CN106978385A - 一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法 - Google Patents

一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，该方法包括以下步骤：⑴黄粉虫虫卵的收集：黄粉虫成虫经避光产卵、孵育，获得孵育后黄粉虫虫卵；⑵黄粉虫虫卵的灭菌：无菌条件下颗粒饱满孵育后黄粉虫虫卵经消毒、冲洗、漂洗，获得无菌虫卵；⑶获取黄粉虫胚胎的组织和细胞：在无菌条件下无菌虫卵挑至细胞筛，并将该细胞筛置于培养皿中，加入细胞培养液，研碎卵粒，获得细胞滤液；⑷黄粉虫胚胎细胞的原代培养：细胞滤液静置培养，15~40天后即可得到贴壁生长的黄粉虫胚胎细胞群；⑸黄粉虫胚胎细胞的传代培养：弃去原代细胞培养液，黄粉虫胚胎细胞群经消化、吹打分散细胞、静置培养，7~10天后即可进行下次传代。本发明操作简便、方法易行、细胞成活率高。

Description

一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法
技术领域
本发明涉及昆虫细胞培养技术领域，尤其涉及一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法。
背景技术
近年来，昆虫细胞培养技术已被广泛应用于昆虫生理学、昆虫病理学、昆虫毒理学、分子遗传学、发育学、内分泌学等领域。自1962年Grace建立按蚕蛾（Anteraeaeucalypti）卵巢细胞系以来，特别是Smith等创建了昆虫杆状病毒表达系统（BaculoviusExpression Vector System,BEVS）之后，使得昆虫细胞培养技术的应用得到了极大的扩展。目前，在全世界建立的所有昆虫细胞系中, 大部分来源于鳞翅目和双翅目, 其中而来源于鞘翅目昆虫的细胞系仅占3%左右。鞘翅目昆虫应用广泛，与人类生活生产息息相关，如用于中药、食品、营养物质及化学物质的提取等方面，有着重要的经济价值。鞘翅目是昆虫纲种类最多、分布最广的第一大目，若建立更多来自鞘翅目的昆虫细胞系，这将极大地推进对鞘翅目昆虫相关生物学的研究及应用。
黄粉虫，又叫面包虫，属鞘翅目，拟步行虫科，粉虫甲属。黄粉虫是一类仓储害虫，但同时也是一种生理、遗传学实验材料。黄粉虫具有抗病力强、耐寒性强、生长发育快等特点。与此同时，由于黄粉虫体内蛋白质含量丰富，不仅可以作为许多动物的活饵料，还可作为人类的食品和保健品。目前，有关黄粉虫细胞的体外培养的仅限于脂肪体细胞，并无其他相关报道。因此，建立起一种黄粉虫胚胎细胞的离体培养方法，使得黄粉虫获得更高的利用价值，这具有重要的社会和经济效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、培养方便、细胞成活率高的黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，包括以下步骤：
⑴黄粉虫虫卵的收集：将黄粉虫成虫置于7~12目筛，筛底部铺满饲料，使饲料与筛底相接触，在25℃~28℃条件下，避光产卵；次日，从饲料中16~20目筛筛取虫卵，然后剔除虫卵中杂质；在25℃~28℃条件下，孵育3~7天，获得孵育后黄粉虫虫卵；
⑵黄粉虫虫卵的灭菌：无菌条件下，将900~1100粒颗粒饱满所述孵育后黄粉虫虫卵裹于双层无菌纱布，先浸于质量浓度为10%的NaClO溶液中消毒6min~8min，然后浸于体积浓度为75%的酒精消毒5min~6min，接着用至终浓度为200 U/mL双抗和2.5μg /mL两性霉素B的无菌水冲洗2~4次，再用Grace’s昆虫培养基漂洗1~4次，获得无菌虫卵；
⑶获取黄粉虫胚胎的组织和细胞：在无菌条件下，用镊子将所述无菌虫卵从纱布上挑至孔径为100μm的细胞筛，并将该细胞筛置于培养皿中，加入8~10mL细胞培养液，用橡胶头研碎卵粒，获得细胞滤液；
⑷黄粉虫胚胎细胞的原代培养：吸取2.5 mL所述细胞滤液移入装有2.5 mL细胞培养液的T-25cm2培养瓶中，置于28℃普通培养箱中静置培养，每隔7~14d天更换60%~80%的细胞培养液，15~40天后即可得到贴壁生长的黄粉虫胚胎细胞群；
