CN106986819A - 酪氨酸酶抑制剂及其制备法和用途 - Google Patents

酪氨酸酶抑制剂及其制备法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有酪氨酸酶抑制活性的含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物，其制备方法为：将曲酸的5位羟基苄基化，然后与氨水或含不同碳链长度的脂肪胺反应，再经活性二氧化锰将2‑位羟甲基选择性氧化，得到2‑位为醛基的吡啶酮衍生物；O‑烷基羟胺与2‑位含醛基的吡啶酮衍生物发生缩合反应，再经盐酸脱苄基后得到含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物。其能用作酪氨酸酶抑制剂。

Description

酪氨酸酶抑制剂及其制备法和用途
技术领域
本发明涉及一类酪氨酸酶抑制剂及其制备方法，该类化合物为含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物，即为具有酪氨酸酶抑制活性的含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物。
背景技术
酪氨酸酶(Tyrosinase，EC.1.14.18.1)是一种含酮的金属酶，同时兼有单酚酶和二酚酶生物活性，广泛分布于动、植物和微生物中。在动物、微生物中多被称为酪氨酸酶，在植物中多被称为多酚氧化酶。据目前研究所知，酪氨酸酶是生物体中参与黑色素代谢的关键酶，不仅决定着黑色素合成的速率，而且标志着黑色素细胞分化成熟程度。此外，其在生物体中也具有重要的生理功能，除了形成动物皮肤中的保护性黑色素；还与昆虫的伤口愈合与发育、以及果蔬与海鲜类产品的褐变密切相关。酪氨酸酶抑制剂大多具有清除自由基、抗氧化、延缓衰老的能力，因此，近年来多种酪氨酸酶抑制剂作为美白剂已陆续应用于化妆品中。此外，酪氨酸酶抑制剂还可用于治疗黑色素代谢异常引起的疾病(如黑色素瘤、白癜风、白化病、阿尔茨海默病等)。酪氨酸酶抑制剂还可通过抑制或破坏昆虫体内的酪氨酸酶活性来抑制昆虫的正常发育，从而间接达到杀死害虫的能力。综上所述，酪氨酸酶抑制剂在美容保健、疾病治疗、虫害防治、食品保鲜等领域有着广泛的应用前景。
对酪氨酸酶及抑制剂的研究涉及生物、医学、农学、化学、药学等多个学科和领域，寻求新的酪氨酸酶抑制剂是药物化学家和食品科学家高度关注的研究课题之一。目前已得到确认的酪氨酸酶抑制剂很多，如：植物多酚(类黄酮、没食子酸、查耳酮类、芪类等)，高等植物中的一些醛类化合物(枯茗醛、肉桂醛等)，一些真菌代谢物(曲酸等)，合成的抑制剂(卡托普利，4-取代间苯二酚等)等。但由于各种各样的缺点，如活性不够、有较大毒性、价格较高等，目前得到应用的酪氨酸酶抑制剂非常有限。因此，研究安全、高效、价格低廉、有我国自主知识产权的酪氨酸酶抑制剂是迫切需要的。
羟基吡啶酮是一类对三价铁具有很强亲合性的螯合剂，在医药领域具有广泛的应用前景。羟基吡啶酮由于对铜离子有较强的螯合能力，能通过夺取酪氨酸酶活性中心的铜离子而对酶具有抑制作用，但羟基吡啶酮环上的取代基及取代位置对其抑制酶活性具有很大影响。
目前现有的具有较强酪氨酸酶抑制活性的羟基吡啶酮衍生物的结构式为：
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种酪氨酸酶抑制剂(即，含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物)及其制备方法，该类化合物具良好的酪氨酸酶抑制活性。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物，其结构通式为：
化合物1中：R为H、CnH2n+1(n＝1-12)、取代烃基；R’＝CnH2n+1(n＝1-6)。
作为本发明的含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物的改进，其结构式为如下任意一种：
本发明还同时提供了上述含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物的制备方法。化合物1的合成依次包括以下步骤：
1)、将曲酸的5位羟基苄基化，然后与氨水或含不同碳链长度的脂肪胺反应，再经二氧化锰氧化，得到2号位含醛基的吡啶酮衍生物；
2)、O-烷基羟胺盐酸盐与2号位含醛基的吡啶酮衍生物发生缩合反应，再经盐酸脱苄基后得到含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物1。
本发明还同时提供了上述羟基吡啶酮衍生物的用途：用作酪氨酸酶抑制剂。
本发明的含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物由于具有酪氨酸酶抑制活性，因此能用于化妆品或食品的保鲜。
其用法和用量可参照上述羟基吡啶酮衍生物。
本发明的羟基吡啶酮化合物较曲酸衍生物有更好的稳定性。羟基吡啶酮环由于存在共振结构，故具有芳香性，其稳定性比没有芳香性的曲酸中的环要高得多。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为化合物1(a-f)对单酚酶的抑制作用对比图；
图2为化合物1e和1f对二酚酶的抑制作用对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、化合物1a-1f的合成：
以曲酸为原料合成化合物1a-1f的路线如Scheme1所示。
