CN108771644B - 一种海藻酸/海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的应用 - Google Patents
一种海藻酸/海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于酪氨酸酶抑制剂技术领域,具体涉及一种海藻酸/海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的应用。本发明提供的海藻酸/海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂,可以破坏酪氨酸酶结构,达到抑制酪氨酸酶的作用,能够有效抑制黑色素增生。同时,本发明提供的海藻酸/海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂,对黑素细胞无毒害作用,因此,具有安全高效美白祛斑的作用。
Description
技术领域
本发明属于酪氨酸酶抑制剂技术领域,具体涉及一种海藻酸/海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的应用。
背景技术
海藻酸是一种天然多糖,其化学组成为卢一D一甘露糖醛酸(M)和a—L一古罗糖醛酸(G)经过1,4键合形成的线型共聚物,G和M在海藻酸中的含量对纤维的成胶性能有明显的影响。海藻酸在自然状态下存在于胞质中,起着强化细胞壁的作用。海藻酸与海水中各种阳离子结合成为各种海藻酸盐。从海藻中得到的提取物通常是海藻酸钠。海藻酸钠具有增稠、悬浮、乳化、稳定、形成凝胶、形成薄膜和纺制纤维的特性,在食品、造纸及化妆等工业有悠久及广泛的用途,特别是近年来在生物医学工程领域发现有重要用途。
海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物,其分子由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸按(1→4)键连接而成,是一种天然多糖,具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性。海藻酸钠已经在食品工业和医药领域得到了广泛应用。
当下,随着生活水平的不断提升,人们对于美的追求也愈加强烈,黑色素作为影响皮肤肤色的重要决定者,就成为美白祛斑产品关注的源头。TYR(Tyrosinase,TYR)是控制黑色素的关键酶,在人体上,分布着很多黑素细胞,TYR通过催化黑素细胞中的酪氨酸,产生L-多巴,催化生成多巴醌,通过人体的非酶促反应,最后可直接生成黑色素。当TYR过量表达时会导致黑色素的大量沉积,同时引发色素紊乱相关疾病。如引发黄褐斑、雀斑、黑色素瘤等色素沉着性皮肤病。
作为控制黑色素生成的关键酶,TYR抑制剂不断被发现,但研究的方向各有千秋,目前,在使用的TYR抑制剂由于安全性和稳定性不可预知,导致其在美白祛斑化妆品的应用受到限制。
中国专利申请CN108309818A公开了一种美白祛斑化妆品,该专利申请提供的美白祛斑化妆品中,加入姜黄素,有效地清除肌肤中的自由基,同时姜黄素对TYR具有明显抑制作用,因而减轻了皮肤黑色素的沉积。但是,姜黄素在应用中,溶解度不高、稳定性差、吸收率低,因而需要剂量较大,限制了其应用。
中国专利CN105837540B公开了一种从漆树木粉中提取具有抑制TYR活性的硫磺菊素和紫铆花素的方法,该方法提取的硫磺菊素和紫铆花素对TYR具有显著的抑制作用,能够用于美白化妆品,并且可以预防和治疗由于人体黑色素过多导致的沉着性疾病。但是提取硫磺菊素和紫铆花素的方法较复杂,且提取所用溶剂毒性较大。
目前,所用酪氨酸抑制剂难以同时满足天然、高效、安全、经济等因素,因此,开发新型的天然TYR抑制剂是研究的重点。
发明内容
针对以上技术问题,本发明提供了一种海藻酸/海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的应用。本发明提供的海藻酸/海藻酸钠,通过破坏TYR结构,达到抑制TYR的作用,同时,海藻酸/海藻酸钠作为TYR抑制剂对黑素细胞无毒害作用,因此具有安全高效美白祛斑的作用,在制备美白祛斑膏中具有良好的应用前景。
