CN1070002A - 药物 - Google Patents
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Abstract
一种制备中间体的方法，该中间体可用于制备具
有抗病毒活性的化合物。
Description
本发明涉及制备一种中间体的方法，该中间体可用于制备具有抗病毒活性的化合物。
EP-A-141927（Beecham集团公司）描述了化合物戊环佛尔（penciclovir）及其作为抗病毒剂的应用;EP-A-182024（Beecham集团公司）描述了其前药芬环佛尔（fam-ciclovir）。戊环佛尔和芬环佛尔分别具有式（A）和式（B）：
上述化合物的制备方法涉及式（C）的2-氨基-6-氯嘌呤与式（D）的侧链中间体的反应：
其中Q是一个离去基团，例如羟基或卤素（如碘或溴）。
式（D）的侧链中间体不易得到，是用一种多步合成法制得的。如果式（D）化合物中Q被乙酰氧基置换，即成为式（Ⅰ）化合物，则该化合物可以由市售的1，1，2-乙烷三羧酸三乙酯用经过修改的文献方法（W.J.Bailey等，J.Org.Chem.，1962）来制备，但是不可能将三个乙酰氧基之一选择性地转化为离去基团，因为这几个乙酰氧基均处于相似的化学环境中，因此化学水解法不大可能区分这些官能团。
现已发现了一种用微生物水解酶将式（Ⅰ）的三乙酸酯化合物转化成式（Ⅱ）的二乙酸酯的新方法。
因此，本发明提供一种制备如前面所限定的式（Ⅱ）化合物的方法，该方法包括用一种微生物水解酶处理如前面所限定的式（Ⅰ）化合物。
合适的微生物水解酶存在于包括青霉属和杆菌属在内的微生物中，特别是常现青霉（Penicillium frequentans）IMI 92265。
根据所用微生物的本性，将微生物培养在营养肉汤或其它合适的培养基中，培养温度为10-50℃，优选20-40℃左右。反应可在该培养基内进行，也可在分离和转移细胞后在替换培养基或盐溶液中进行。另外，也可以在将细胞破碎并分级分离后使用纯化的或部分纯化的酶。
进行反应时的pH在3-10范围内，优选5.0-8.0，反应温度通常为10-40℃或20-40℃。
在硫酸铵（优选1M）存在下，酶转化反应的产率可以得到改进。
一般来说，细胞结合形式和无细胞形式的酶可进行固定化和再利用。在使用常现青霉IMI 92265的情况下，可进行多次再利用而不明显失活。底物浓度可以提高到1%（W/V）或更高。因此可以设想出一种连续的生产方法，即，使底物通过装在柱式环形反应器或类似反应器中的固定化酶。
通过用适宜的溶剂萃取来纯化产物，而后可以视需要而进行层析。
该方法的优点在于，生成式（Ⅲ）副产物的量最小。
下列实施例说明本发明。应该认识到，通过用已知技术对微生物进行菌株改良，可以提高反应产率。
实施例1
常现青霉IMI 92265的培养
从常现青霉IMI 92265斜面取两环菌丝体，混入4ml 0.02%吐温80水溶液中，用2ml该悬浮液接种装在250ml锥形瓶中的40ml种子培养基。种子培养基含有（W/V）玉米浆（4%）、糖浆（2.6%）、CaCO3（0.5%）和酒糟（Scotafeed）（2%），该培养基用去离子水配制，调至pH5.2。于28℃下以240转/分震荡72小时后，用1.5ml种子培养液接种装在250ml锥形瓶中的40ml生产培养基。此培养基含有（W/V）葡萄糖（3%）、营养肉汤（0.8%）、酵母提取物（0.2%）和麦芽汁（0.3%），用去离子水配制，调至pH5.6。将这些锥形瓶于28℃下以240转/分震荡培养72小时。
实施例2
用完整常现青霉IMI 92265细胞进行区域选择性酯水解
在实施例1得到的常现青霉IMI 92265培养摇瓶中，加入式（Ⅰ）的三乙酸酯，使底物最终浓度达到4mg/ml。然后于28℃下将摇瓶以240转/分震荡，离心，用氯仿萃取上清液，最后对产物进行分析。用高效液相色谱法分析有机相。