化合物3的合成是以曲酸(2)为原料并按文献报道方法合成(Design andsynthesis of hydroxypyridinone-L-phenylalanine conjugates as potentialtyrosinase inhibitors.Journal of Agricultural and Food Chemistry 2013,61(27),6597-6603)。
A、化合物4的合成
1)、化合物4a-4c的合成
取10g化合物3加入17mL无水乙醇，边搅拌边油浴加热回流，之后量取83mL氨水(质量浓度25-28％)注入其中，于60℃反应过夜，用TLC检测反应进程。待反应结束后(反应时间为12小时)，冷却至室温放置，沉淀析出，过滤收集沉淀，然后沉淀用少量乙醚洗涤2次，干燥得到产物4a。产率76％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:4.34(d,J＝5.5Hz,2H,CH2),5.01(s,2H,CH2),5.58(s,1H,吡啶酮环中C3-H),6.10(s,1H,吡啶酮环中C6-H),7.30-7.43(m,5H,Ph).ESI-MS:m/z 232([M+H]+)。
2)、化合物4b-4f的合成按文献报道方法合成(Design and synthesis ofhydroxypyridinone-L-phenylalanine conjugates as potential tyrosinaseinhibitors.Journal of Agricultural and Food Chemistry 2013,61(27),6597-6603)。
B、化合物5的合成
称取20mmol化合物4(4a-4f)溶于100mL二氯甲烷，再加入0.16mol二氧化锰，此混合体系在搅拌条件下于50℃油浴加热回流反应72-96h，TLC点板检测反应进程。待反应结束后，抽滤除去二氧化锰，蒸去溶剂得化合物5。
5-苄氧基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛(5a):产率60.6％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:5.31(s,2H,CH2),7.34-7.49(m,6H,Ph和吡啶酮环中C3-H),8.42(s,1H,吡啶酮环中C6-H),9.25(s,1H,CHO).ESI-MS:m/z 230(MH+)。
5-苄氧基-1-甲基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛(5b)：产率72.3％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:2.49(s,3H,CH3),5.28(s,2H,CH2),7.00(s,2H,吡啶酮环中C-3H和C-6H),7.29-7.45(m,5H,Ph),9.75(s,1H,CHO).ESI-MS:m/z 244(MH+)。
5-苄氧基-1-乙基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛(5c)：产率74.4％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:1.27(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),4.24(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),5.25(s,2H,CH2),7.00(s,2H,吡啶酮环中C-3H和C-6H),7.29-7.40(m,5H,Ph),9.59(s,1H,CHO)。ESI-MS:m/z 258(MH+)。
5-苄氧基-1-丁基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛(5d)：产率75.8％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:0.86(t,J＝7.5Hz,3H,CH3),1.13-1.21(m,2H,CH2),1.51-1.57(m,2H,CH2),4.18(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),5.25(s,2H,CH2),6.96(s,1H,吡啶酮环中C-3H),6.97(s,1H,吡啶酮环中C-6H),7.30-7.40(m,5H,Ph),9.58(s,1H,CHO)。ESI-MS:m/z 286(MH+)。
5-苄氧基-1-己基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛(5e)：产率76.4％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:0.87(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),1.23(m,6H,CH2),1.56(m,2H,CH2),4.17(t,J＝7.0Hz,2H,CH2),5.26(s,2H,CH2),6.97(s,1H,吡啶酮环中C3-H),6.99(s,1H,吡啶酮环中C6-H),7.30-7.41(m,5H,Ph),9.58(s,1H,CHO)。ESI-MS:m/z 314(MH+)。