⑸黄粉虫胚胎细胞的传代培养：弃去原代细胞培养液，在所述黄粉虫胚胎细胞群中加入2mL质量浓度为0.25%的胰蛋酶-EDTA消化液，室温消化30min，倒掉消化液，加入2.5mL细胞培养液，吹打分散细胞，获得细胞悬液；将所述细胞悬液全部移入新T-25cm2培养瓶，再加入2.5mL细胞培养液，放于28℃普通培养箱中静置培养，7~10天后，细胞贴满平底，即可进行下次传代。
所述步骤⑴中饲料是指玉米粉与面粉按3：2的质量比混合而成的混合物。
所述步骤⑶~所述步骤⑸中的细胞培养液是指将79mL Grace’s昆虫培养基、1mL 1万个单位的双抗、20 mL胎牛血清，混合均匀而得。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用饲料与筛底相接处的方法筛取虫卵和无菌纱布包裹消毒方法，降低了劳动强度，减少了试验步骤，因此，操作简便、方法易行。
2、本发明采用黄粉虫胚胎组织作为原料，细胞分化程度较低，增殖能力强，重复性好且细胞成活率高。经测试，细胞成活率高于90%。
3、本发明建立了黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，培养效果良好，是对鞘翅目昆虫细胞培养的重要补充。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明的挑选干净的黄粉虫虫卵。
图2为本发明孵化3天虫卵培养25天后胚胎细胞的培养形态图。
图3为本发明孵化4天虫卵培养35天后胚胎细胞的培养形态图。
图4为本发明孵化7天虫卵培养7天后胚胎细胞的培养形态图。
图5为本发明孵化7天虫卵培养15天后胚胎细胞的培养形态图。
图6为本发明孵化7天虫卵传代胚胎细胞的培养形态图。
具体实施方式
实施例1 一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，包括以下步骤：
⑴黄粉虫虫卵的收集：将黄粉虫成虫置于10目筛，筛底部铺满饲料，使饲料与筛底相接触，在25℃~28℃条件下，避光产卵；次日，从饲料中18目筛筛取虫卵，然后剔除虫卵中杂质；在25℃~28℃条件下，孵育3天，获得孵育后黄粉虫虫卵，如图1。
其中：饲料是指玉米粉与面粉按3：2的质量比（kg/kg）混合而成的混合物。
⑵黄粉虫虫卵的灭菌：无菌条件下，将1000粒颗粒饱满孵育后黄粉虫虫卵裹于双层无菌纱布，先浸于质量浓度为10%的NaClO溶液中消毒6min，然后浸于体积浓度为75%的酒精消毒5min，接着用至终浓度为200 U/mL双抗和2.5μg /mL两性霉素B的无菌水冲洗3次，再用Grace’s昆虫培养基漂洗1次，获得无菌虫卵。
其中：双抗、两性霉素B分别购置于索莱宝生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。
⑶获取黄粉虫胚胎的组织和细胞：在无菌条件下，用镊子将无菌虫卵从纱布上挑至孔径为100μm的细胞筛，并将该细胞筛置于培养皿（35mm）中，加入8mL细胞培养液，用橡胶头研碎卵粒，获得细胞滤液。
其中：细胞培养液是指将79mL Grace’s昆虫培养基、1mL 1万个单位的双抗、20 mL胎牛血清，混合均匀而得。
⑷黄粉虫胚胎细胞的原代培养：吸取2.5 mL细胞滤液移入装有2.5 mL细胞培养液的T-25cm2培养瓶中，置于28℃普通培养箱中静置培养，每隔7d天更换60%~80%的细胞培养液，25天后即可得到贴壁生长的黄粉虫胚胎细胞群，如图2。经台盼蓝染色计数，细胞活率大于90%。
其中细胞培养液同步骤⑶。
⑸黄粉虫胚胎细胞的传代培养：弃去原代细胞培养液，在黄粉虫胚胎细胞群中加入2mL质量浓度为0.25%的胰蛋酶-EDTA消化液，室温消化30min，倒掉消化液，加入2.5mL细胞培养液，吹打分散细胞，获得细胞悬液；将所述细胞悬液全部移入新T-25cm2培养瓶，再加入2.5mL细胞培养液，放于28℃普通培养箱中静置培养，10天后，细胞贴满平底，即可进行下次传代，如图6所示。
其中细胞培养液同步骤⑶。