底物与微生物一起保温6小时后，表明底物转化为二乙酸酯产物（Ⅱ）的转化率为15%，产物（Ⅱ）与其区域异构体（Ⅲ）之比为91∶9。保温9小时后，表明生成产物的转化率为6%，产物（Ⅱ）与其区域异构体（Ⅲ）之比为97∶3。
实施例3
从常现青霉IMI 92265中提取和部分纯化区域选择性酯酶
取1.6升实施例1得到的常现青霉IMI92265培养液，冷却至4℃后，离心（16，000×g，10分钟，4℃）分离出菌丝体。将生物量重新悬浮于PH7.5的0.1M Tris缓冲液中使体积为650ml，以60ml细胞浆为一批，将细胞分批用法式压榨机（1250磅/平方英寸）破碎。离心（23，000×g，20分钟，4℃）后，加入1M氢氧化钠溶液将上清液调至PH7.1，并在搅拌下加入3.65g硫酸链霉素的5ml水溶液。在0℃下放置0.5小时后，将细胞提取液离心（39，000×g，20分，4℃），在分离出的上清液中于搅拌的同时加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到60%。于0℃下放置15分钟后离心（23，000×g，10分钟，4℃），然后如上所述使分离出的上清液达到80%硫酸铵饱和。于0℃下放置15分钟后如前所述再次离心，分离出上清液后留下一种沉淀物，将该沉淀物溶解于7.5ml 25mM Tris缓冲液（PH7.5）中。该溶液用葡聚糖凝胶PD10柱按制造厂家的说明书进行脱盐，用25mM Tris缓冲液（PH7.5）洗脱。在脱盐后的蛋白制备物中补加去离子水使体积达到20ml，并将其加到用25mM Tris缓冲液（PH7.5）预平衡的阴离子交换树脂柱（DEAE-Trisacryl，7.5×1.8cm）上。用该平衡缓冲液进行洗脱，再用0-300mM硫酸铵在相同缓冲液中的溶液以线性梯度洗脱8小时。
用下列方法测定各柱级分的酯酶活性：使250μl蛋白柱级分与250μl浓度为4mg/ml的三乙酸酯（Ⅰ）溶液一起保温，三乙酸酯（Ⅰ）溶液用含有0.4M硫酸铵的0.2M Tris缓冲液（PH7.5）配制。在室温下保温18小时后，将溶液用125μl氯仿萃取，氯仿萃取液用高效液相色谱法进行分析。分离出两个蛋白级分，其中由（Ⅰ）生成产物（Ⅱ）的转化率为80%，并且在二乙酸酯（Ⅱ）和（Ⅲ）的混合物中区域异构体（Ⅲ）的比例均未超过11%。蛋白柱级分根据需要用超滤法浓缩，用M.M.Bradford的方法（Anal.Biochem.，72：248-254，1974）测定蛋白浓度。
实施例4
用常现青霉IMI92665的酶制备物进行区域选择性酯水解
在125μl用1.2M Tris缓冲液（PH 7.5）配制的4mg/ml三乙酸酯（Ⅰ）溶液中，加入250μl实施例3所述的蛋白浓度为2.67mg/ml的酶制备物，以及125μl用12mM Tris缓冲液（PH 7.5）配制的4M硫酸铵溶液。小心混合后，将反应液于20℃下保温4小时，然后用125μl氯仿萃取产物并用高效液相色谱法进行分析。测得底物（Ⅰ）转化为二乙酸酯（Ⅱ）的转化率为97%，产物（Ⅱ）与其区域异构体（Ⅲ）的比例为95∶5。
实施例5
硫酸铵对酶促酯水解的影响
用实施例3所述的步骤制得蛋白浓度为3.56mg/ml的酯酶制备物。从该制备物中取一份250μl的试样，分别加到两个5mg三乙酸酯（Ⅰ）和125μl 4M硫酸铵在12mM Tris缓冲液（PH 7.5）中的溶液的混合物中，在另一个反应液中加入125μl 12mM Tris缓冲液（PH 7.5）。
于20℃下小心混合19小时后，各反应液用250μl氯仿萃取，用高效液相色谱法分析有机相。在硫酸铵存在下进行的反应表明，三乙酸酯（Ⅰ）生成二乙酸酯（Ⅱ）的转化率为71%，而在没有硫酸铵存在时该转化率为28%。在有硫酸铵存在时，二乙酸酯（Ⅱ）与其区域异构体（Ⅲ）的比例为94∶6，而在没有硫酸铵存在时，该比例为82∶18。
实施例6
用溴化氰活化的琼脂糖固定酯酶