5-苄氧基-1-辛基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛(5f)：产率77.5％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:0.88(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),1.17-1.28(m,10H,5CH2),1.56(m,2H,CH2),4.17(t,J＝7.0Hz,2H,CH2),5.26(s,2H,CH2),6.97(1H,吡啶酮环中C-3H),6.98(s,1H,吡啶酮环中C-6H),7.30-7.41(m,5H,Ph),9.58(s,1H,CHO)。ESI-MS:m/z 342(MH+)。
C、化合物6的合成
称取5mmol化合物5(5a-5f)溶于40mL乙醇水溶液(乙醇：水＝1:1的体积比)中，再加入15mmolO-乙基羟胺盐酸盐，冰浴条件下搅拌至上述固体全部溶解，逐滴滴加9mL氢氧化钾溶液(2mol/L)，滴加完毕后撤去冰浴，室温下搅拌2-3h，TLC点板检测反应进程。待反应结束后，旋蒸除去乙醇，用二氯甲烷萃取2-3次，合并有机层，用饱和食盐水洗涤2次，用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸去溶剂，残留物用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷/甲醇15:1，体积比)，得化合物6。
备注说明：
1)、当R基团为H时，所得产物为6a，柱层析纯化的具体步骤为：以二氯甲烷/甲醇(15:1的体积比)作为洗脱液；收集Rf＝0.35的溶液，蒸去溶剂得到6a。
2)、当R基团为CH3时，所得产物为6b，柱层析纯化的具体步骤为：以二氯甲烷/甲醇(15:1的体积比)作为洗脱液；收集Rf＝0.45的溶液，蒸去溶剂得到6b。
3)、当R基团为C2H5时，所得产物为6c，柱层析纯化的具体步骤为：以二氯甲烷/甲醇(15:1的体积比)作为洗脱液；收集Rf＝0.52的溶液，蒸去溶剂得到6c。
4)、当R基团为n-C4H9时，所得产物为6d，柱层析纯化的具体步骤为：以二氯甲烷/甲醇(15:1的体积比)作为洗脱液；收集Rf＝0.60的溶液，蒸去溶剂得到6d。
5)、当R基团为n-C6H13时，所得产物为6e，柱层析纯化的具体步骤为：以二氯甲烷/甲醇(15:1的体积比)作为洗脱液；收集Rf＝0.63的溶液，蒸去溶剂得到6e。
6)、当R基团为n-C8H17时，所得产物为6f，柱层析纯化的具体步骤为：以二氯甲烷/甲醇(15:1的体积比)作为洗脱液；收集Rf＝0.63的溶液，蒸去溶剂得到6f。
5-苄氧基-4-氧-1,4--二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(6a):Rf＝0.35，产率71.4％.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:1.24(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),4.16(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),5.14(s,2H,CH2),7.31-7.46(m,5H,Ph),7.97(s,1H,CH).ESI-MS:m/z 273(MH+)。
5-苄氧基-1-甲基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(6b)：Rf＝0.45，产率64.4％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:1.31(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),3.68(s,3H,CH3),4.24(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),5.20(s,2H,CH2),6.66(s,1H,吡啶酮环中C-3H),6.93(s,1H,吡啶酮环中C-6H),7.29-7.42(m,5H,Ph),7.91(s,1H,CH)。ESI-MS:m/z 287(MH+)。
5-苄氧基-1-乙基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(6c)：Rf＝0.52，产率60.7％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:1.26(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),1.30(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),4.00(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),4.23(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),5.19(s,2H,CH2),6.65(s,1H,吡啶酮环中C-3H),6.93(s,1H,吡啶酮环中C-6H),7.27-7.41(m,5H,Ph),7.90(s,1H,CH).ESI-MS:m/z 301(MH+)。