实施例2 一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，包括以下步骤：
⑴黄粉虫虫卵的收集：将黄粉虫成虫置于10目筛，筛底部铺满饲料，使饲料与筛底相接触，在25℃~28℃条件下，避光产卵；次日，从饲料中18目筛筛取虫卵，然后剔除虫卵中杂质；在25℃~28℃条件下，孵育4天，获得孵育后黄粉虫虫卵。
其中：饲料是指玉米粉与面粉按3：2的质量比（kg/kg）混合而成的混合物。
⑵黄粉虫虫卵的灭菌：无菌条件下，将1000粒颗粒饱满孵育后黄粉虫虫卵裹于双层无菌纱布，先浸于质量浓度为10%的NaClO溶液中消毒6min，然后浸于体积浓度为75%的酒精消毒5min，接着用至终浓度为200 U/mL双抗和2.5μg /mL两性霉素B的无菌水冲洗3次，再用Grace’s昆虫培养基漂洗1次，获得无菌虫卵。
其中：双抗、两性霉素B分别购置于索莱宝生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。
⑶获取黄粉虫胚胎的组织和细胞：在无菌条件下，用镊子将无菌虫卵从纱布上挑至孔径为100μm的细胞筛，并将该细胞筛置于培养皿（35mm）中，加入8mL细胞培养液，用橡胶头研碎卵粒，获得细胞滤液。
其中：细胞培养液同实施例1。
⑷黄粉虫胚胎细胞的原代培养：吸取2.5 mL细胞滤液移入装有2.5 mL细胞培养液的T-25cm2培养瓶中，置于28℃普通培养箱中静置培养，每隔7d天更换60%~80%的细胞培养液，35天后即可得到贴壁生长的黄粉虫胚胎细胞群，如图3。经台盼蓝染色计数，细胞活率大于90%。
其中细胞培养液同步骤⑶。
⑸黄粉虫胚胎细胞的传代培养：弃去原代细胞培养液，在黄粉虫胚胎细胞群中加入2mL质量浓度为0.25%的胰蛋酶-EDTA消化液，室温消化30min，倒掉消化液，加入2.5mL细胞培养液，吹打分散细胞，获得细胞悬液；将所述细胞悬液全部移入新T-25cm2培养瓶，再加入2.5mL细胞培养液，放于28℃普通培养箱中静置培养，10天后，细胞贴满平底，即可进行下次传代。
其中细胞培养液同步骤⑶。
实施例3 一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，包括以下步骤：
⑴黄粉虫虫卵的收集：将黄粉虫成虫置于10目筛，筛底部铺满饲料，使饲料与筛底相接触，在25℃~28℃条件下，避光产卵；次日，从饲料中18目筛筛取虫卵，然后剔除虫卵中杂质；在25℃~28℃条件下，孵育7天，获得孵育后黄粉虫虫卵。
其中：饲料是指玉米粉与面粉按3：2的质量比（kg/kg）混合而成的混合物。
⑵黄粉虫虫卵的灭菌：无菌条件下，将900粒颗粒饱满孵育后黄粉虫虫卵裹于双层无菌纱布，先浸于质量浓度为10%的NaClO溶液中消毒6min，然后浸于体积浓度为75%的酒精消毒5min，接着用至终浓度为200 U/mL双抗和2.5μg /mL两性霉素B的无菌水冲洗3次，再用Grace’s昆虫培养基漂洗1次，获得无菌虫卵。
其中：双抗、两性霉素B分别购置于索莱宝生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。
⑶获取黄粉虫胚胎的组织和细胞：在无菌条件下，用镊子将无菌虫卵从纱布上挑至孔径为100μm的细胞筛，并将该细胞筛置于培养皿（35mm）中，加入8mL细胞培养液，用橡胶头研碎卵粒，获得细胞滤液。
其中：细胞培养液同实施例1。
⑷黄粉虫胚胎细胞的原代培养：吸取2.5 mL细胞滤液移入装有2.5 mL细胞培养液的T-25cm2培养瓶中，置于28℃普通培养箱中静置培养，每隔7d天更换60%~80%的细胞培养液，第7天后，大量细胞团块贴壁，并在其周围迁移出大量贴壁细胞，如图4；15天后即可得到贴壁生长的黄粉虫胚胎细胞群，如图5。经台盼蓝染色计数，细胞活率大于90%。
其中细胞培养液同步骤⑶。
⑸黄粉虫胚胎细胞的传代培养：弃去原代细胞培养液，在黄粉虫胚胎细胞群中加入2mL质量浓度为0.25%的胰蛋酶-EDTA消化液，室温消化30min，倒掉消化液，加入2.5mL细胞培养液，吹打分散细胞，获得细胞悬液；将所述细胞悬液全部移入新T-25cm2培养瓶，再加入2.5mL细胞培养液，放于28℃普通培养箱中静置培养，8天后，细胞贴满平底，即可进行下次传代。