按实施例3的方法制备蛋白浓度为1.74mg/ml的酶制备物，取1.25ml该制备物与1.25ml“偶联缓冲液”（0.1M碳酸氢钠和0.5M氯化钠的溶液，PH 8.3）混合。将此溶液在葡聚糖凝胶PD10柱上进行层析，得到3.5ml已去除Tris缓冲剂的酶溶液。
将此溶液加到0.6ml按制造厂商的说明书预先用溴化氰活化的琼脂糖4B中。混合2小时后令凝胶沉降，弃去上清液。在凝胶中加入4ml用“偶联缓冲液”配制的0.1M甘氨酸，该悬浮液在室温下再混合1.5小时。然后将凝胶依次用“偶联缓冲液”、含0.5M氯化钠溶液的0.4M乙酸盐缓冲液（PH 4.0）和“偶联缓冲液”洗涤。凝胶于4℃下悬浮贮存。
实施例7
固定化区域选择性酯酶的反复使用
如实施例6所述制备凝胶固定化酶，每毫升凝胶固定5mg蛋白，取144ml固定化酶用等体积的含1M硫酸铵的0.1M Tris缓冲液（pH7.5）洗涤。在凝胶中加入72ml 4M硫酸铵溶液和600mg三乙酸酯（Ⅰ）在72ml 0.4M Tris缓冲液（pH7.5）中的溶液。
将反应混合物于14℃下振荡5小时，然后离心并除去上清液。固定化酶制备物进一步用含有1M硫酸铵的0.1M Tris缓冲液（pH 7.5）洗涤，上清液合并后用氯仿萃取，干燥并蒸发后得到403mg澄清油状物。经证实，此油状物中所含的（Ⅱ）和（Ⅲ）的比例为94∶6。
将固定化酶重新悬浮于含有1M硫酸铵的0.1M Tris缓冲液（pH7.5）中，并于4℃下贮存。同一批固化定酶如上所述再使用8次，每一次都得出类似的结果。
取一份凝胶固定化酶试样，在上述条件下使用16次，用高效液相色谱法检测不到活性或区域选择性的下降。
实施例8
用苯基琼脂糖固定酯酶
在600μl固体苯基琼脂糖CL-4B凝胶中，加入625μl 4M硫酸铵溶液和625μl 0.4M Tris缓冲液（pH7.5）。向其中加入1.25ml如实施例3制备的蛋白浓度为1.74mg/ml的酶制备物。将该悬浮液在室温下小心混合30分钟，离心，凝胶用4ml 1M硫酸铵在0.1M Tris缓冲液（pH7.5）中的溶液洗涤两次。
Claims (5)
1、一种制备式(Ⅱ)化合物的方法：
该方法包括，用一种微生物水解酶处理式(Ⅰ)化合物。
2、根据权利要求1的方法，其中微生物水解酶来自青霉属和杆菌属。
3、根据权利要求2的方法，其中微生物水解酶来自常现青霉IMI92265。
4、根据权利要求1-3中任一项的方法，其中反应在硫酸铵存在下进行。
5、根据权利要求1-4中任一项的方法，其中酶被固定化并以连续生产方法再利用。
Priority Applications (1)
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| CN 91108598 CN1070002A (zh) | 1991-08-31 | 1991-08-31 | 药物 |
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Publications (1)
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| CN1070002A true CN1070002A (zh) | 1993-03-17 |
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Country Status (1)
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| CN (1) | CN1070002A (zh) |
-
1991
- 1991-08-31 CN CN 91108598 patent/CN1070002A/zh active Pending
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