5-苄氧基-1-丁基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(6d)：Rf＝0.60，产率71.3％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:0.87(t,J＝7.5Hz,3H,CH3),1.12-1.22(m,2H,CH2),1.31(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),1.50-1.61(m,2H,CH2),3.93(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),4.23(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),5.21(s,2H,CH2),6.68(s,1H,吡啶酮环中C-3H),6.89(s,1H,吡啶酮环中C-6H),7.27-7.41(m,5H,Ph),7.90(s,1H,CH).ESI-MS:m/z 329(MH+)。
5-苄氧基-1-己基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(6e)：Rf＝0.63，产率62.9％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:0.87(t,J＝7.5Hz,3H,CH3),1.10-1.27(m,6H,3CH2),1.31(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),1.51-1.62(m,2H,CH2),3.92(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),4.23(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),5.21(s,2H,CH2),6.66(s,1H,吡啶酮环中C-3H),6.90(s,1H,吡啶酮环中C-6H),7.27-7.41(m,5H,Ph),7.90(s,1H,CH).ESI-MS:m/z 357(MH+)。
5-苄氧基-1-辛基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(6f)：Rf＝0.65，产率74.0％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:0.87(t,J＝7.5Hz,3H,CH3),1.10-1.27(m,10H,5CH2),1.30(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),1.52-1.61(m,2H,CH2),3.90(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),4.22(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),5.19(s,2H,CH2),6.65(s,1H,吡啶酮环中C-3H),6.90(s,1H,吡啶酮环中C-6H),7.25-7.40(m,5H,Ph),7.88(s,1H,CH)。ESI-MS:m/z 385(MH+)。
D、化合物1的合成
取1mmol化合物6(6a-6f)溶于2mL甲醇，加入3mL盐酸溶液(3M)，此混合体系在搅拌条件下于100℃油浴回流反应，TLC板点板检测反应进程。反应后处理方式如下：
1)、当R基团为H、CH3、C2H5时，反应体系需要油浴加热回流约36h，待反应结束后，冷却至室温，用二氯甲烷萃取，有机相出现悬浮固体，旋蒸除去溶剂，所得产物分别为1a、1b、1c。
2)、当R基团为n-C4H9、n-C6H13时，反应体系需要油浴加热回流48h，待反应结束后，冷却至室温，用二氯甲烷萃取2-3次，合并有机相，旋蒸除去二氯甲烷后，所得产物分别为1d、1e。
3)、当R基团为n-C8H17时，反应体系需要油浴加热回流约72h，待反应结束后，冷却至室温，析出白色固体产物，收集并干燥所得产物为1f。
5-苄氧基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(1a):白色固体，产率85.0％。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:1.28(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),4.27(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),7.53(s,1H,吡啶酮环中C-3H),8.16(s,1H,吡啶酮环中C-6H),8.37(s,1H,CH).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:14.80,71.22,110.44,127.79,137.84,141.77,146.34,161.25.ESI-MS:m/z183(MH+)；HRMS:C8H11N2O3(MH+)计算值183.0764，实测值。