其中细胞培养液同步骤⑶。
实施例4 一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，包括以下步骤：
⑴黄粉虫虫卵的收集：将黄粉虫成虫置于7目筛，筛底部铺满饲料，使饲料与筛底相接触，在25℃~28℃条件下，避光产卵；次日，从饲料中16目筛筛取虫卵，然后剔除虫卵中杂质；在25℃~28℃条件下，孵育5天，获得孵育后黄粉虫虫卵。
其中：饲料是指玉米粉与面粉按3：2的质量比（kg/kg）混合而成的混合物。
⑵黄粉虫虫卵的灭菌：无菌条件下，将900粒颗粒饱满孵育后黄粉虫虫卵裹于双层无菌纱布，先浸于质量浓度为10%的NaClO溶液中消毒8min，然后浸于体积浓度为75%的酒精消毒6min，接着用至终浓度为200 U/mL双抗和2.5μg /mL两性霉素B的无菌水冲洗2次，再用Grace’s昆虫培养基漂洗4次，获得无菌虫卵。
其中：双抗、两性霉素B分别购置于索莱宝生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。
⑶获取黄粉虫胚胎的组织和细胞：在无菌条件下，用镊子将无菌虫卵从纱布上挑至孔径为100μm的细胞筛，并将该细胞筛置于培养皿（35mm）中，加入10mL细胞培养液，用橡胶头研碎卵粒，获得细胞滤液。
其中：细胞培养液同实施例1。
⑷黄粉虫胚胎细胞的原代培养：吸取2.5 mL细胞滤液移入装有2.5 mL细胞培养液的T-25cm2培养瓶中，置于28℃普通培养箱中静置培养，每隔14d天更换60%~80%的细胞培养液，40天后即可得到贴壁生长的黄粉虫胚胎细胞群。经台盼蓝染色计数，细胞活率大于90%。
其中细胞培养液同步骤⑶。
⑸黄粉虫胚胎细胞的传代培养：弃去原代细胞培养液，在黄粉虫胚胎细胞群中加入2mL质量浓度为0.25%的胰蛋酶-EDTA消化液，室温消化30min，倒掉消化液，加入2.5mL细胞培养液，吹打分散细胞，获得细胞悬液；将所述细胞悬液全部移入新T-25cm2培养瓶，再加入2.5mL细胞培养液，放于28℃普通培养箱中静置培养，7天后，细胞贴满平底，即可进行下次传代。
其中细胞培养液同步骤⑶。
实施例5 一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，包括以下步骤：
⑴黄粉虫虫卵的收集：将黄粉虫成虫置于12目筛，筛底部铺满饲料，使饲料与筛底相接触，在25℃~28℃条件下，避光产卵；次日，从饲料中20目筛筛取虫卵，然后剔除虫卵中杂质；在25℃~28℃条件下，孵育6天，获得孵育后黄粉虫虫卵。
其中：饲料是指玉米粉与面粉按3：2的质量比（kg/kg）混合而成的混合物。
⑵黄粉虫虫卵的灭菌：无菌条件下，将1100粒颗粒饱满孵育后黄粉虫虫卵裹于双层无菌纱布，先浸于质量浓度为10%的NaClO溶液中消毒7min，然后浸于体积浓度为75%的酒精消毒5.5min，接着用至终浓度为200 U/mL双抗和2.5μg /mL两性霉素B的无菌水冲洗4次，再用Grace’s昆虫培养基漂洗3次，获得无菌虫卵。
其中：双抗、两性霉素B分别购置于索莱宝生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。
⑶获取黄粉虫胚胎的组织和细胞：在无菌条件下，用镊子将无菌虫卵从纱布上挑至孔径为100μm的细胞筛，并将该细胞筛置于培养皿（35mm）中，加入9mL细胞培养液，用橡胶头研碎卵粒，获得细胞滤液。
其中：细胞培养液同实施例1。
⑷黄粉虫胚胎细胞的原代培养：吸取2.5 mL细胞滤液移入装有2.5 mL细胞培养液的T-25cm2培养瓶中，置于28℃普通培养箱中静置培养，每隔10d天更换60%~80%的细胞培养液，20天后即可得到贴壁生长的黄粉虫胚胎细胞群。经台盼蓝染色计数，细胞活率大于90%。
其中细胞培养液同步骤⑶。
⑸黄粉虫胚胎细胞的传代培养：弃去原代细胞培养液，在黄粉虫胚胎细胞群中加入2mL质量浓度为0.25%的胰蛋酶-EDTA消化液，室温消化30min，倒掉消化液，加入2.5mL细胞培养液，吹打分散细胞，获得细胞悬液；将所述细胞悬液全部移入新T-25cm2培养瓶，再加入2.5mL细胞培养液，放于28℃普通培养箱中静置培养，9天后，细胞贴满平底，即可进行下次传代。