本发明的技术方案如下:
本发明提供了一种海藻酸作为酪氨酸酶抑制剂的应用,所述海藻酸作为酪氨酸酶抑制剂的浓度为0.125-3mmol/L。
进一步地,所述海藻酸作为酪氨酸酶抑制剂的浓度为2mmol/L。
本发明还提供了一种海藻酸作为酪氨酸酶抑制剂在制备美白祛斑膏中的应用,所述海藻酸作为酪氨酸酶抑制剂的美白祛斑膏由如下组分及其质量份数组成:
白牵牛12份、柿叶12份、天花粉12份、白丁香10份、杏仁12份、何首乌7份、白芷6份、蒿本6份、香附12份、芦荟汁17份、僵蚕8份、海藻酸2份。
本发明提供了一种海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的应用,所述海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的浓度为0.25-25mmol/L。
进一步地,所述海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的浓度为20mmol/L。
本发明还提供了一种海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂在制备美白祛斑膏的中的应用,所述海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的美白祛斑膏由如下组分及其重量份数组成:
白牵牛12份、柿叶12份、天花粉12份、白丁香10份、杏仁12份、何首乌7份、白芷6份、蒿本6份、香附12份、芦荟汁17份、僵蚕8份、海藻酸钠5份。
进一步地,所述海藻酸/海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的美白祛斑膏的制备方法,步骤如下:
S1按比例配料;
S2将白牵牛、柿叶、天花粉、白丁香、杏仁、何首乌、白芷、蒿本、香附和僵蚕粉碎研磨成10-100目的粉末,得到混合粉末;
S3将步骤S2制得的混合粉末加水煎煮二次,每次0.5~2小时,第一次煎煮加药材总重量10~30倍的水,第二次煎煮加药材总重量5~25倍的水,合并煎液;
S4将芦荟汁和海藻酸/海藻酸钠加入到步骤S3合并后的煎液中,搅拌均匀,在50~60℃的条件下浓缩成稠膏;
S5将步骤S4制得的稠膏冷却后装瓶。
海藻酸和海藻酸钠已经广泛应用于食品工业和医药工业,具有安全性和稳定性。在本发明中,海藻酸/海藻酸钠抑制TYR活性的方式为混合性抑制,海藻酸/海藻酸钠对TYR的抑制作用源于其结构中的羟基、羧基和羰基等功能基团对TYR结构的破坏作用。
海藻酸及海藻酸钠对TYR活性的测定试验显示,海藻酸、海藻酸钠对TYR的最高抑制率分别为46.03%和65.45%。
TYR抑制作用试验显示,当加入海藻酸或海藻酸钠时,TYR的结构遭到破坏。
透皮性能测试试验显示,海藻酸及海藻酸钠在皮肤中具有较快的渗透速率,且渗透速率随时间的增加而增加。
毒性试验显示,海藻酸和海藻酸钠作为TYR抑制剂在使用浓度范围内,对细胞无毒性。
与现有技术相比,本发明具有以下优势:
(1)本发明提供的海藻酸/海藻酸钠通过破坏TYR结构,达到抑制TYR的作用,能够有效抑制黑色素增生。
(2)本发明提供的海藻酸/海藻酸钠作为TYR抑制剂,对黑素细胞无毒害作用,并且同时具有美白祛斑的良好效果,因此,能够安全的应用于美白祛斑化妆品中。
附图说明
图1是无酪氨酸抑制剂时,TYR的活性变化图;
图2是海藻酸对TYR活性抑制图;
图3是海藻酸与TYR作用结构荧光分析图;
图4是海藻酸对黑素细胞的生物安全性试验图;
图5是海藻酸钠对TYR活性抑制图;
图6是海藻酸钠与TYR作用结构荧光分析图;
图7是海藻酸钠的透皮性能测试图;
图8是海藻酸钠对黑素细胞的生物安全性试验图。
具体实施方式
以下通过实施例的具体实施方式对本发明上述内容作进一步描述:
以下所述为本发明的几种实施例,但不应当将此理解为本发明上述主题的范围限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改,以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进,均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1、TYR活性的测定
TYR催化底物L-多巴,产生的黑色素可通过使用紫外分光光度计测定吸光度值的变化探究TYR的活性变化。具体操作方法如下:
S1、向试管中加入pH=6.8的PBS缓冲液3mL,然后加入1mmol/L的L-多巴溶液2.8mL,得到L-多巴PBS缓冲液;
S2、将步骤S1制得的L-多巴PBS缓冲液放在32℃水浴中保温20min,然后取0.01mg/mL的TYR溶液0.1mL立刻加入到保温的L-多巴PBS缓冲液中混合;
S3、随后使用紫外分光光度计测定反应液在475nm处的吸光度,绘制TYR活性随单位时间变化的曲线,规定以每分钟反应液在475nm波长处的吸光度值增加0.001为一个TYR活力单位(U/min)。
图1为TYR催化底物L-多巴产生黑色素体系中,随着单位时间的变化TYR的活性变化图。
由图1可知,TYR活力与单位时间呈现出较好的线性关系,直线的斜率为TYR的活力大小,即未加入抑制剂时TYR活力值为0.0063(U/min)。
实施例2、TYR抑制率的测定
实施例2的具体操作方法与实施例1基本相同,不同在于,取海藻酸粉末0.2g溶于50mL蒸馏水中,得到浓度为10mmol/L的海藻酸钠溶液。通过计算,配制出浓度为0.125mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L和3mmol/L的海藻酸溶液,分别在加入TYR前的L-多巴PBS缓冲液中添加不同浓度的海藻酸溶液,置于32℃水浴中保温20min,随后使用紫外分光光度计测量在475nm处的吸光度,通过吸光度值的变化量探究出海藻酸对TYR活性的影响和抑制率。其中,海藻酸抑制率公式为:
图2是为海藻酸对TYR活性抑制图。
由图2可知,直线的斜率随着海藻酸抑制剂浓度不断增大到2mM而逐渐减小,由此可以看出TYR对海藻酸剂量存在依赖性。根据海藻酸抑制率公式可知,海藻酸浓度为0.125mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L和3mmol/L时,对TYR活性的抑制率分别为34.92%、36.51%、39.68%、42.86%、46.03%和46.02%,3mmol/L的海藻酸与2mmol/L的海藻酸对TYR的抑制率几乎为一条直线,所以图中未标出3mmol/L海藻酸抑制TYR活性的曲线。因此,当海藻酸浓度为2mmol/L时,作为酪氨酸酶抑制剂的抑制率最高为46.03%。
实施例3、海藻酸对TYR抑制机理探究
当海藻酸作用于TYR时,TYR的活性中心受到激发后可发射特定波长的发射光,利用荧光光谱法测定海藻酸抑制剂加入后对TYR发射光谱的影响,可以判断海藻酸抑制剂对TYR的作用机制。具体操作方法如下:
配制pH=6.8的PBS缓冲溶液,加入浓度为0.01mg/mL的TYR溶液,分别加入体积相同浓度不同的海藻酸抑制剂1mL混合,在32℃下水浴保温20分钟,采用激发波长280nm,扫描各样品在290-450nm间的发射光谱。
图3为海藻酸与TYR作用结构荧光分析图。
由图3可知,随着海藻酸浓度不断上升,内源荧光强度逐渐在下降,400nm后荧光强度基本不变,且内源荧光强度分别在三个不同浓度时都出现了峰值,而且出现红移现象,表明海藻酸的加入使TYR的结构发生了改变。
实施例4、生物安全性试验
分别将浓度为0.25mmol/L、1mmol/L和3mmol/L的海藻酸与黑素细胞共同培养,培养8h和24h后,采用MTT法使用酶标仪测定在490nm处的吸光度值,测定细胞活性,从而判断不同浓度海藻酸抑制剂的毒性,从而得到抑制剂的安全使用浓度。
图4是海藻酸对黑素细胞的生物安全性试验图。
由图4可知,海藻酸浓度在3mmol/L时,海藻酸作用于黑素细胞,细胞活性均高于97.47%,表明3mmol/L时海藻酸对黑素细胞完全没有毒性。