5-羟基-1-甲基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(1b):白色固体，产率84.6％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:1.29(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),4.08(s,3H,CH3),4.28(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),7.64(s,1H,吡啶酮环中C-3H),8.29(s,1H,吡啶酮环中C-6H),8.55(s,1H,CH).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:14.82,44.55,71.27,110.72,133.39,139.68,142.07,146.34,160.21.ESI-MS:m/z 197(MH+)；HRMS:C9H13N2O3(MH+)计算值197.0921，实测值。
1-乙基-5-羟基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(1c):白色固体，产率85.7％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:1.29(t,J＝7.5Hz,3H,CH3),1.34(t,J＝7.5Hz,3H,CH3),4.28(q,J＝7.5Hz,2H,CH2),4.47(q,J＝7.5Hz,2H,CH2),7.64(s,1H,吡啶酮环中C-3H),8.35(s,1H,吡啶酮环中C-6H),8.63(s,1H,CH).13C NMR(125MHz,MeOD)δ:14.82,16.53,51.96,71.29,111.50,132.14,138.84,141.86,146.71,160.48.ESI-MS:m/z 211(MH+)；HRMS:C10H15N2O3(MH+)计算值211.1077实测值。
1-丁基-5-羟基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(1d):白色固体，产率61.0％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:0.88(t,J＝7.5Hz,3H,CH3),1.29(t,J＝7.5Hz,5H,CH2和CH3),1.62-1.71(m,2H,CH2),4.28(q,J＝7.5Hz,2H,CH2),4.44(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),7.66(s,1H,吡啶酮环中C-3H),8.36(s,1H,吡啶酮环中C-6H),8.64(s,1H,CH).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:13.87,14.82,19.21,32.94,56.19,71.30,111.59,132.72,138.93,141.96,146.50,160.28.ESI-MS:m/z 239(MH+)；HRMS:C12H19N2O3(MH+)计算值239.1390，实测值。
1-己基-5-羟基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(1e):白色固体，产率63.4％。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ:0.92(t,J＝7.5Hz,3H,CH3),1.36(t,J＝7.0Hz,9H,3CH2和CH3),1.80-1.87(m,2H,CH2),4.35(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),4.48(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),7.56(s,1H,吡啶酮环中C-3H),8.22(s,1H,吡啶酮环中C-6H),8.50(s,1H,CH).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:12.82,13.41,22.06,25.38,30.57,30.92,56.66,71.33,111.28,131.95,139.79,140.21,146.26,159.80.ESI-MS:m/z 267(MH+)；HRMS:C14H23N2O3(MH+)计算值267.1703，实测值。
5-羟基-1-辛基-4-氧-1,4-二氢吡啶-2-甲醛-O-乙基肟(1f):白色固体，产率70.1％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:0.84(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),1.17-1.26(m,10H,5CH2),1.29(t,J＝7.0Hz,3H,CH3),1.62-1.72(m,2H,CH2),4.28(q,J＝7.0Hz,2H,CH2),4.42(t,J＝7.0Hz,2H,CH2),7.60(s,1H,吡啶酮环中C-3H),8.32(s,1H,吡啶酮环中C-6H),8.64(s,1H,CH).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:14.36,14.81,22.47,25.79,28.81,28.87,30.90,31.56,56.28,71.27,111.78,132.50,139.00,142.08,146.57,160.67.ESI-MS:m/z 295(MH+)；HRMS:C16H27N2O3(MH+)计算值295.2016，实测值。
