CN106929434B - 间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法 - Google Patents

间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法，该方法通过以米作为保藏基质，采用间歇生长法对红曲霉进行长期保藏。基质取水浸泡10‑60min，沥干流动水后分装入试管中，塞上棉塞，湿热灭菌。然后接入新鲜孢子悬液，搅拌均匀，培养4～7天，肉眼能观察到基质有红曲霉菌落生长，置冰箱4～8℃冷藏。每3年一次，从冰箱取出保藏物，置湿度95%RH，温度30℃的环境放置5小时，促使孢子萌发，移回冰箱冷藏。改良后的保藏法无需特殊设备和技术，操作简单、成本低廉、保藏期长。既能减轻人工劳力，也避免了传代时感染外界杂菌的可能，普通实验室都能实现。

Description

间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法
技术领域
本发明涉及微生物菌种保藏方法，特别是红曲霉菌种的长期保藏方法。
背景技术
据估计全世界存在150万种真菌，但还不到5％的真菌被分离纯化，适合分离纯种保藏的方法更少，不同的菌，有不同的生理特性，需不同的保藏方法，没有一种保藏工艺能够适合所有菌类的保藏。不当的保藏方法常常导致生产菌种优良性能退化甚至菌种死亡，带来巨大损失。红曲霉为子囊菌纲曲霉科红曲霉属的真菌，其代谢产物用途广泛，不仅用于食品、染色、调味、制醋，还有药用价值。大多数成员都能兼性嗜高渗透压，能在较低水活度下生长。能利用淀粉、糊精等多种有机碳源[李钟庆等.综观红曲与红曲菌，中国轻工业出版社,2009,6:40]。目前此类产孢真菌的常用保藏方法有继代培养保存法[李世贵, 顾金刚.斜面法与橡皮塞法保藏丝状真菌的效果.微生物学通报,2002,29(4):118-120]、自然基质法[范立宝.食用菌菌种的简易保藏法.贮藏加工,2004,175(9):31]、冷冻干燥法[Heseltine, C.W., Bradley, B.J,et.al.Further investigations on thepreservation of molds. Mycology,1960, 52(5): 762-774]，这些保藏方法的优缺点见表一。
基质法和继代培养法保藏菌种时，通常要选用营养较为瘠薄的培养基。保藏培养基碳氮比较发酵培养基低，培养温度也比发酵生长时低些。因为保藏菌种时如果培养基营养成分丰富，碳氮比高，生长温度高，菌种的生长速度就会过快，次级代谢物分泌过多，菌体易衰老。
传统基质保藏法保藏的是最初长成的孢子。基本原理是将保藏基质的水分蒸发掉，使菌种处于生长停滞状态，从而达到长期保存菌种的目的。通常的操作方法是在培养时让自然基质上长出尽可能多的孢子，再经干燥，使保藏物水分降到8%以下后，再放到冰箱冷藏，进入干燥低温保藏阶段。此时的基质仅仅是孢子的载体，因此保藏阶段的基质不允许受潮，一旦受潮，孢子就会萌发生长，由于初期基质营养早已耗尽，萌发后长出的菌丝没有营养的供给加速了菌株的死亡。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提出一种间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法， 是利用红曲霉能在较低温度和水活度下生长的特性对普通基质保藏法的改良。
一种间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法，步骤如下：
1）基质培养基的制备：选用米粒或者小麦粒，水浸泡10～60min，沥干流动水后分装入试管，塞上棉塞，湿热灭菌；
2）接种培养：接入新鲜红曲霉孢子液，搅拌均匀，30℃培养4～7天，至肉眼能观察到基质有红曲霉菌落生长；
3）冷藏干燥：将培养好的菌种置于冰箱内冷藏，水分升华得到干燥的基质培养基；
4）萌发：每3年一次，选择或者设置萌发环境，湿度为95%RH，温度为30℃，从冰箱取出菌种，在萌发环境放置5～8小时后，再移回冰箱4～8℃冷藏。
优选的基质培养基为黑米。
所述的萌发环境为梅雨天。
所述的水的温度20～40℃。
本发明的有益效果：
1、间歇生长保藏法主要特点是保藏期内间歇更新衰老的孢子，得到年轻有活力的孢子；
2、间歇生长保藏法无需特殊设备和技术，操作方法比普通的基质法还简单，保藏的菌种不易变异，不怕受潮；
3、间歇生长保藏法保藏时间长，既减轻人工劳力，也避免了传代时感染外界杂菌的可能。完全可取代工厂菌种室最常使用的基质保藏法。
附图说明
图1是本发明方法保藏16年的菌种与真空冷冻干燥保藏的菌种效果对比。
具体实施方式