实施例5、TYR抑制率的测定
实施例5的具体操作方法与实施例1基本相同,不同在于,取海藻酸钠粉末0.108g溶于50mL蒸馏水中,得到浓度为10mmol/L的海藻酸钠溶液。通过计算,配制出浓度为0.25mmol/L、0.5mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、16mmol/L、32mmol/L、64mmol/L的海藻酸钠溶液,分别在加入TYR前的L-多巴PBS缓冲液中添加不同浓度的海藻酸钠,置于32℃水浴中保温20min,随后使用紫外分光光度计测量在475nm处的吸光度,通过吸光度值的变化量探究出海藻酸钠对TYR活性的影响和相对抑制率。
图5是海藻酸钠对TYR活性抑制图。
由图5可知,TYR活性是随着海藻酸钠的浓度的改变而变化的,由此可以看出TYR对海藻酸钠剂量存在依赖性,并且随着海藻酸钠浓度的增加,酶活力曲线的斜率逐渐下降,TYR活力也随之下降,但其活力不会随着海藻酸钠的浓度的增大无限减小,在浓度为20mmol/L时,TYR活力有最小值。通过计算得知海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂在最佳抑制浓度时的抑制率为65.45%。
实施例6、海藻酸钠对TYR抑制机理探究
TYR活性中心受到激发后可发射特定波长的发射光,利用荧光光度法测定海藻酸钠加入后对TYR发射光谱的影响,可以判断海藻酸钠对TYR的作用机制。具体操作如下:
取海藻酸钠粉末0.108g溶于50mL蒸馏水中,得到浓度为10mM的海藻酸钠溶液。通过计算,配制出浓度为0.25mmol/L,0.5mmol/L,2mmol/L,4mmol/L,8mmol/L,10mmol/L,15mmol/L,20mmol/L,25mmol/L,32mmol/L,64mmol/L的海藻酸钠溶液。
分别取上述不同浓度的海藻酸钠溶液1mL,与等体积的TYR溶液混合,在32℃下保温20min后,放置在比色皿中测定其内源荧光。激发波长为280nm,接收波长范围为290-450nm。
图6是海藻酸钠与TYR作用结构荧光分析图;由图6可知,TYR的内源荧光在逐渐被淬灭,并且发现随着海藻酸钠浓度的增加,内源荧光强度逐渐降低。荧光强度峰值还出现了红移的现象,因此可以判断海藻酸钠抑制TYR的机制是由海藻酸钠引起的酶结构变化引起的。当海藻酸钠的浓度达到25mmol/L时,内源荧光强度不降低。结果表明,海藻酸钠破坏了TYR结构,且海藻酸钠的最大抑制浓度为25mmol/L。
实施例7、透皮性能测试
取20mmol/L的海藻酸钠溶液,涂于健康SD大鼠皮肤表面,测试其渗透入小鼠皮肤内部的速率。
图7是海藻酸钠的透皮性能测试图。
由图7可知,海藻酸钠浓度为20mmol/L时,在健康SD大鼠的皮肤表面渗透速率随着时间的增大而增大,12h累计透过大鼠皮肤的海藻酸钠为9.34μg/cm2,表明,海藻酸钠具有良好的透皮性能。
实施例8、生物安全性试验
分别将浓度为2mmol/L、10mmol/L和20mmol/L的海藻酸钠与黑素细胞共同培养,培养8h和24h后,采用MTT法使用酶标仪测定在490nm处的吸光度值,测定细胞活性,判断海藻酸钠抑制剂不同浓度的毒性,从而得到抑制剂的安全使用浓度。
图8是海藻酸钠对黑素细胞的生物安全性试验图。
由图8可知,海藻酸钠浓度在20mmol/L时,海藻酸钠作用于黑素细胞,细胞活性均高于96.5%,表明海藻酸钠浓度为20mmol/L时,对细胞没有毒性。
实施例9、一种海藻酸作为酪氨酸酶抑制剂的美白祛斑膏
所述海藻酸作为酪氨酸酶抑制剂的美白祛斑膏,由如下组分及其重量份数组成:
白牵牛12份、柿叶12份、天花粉12份、白丁香10份、杏仁12份、何首乌7份、白芷6份、蒿本6份、香附12份、芦荟汁17份、僵蚕8份、海藻酸2份。
所述海藻酸作为酪氨酸酶抑制剂的美白祛斑膏的制备方法,步骤如下:
S1按比例配料;
S2将白牵牛、柿叶、天花粉、白丁香、杏仁、何首乌、白芷、蒿本、香附和僵蚕粉碎研磨成50目的粉末,得到混合粉末;
S3将步骤S2制得的混合粉末加水煎煮二次,每次1.4小时,第一次煎煮加药材总重量的25倍的水量,第二次煎煮加药材总重量的18倍的水量,合并煎液;