实验1、化合物1对蘑菇酪氨酸酶单酚酶抑制活性的测定
单酚酶活力测定参考文献(Design and synthesis of hydroxypyridinone-L-phenylalanine conjugates as potential tyrosinase inhibitors.Journal ofAgricultural and Food Chemistry 2013,61(27),6597-6603)的方法并稍加改进：酪氨酸酶的单酚酶活力测定是以2mmol/L酪氨酸为底物，在180μL缓冲液(pH 6.86)中加入10μL化合物1(溶于DMSO溶液)，再加入10μL预先在30℃恒温水浴保温的底物溶液，然后加入10μL蘑菇酪氨酸酶水溶液(1ml酶液活力为2000U，即10μL酶液活力为20U)，立刻混匀，于30℃恒温条件下密闭温浴10min，迅速于475nm处检测吸光度值。不同组的反应体系的组成具体如表1。
表1、反应液体系
化合物对酪氨酸酶活性的抑制率按如下公式进行计算：
抑制率(％)＝[1-(OD3-OD4)/(OD1-OD2)]×100％；
其中OD1、OD2、OD3和OD4分别为第一到第四组溶液的光密度。
随着化合物浓度的增大，对酪氨酸酶活性的抑制增加。化合物对酪氨酸酶单酚酶活性的抑制率为50％时的化合物的浓度(IC50)见表2。化合物1e和1f的活性最高，分别约为曲酸的5.9倍和7.5倍。
表2、化合物1的酪氨酸酶抑制活性
选取酪氨酸酶单酚酶抑制活性较好的化合物1e和1f测定其对酪氨酸酶二酚酶的抑制活性(实验2)、抑制类型和抑制常数(实验3)。
实验2、化合物1e和1f对蘑菇酪氨酸酶二酚酶抑制活性的测定
二酚酶活力测定参考文献(Design and synthesis of hydroxypyridinone-L-phenylalanine conjugates as potential tyrosinase inhibitors.Journal ofAgricultural and Food Chemistry 2013,61(27),6597-6603)的方法：以原始浓度0.5mmol/L的L-多巴为底物，总测活体系是300μL，用套装缓冲剂pH 6.86维持溶液的pH，缓冲剂要现用现配。具体方法是先在180μL缓冲液(pH6.86)中加入10μL抑制剂(溶于DMSO溶液)，再加入100μL预先在30℃恒温水浴保温的底物溶液，然后加入10μL蘑菇酪氨酸酶水溶液(1mL酶液活力为2000U，10μL酶液活力为20U)，立刻混匀，在30℃恒温条件下实时跟踪波长为475nm的吸光度值随时间增长的曲线，测定仪器为Infinite M200全自动酶标仪。由曲线的直线部分的斜率求得酶活力，以酶的相对剩余活力对抑制剂浓度作图，酶的相对剩余活力为50％时对应的抑制剂浓度即为抑制剂的半抑制率IC50。
酶的相对活力随化合物1e或1f浓度的增大而不同程度地减小，说明1e或1f抑制二酚酶的活力，导致酶活力下降，且浓度越大，抑制能力越强。化合物1e对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制率为50％时的化合物的浓度(IC50)为13.89μmol/L、1f的浓度(IC50)为7.99μmol/L；经比较知1f比1e对二酚酶的抑制能力强。现有的羟基吡啶酮衍生物7a、7b、7c的浓度(IC50)分别为4.00、8.97、26.20μmol/L。
实验3、1e和1f对酪氨酸酶二酚酶抑制类型和抑制常数的测定
测定方法与实验2测定方法基本相同，固定酪氨酸酶的浓度(实验加入的10μL酶液的酶活为20U)，改变加入的L-多巴的量，测定不同浓度1e或1f对酶活力的影响。采用Lineweaver-Burk双倒数法作图，以底物浓度的倒数1/[S]为X轴，以反应速度的倒数1/υ为Y轴，来判断抑制剂的抑制类型。以直线的斜率和在Y轴上的截距对抑制剂浓度再次作图，求出抑制剂对游离酶(E)的抑制常数KI和对酶-底物复合物(ES)的抑制常数KIS。
随着1e和1f浓度的增大，不但使酶促反应的最大反应速度(Vmax)变小，还导致米氏常数(Km)变大，可知1e和1f对酪氨酸酶二酚酶的抑制类型为混合型。化合物1e和1f对酪氨酸酶二酚酶抑制类型和抑制常数见表3。
表3、化合物1e和1f的酪氨酸酶二酚酶抑制类型及抑制常数
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.具有酪氨酸酶抑制活性的含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物，其特征是具有如下结构通式：
结构通式1中：R为H、CnH2n+1(n＝1-12)、取代烃基；R’＝CnH2n+1(n＝1-6)。
2.根据权利要求1所述的含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物，其特征是结构式为如下任意一种：
3.如权利要求1或2所述的羟基吡啶酮衍生物的制备方法，其特征是：
1)、将曲酸的5位羟基苄基化，然后与氨水或含不同碳链长度的脂肪胺反应，再经活性二氧化锰将2-位羟甲基选择性氧化，得到2-位为醛基的吡啶酮衍生物；
2)、O-烷基羟胺与2-位含醛基的吡啶酮衍生物发生缩合反应，再经盐酸脱苄基后得到含肟醚基团的羟基吡啶酮衍生物。
4.如权利要求1或2所述的羟基吡啶酮衍生物的用途，其特征是：用作酪氨酸酶抑制剂。
5.如权利要求1或2所述的羟基吡啶酮衍生物的用途，其特征是：用于化妆品或食品的保鲜。
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