间歇基质保藏方法保藏的是在不断更新的有活力的孢子。保藏方法首先是让菌株长在糊化不充分，水分低的米粒上，菌丝初期只能在米粒表面生长，形成休眠体后，低温干燥，低温保藏。在适当的时候，创造条件使孢子萌发出菌丝，菌丝吸取基质更深一层营养，再一次形成孢子，低温干燥，进入第二轮休眠期。如此反复，孢子在不断更新。由于没有旺盛生长，次级代谢产物也少，有利保持菌种的性状。
实施例1
1．黑米培养基的制备：30℃自来水浸泡60分钟，沥干流动水后分装入18×180mm试管中，装量为10克/支，塞上棉塞，湿热灭菌。基质培养基优选黑米，是因为黑米比籼米蛋白质含量高，而碳水化合物相对较低，且黑米结构致密，吸水率低,糊化较籼米难，菌丝入侵较慢。更适合作为长期保藏用材料。
2．接种培养：接种新鲜红曲孢子液，搅拌均匀，灭菌牛皮纸单支试管头部包扎后置消毒铝盒内，培养5～7天，至基质表面的红曲菌丝生长且1/5以上转粉红色，内部仍黑色。
3．冰箱间歇生长、冷藏：灭菌铝盒连同培养好的试管菌种一并置冰箱（普通家用冰箱即可，无需保湿）4℃～8℃冷藏。每3年一次，选择高温潮湿的天气（湿度在95%RH以上，气温在30℃左右），从冰箱取出装有保藏物的铝盒，放置5小时左右，由于温差，保藏试管内空气中的水蒸气凝结成冷凝水，湿度上升，米粒表层也会结露，适宜的温度和湿度触使孢子萌发出菌丝，菌丝吸取基质更深一层营养，继续生长，再一次形成休眠孢子。
4. 16年后，本发明保藏的菌种与真空冷冻干燥保藏的菌种效果对比。
保藏菌种复苏时液体培养生物量增长测定：将麦芽汁培养基(7 °Bé)装入100 mL广口三角瓶，灭菌，称0.10g培养物接种，在30℃、120r／min震荡培养，每一段时间取一只培养瓶。过滤取菌体，并用蒸馏水冲洗一次，置烘箱中100℃烘至恒重，并记录结果。具体数据见图1。
从图1中可看出16年后，用真空冷冻干燥保藏法保藏的两株菌种里ZM2.33株已死亡，ZM2.31与基质间歇生长保藏法保藏的菌种比不仅对数生长期滞后明显而且生物增长量偏低。
5.取出保藏物米粒，用双面刀片横切开，里层粉红色，米粒质地松但未变形，还有可利用基质未利用，保藏时间还有延长空间。
用间歇生长保藏法保藏的菌种，保藏方法简单、无需添加设备，保藏期长，活性高，而且复活时间比真空冷冻干燥法缩短48小时以上。最适合生产企业菌种室的保种工作。
实施例2
1．籼米培养基的制备：30℃自来水浸泡10分钟，沥干流动水后分装入18×180mm试管中，装量为10克/支，塞上棉塞，湿热灭菌。
2．接种培养：剔除灭菌后米粒结团严重的试管；挑取轻拍管壁米粒即能散开的试管接种。接入新鲜红曲孢子液，搅拌均匀，灭菌牛皮纸单支试管头部包扎后置消毒铝盒内，培养4～6天，观察到米粒表面有菌丝生长且80%以上转红，内部部分浅粉色。
3.冰箱间歇生长、冷藏：灭菌铝盒连同培养好的试管菌种一并置冰箱4℃～8℃冷藏。每3年一次，选择高温潮湿的天气（湿度在95%RH以上，气温在30℃左右），从冰箱取出装有保藏物的铝盒，在放置5小时左右，移回冰箱4℃～8℃保藏。
4. 16年后,本发明保藏的菌种与真空冷冻干燥保藏的菌种效果对比见图1。
16年后，保藏物与真空冷冻干燥保藏法进行平板和液体生长比较，图1中真空冷冻干燥保藏法保藏的菌种与籼米间歇生长保藏法保藏的菌种比对数生长期滞后明显，存活率低。籼米与黑米保藏的菌种指标相似。但肉眼可见大多数籼米保藏物以萎缩，变形，中空，基质几乎耗尽。

Claims (4)

1.一种间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法，其特征在于，步骤如下：
1）基质培养基的制备：选用米粒或者小麦粒，水浸泡10～60min，沥干流动水后分装入试管，塞上棉塞，湿热灭菌；
2）接种培养：接入新鲜红曲霉孢子液，搅拌均匀，30℃培养4～7天，至肉眼能观察到基质有红曲霉菌落生长；
3）冷藏干燥：将培养好的菌种置于冰箱内冷藏，低温下水分升华，得到干燥的基质保藏物；
4）萌发：每3年一次，选择或者设置萌发环境，湿度为95%RH，温度为30℃，从冰箱取出菌种，在萌发环境放置5～8小时后，再移回冰箱4～8℃冷藏。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，优选的基质培养基为黑米。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的萌发环境为梅雨天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水的温度20～40℃。
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用间歇生长保藏法保持红曲霉菌种长期高活性;郭红樱等;《食品科技》;20171231;第42卷(第10期);第17-20页

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