S4将芦荟汁和海藻酸加入步骤S3合并后的煎液中,搅拌均匀,在55℃的条件下浓缩成稠膏;
S5将步骤S4制得的稠膏冷却后装瓶。
实施例10、一种海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的美白祛斑膏
所述海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的美白祛斑膏,由如下组分及其重量份数组成:
白牵牛12份、柿叶12份、天花粉12份、白丁香10份、杏仁12份、何首乌7份、白芷6份、蒿本6份、香附12份、芦荟汁17份、僵蚕8份、海藻酸钠5份。
所述海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂的美白祛斑膏的制备方法,步骤如下:
S1按比例配料;
S2将白牵牛、柿叶、天花粉、白丁香、杏仁、何首乌、白芷、蒿本、香附和僵蚕粉碎研磨成50目的粉末,得到混合粉末;
S3将步骤S2制得的混合粉末加水煎煮二次,每次1.4小时,第一次煎煮加药材总重量的25倍的水量,第二次煎煮加药材总重量的18倍的水量,合并煎液;
S4将芦荟汁和海藻酸钠加入步骤S3合并后的煎液中,搅拌均匀,在55℃的条件下浓缩成稠膏;
S5将步骤S4制得的稠膏冷却后装瓶。
对比例1、一种美白祛斑膏
所述美白祛斑膏,由如下组分及其重量份数组成:
白牵牛12份、柿叶12份、天花粉12份、白丁香10份、杏仁12份、何首乌7份、白芷6份、蒿本6份、香附12份、芦荟汁17份、僵蚕8份。
所述美白祛斑膏的制备方法,步骤如下:
S1按比例配料;
S2将白牵牛、柿叶、天花粉、白丁香、杏仁、何首乌、白芷、蒿本、香附和僵蚕粉碎研磨成50目的粉末,得到混合粉末;
S3将步骤S2制得的混合粉末加水煎煮二次,每次1.4小时,第一次煎煮加药材总重量的25倍的水量,第二次煎煮加药材总重量的18倍的水量,合并煎液;
S4将芦荟汁加入步骤S3合并后的煎液中,搅拌均匀,在55℃的条件下浓缩成稠膏;
S5将步骤S4制得的稠膏冷却后装瓶。
对比例1与实施例9基本相同,不同在于,对比例1中未加入酪氨酸酶抑制剂。
试验例一、美白祛斑效果测试
1、试验材料:实施例9、实施例10和对比例1制备的美白祛斑膏。
2、试验对象:临床病例180名,其中轻、中、重度各60例(轻度:色斑为淡褐色,占面部面积30%左右;中度:色斑为黄褐色,占面部面积30-50%;重度:色斑为黄褐色或黑褐色,占面部面积50%以上)。
3、试验分组:分别将180名临床病人随机分为3组,每组分别为轻、中、重度病人各20名,分别使用实施例9、实施例10和对比例1制备的美白祛斑膏并记为实施例1组、实施例2组和对比例1组。
3、试验方法:早晚清洁面部后,取适量试验材料均匀涂抹于面部,轻轻拍打吸收,斑印处可加量使用,并轻轻按摩3-5min,使用30天,记录有效率(有效率为面部斑点面积减少20%的人数与该组总人数之比)。
4、试验结果:实施例9组的临床病人的有效率为95%,实施例10组的的临床病人的有效率为96%,对比例1组的的临床病人的有效率仅为69%,对比例1与实施例9的区别在于,未添加海藻酸,实施例1的效果显著优于对比例1;对比例1与实施例10的区别在于,未添加海藻酸钠,实施例2的效果显著优于对比例2。结果表明,本发明提供的海藻酸/海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶抑制具有良好的美白祛斑效果。
Claims (3)
1.一种海藻酸或海藻酸钠用于制备酪氨酸酶抑制剂的应用,所述海藻酸用于制备酪氨酸酶抑制剂的浓度为2mmol/L;
所述海藻酸钠用于制备酪氨酸酶抑制剂的浓度为0.25-25mmol/L。
2.如权利要求1所述的海藻酸钠用于制备酪氨酸酶抑制剂的应用,其特征在于,所述海藻酸钠用于制备酪氨酸酶抑制剂的浓度为20mmol/L。
3.一种海藻酸/海藻酸钠作为酪氨酸酶抑制剂在制备美白祛斑膏中的应用。
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