水合硫酸镁0.2g，二水合硫酸钙0.2g，琼脂20g，碳酸钙0.2g，蒸馏水1000ml。
(6)缓冲葡萄糖蛋白水：磷酸二氢钾5g，多胨7g，葡萄糖5g，蒸馏水1000ml，矫正pH为7.0。
Claims (6)
1.一株Enterobacter xiangfangensis 10-17，保藏编号为CCTCC NO：M2017152。
2.权利要求1所述的菌株在发酵葡萄糖、蔗糖或麦芽糖生产乙醇中的应用。
3.一种利用糖源进行发酵生产乙醇的发酵液的制备方法，其特征在于，该方法是将权利要求1所述的菌株接种到含糖源的发酵培养基中进行发酵培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述糖源为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖或蔗糖或麦芽糖20g、及蒸馏水1000ml，pH6.5-7.0。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：接种量4-6％、温度27-29℃、时间24-48h。
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