其中细胞培养液同步骤⑶。
上述实施例1~5中 Grace’s昆虫培养基购自于Gibco公司。

Claims (3)

1.一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，包括以下步骤：
⑴黄粉虫虫卵的收集：将黄粉虫成虫置于7~12目筛，筛底部铺满饲料，使饲料与筛底相接触，在25℃~28℃条件下，避光产卵；次日，从饲料中16~20目筛筛取虫卵，然后剔除虫卵中杂质；在25℃~28℃条件下，孵育3~7天，获得孵育后黄粉虫虫卵；
⑵黄粉虫虫卵的灭菌：无菌条件下，将900~1100粒颗粒饱满所述孵育后黄粉虫虫卵裹于双层无菌纱布，先浸于质量浓度为10%的NaClO溶液中消毒6min~8min，然后浸于体积浓度为75%的酒精消毒5min~6min，接着用至终浓度为200 U/mL双抗和2.5μg /mL两性霉素B的无菌水冲洗2~4次，再用Grace’s昆虫培养基漂洗1~4次，获得无菌虫卵；
⑶获取黄粉虫胚胎的组织和细胞：在无菌条件下，用镊子将所述无菌虫卵从纱布上挑至孔径为100μm的细胞筛，并将该细胞筛置于培养皿中，加入8~10mL细胞培养液，用橡胶头研碎卵粒，获得细胞滤液；
⑷黄粉虫胚胎细胞的原代培养：吸取2.5 mL所述细胞滤液移入装有2.5 mL细胞培养液的T-25cm2培养瓶中，置于28℃普通培养箱中静置培养，每隔7~14d天更换60%~80%的细胞培养液，15~40天后即可得到贴壁生长的黄粉虫胚胎细胞群；
⑸黄粉虫胚胎细胞的传代培养：弃去原代细胞培养液，在所述黄粉虫胚胎细胞群中加入2mL质量浓度为0.25%的胰蛋酶-EDTA消化液，室温消化30min，倒掉消化液，加入2.5mL细胞培养液，吹打分散细胞，获得细胞悬液；将所述细胞悬液全部移入新T-25cm2培养瓶，再加入2.5mL细胞培养液，放于28℃普通培养箱中静置培养，7~10天后，细胞贴满平底，即可进行下次传代。
2.如权利要求1所述的一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，其特征在于：所述步骤⑴中饲料是指玉米粉与面粉按3：2的质量比混合而成的混合物。
3.如权利要求1所述的一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，其特征在于：所述步骤⑶~所述步骤⑸中的细胞培养液是指将79mL Grace’s昆虫培养基、1mL 1万个单位的双抗、20mL胎牛血清，混合均匀而得。
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GUI-LING ZHENG ET AL.: ""Serum-free culture of the suspension cell line QB-Tn9-4s of the cabbage looper,Trichoplusia ni,is highly productive for virus repllcation and recombinant protein expression"", 《JOURNAL OF INSECT SCIENCE》 *
MIN-JUAN MENG ET AL.: ""A suspended cell line from Trichoplusia ni (Lepidoptera): Characterization and expression of recombinant proteins"", 《INSECT SCIENCE》 *
侯兰新等: "《动物细胞培养技术教程》", 30 September 2009, 甘肃科学技术出版社 *
侯晓辉等: ""鞘翅目昆虫细胞系建立的研究进展"", 《遵义医学院学报》 *
孙乃钧等: "《中国林蛙南方养殖技术》", 30 September 2008, 上海科学技术出版社 *
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