CN102399696A - 一种长期保藏微生物菌种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物的保藏方法，尤其涉及一种长期保藏微生物的方法。其主要的步骤为：把菌种接种到斜面培养基上，20～40℃培养20～30h，将经过干热灭菌的碳酸钙少许加入到斜面上，将液体试管培养基灌入试管内，换上灭菌的橡皮塞，置冰箱2～4℃保藏。该方法保藏的醋酸菌种能够减少传代次数，即减少变异的机率。并且此方法制作简单，保藏期可达2年，用时用斜面培养基活化2次，即可投入生产，不需要繁琐的操作过程。另外不需要任何昂贵的仪器，即可以达到保藏的目的，适于大规模生产并且可以降低成本，减少能耗。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的保藏方法，尤其涉及一种长期保藏微生物的方法。
背景技术
菌种是国家的重要资源，是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产更离不开菌种。所以，菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分，其任务是采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死亡减少到最低限度。
微生物菌种中醋酸菌的常规保藏方法是斜面保藏和液体石蜡保藏，需要定期传代。但醋酸菌不同于其它菌种，它非常容易变异，而定期的斜面传代又增加了退化和变异的几率，这样会使优选获得的宝贵菌种资源得而复失，甚至会给工业生产造成很大的损失及危害。
发明内容
本发明提供一种能够保藏时间长，不易变异的微生物的保藏方法，了为实现该技术目的，其技术方案如下：
一种长期保藏微生物菌种的方法，包括以下步骤：
(1)培养基的重量配比为：酵母膏0.5～2％，葡萄糖0.5～2％，碳酸钙1～3％，水93％～98％；
(2)培养基分装灭菌：将培养基组份混溶后倒入三角瓶内，灭菌20～30min，在无菌室内待培养基冷却至40～70℃时加入除菌的无水乙醇水溶液，分装试管摇匀，摆成斜面，冷却后20～40℃培养40～60h，如果干净无菌，可用于下一步的菌种培养；
(3)接种培养保藏：把菌种接种到斜面培养基上，20～40℃培养20～30h，将经过干热灭菌的碳酸钙少许加入到斜面上，将液体试管培养基灌入试管内，换上灭菌的橡皮塞，置冰箱2～4℃保藏。
如上所述的长期保藏微生物菌种的方法，其中所述的微生物菌种为醋酸菌。
如上所述的长期保藏微生物菌种的方法，其中在步骤(1)中的培养基的重量配比为：酵母膏1％，葡萄糖1％，碳酸钙1％，水97％。
如上所述的长期保藏微生物菌种的方法，其中在步骤(2)中的培养基灭菌时间为25min。
如上所述的长期保藏微生物菌种的方法，其中在步骤(2)中灭菌后冷却的温度为60℃。
如上所述的长期保藏微生物菌种的方法，其中在步骤(2)中加入的除菌的无水乙醇水溶液的浓度是4％。
如上所述的长期保藏微生物菌种的方法，其中在步骤(2)中将试管摆成斜面后冷却至30℃，培养48h。
如上所述的长期保藏微生物菌种的方法，其中在步骤(3)是在菌种接种后，在30℃下培养24h。
如上所述的长期保藏微生物菌种的方法，其中在步骤(3)中的碳酸钙在200℃下灭菌2h。
如上所述的长期保藏微生物菌种的方法，其中在步骤(3)中的，液体试管培养内液体的高度为2cm。
采用了本发明提供的微生物保藏方法，与现有技术相比其有益效果体现在：
(1)能够减少传代次数，即减少变异的机率对于一般的冷冻干燥设备就可以起到很好的保藏效果。
(2)此方法制作简单，保藏期可达2年，用时用斜面培养基活化2次，即可投入生产，不需要繁琐的操作过程。
(3)不需要任何昂贵的仪器，即可以达到保藏的目的，适于大规模生产并且可以降低成本，减少能耗。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明：
本发明的实施例所使用到的材料和仪器：
菌种：恶臭醋酸杆菌(Acetobacter Rancens as 1.41)：购于中国科学院微生物研究所。
培养基：(1)斜面培养基：酵母膏1％，葡萄糖1％，碳酸钙2％，其余为水。融化后倒入三角瓶内，于0.1MPa灭菌30min，在无菌室内待培养基冷却至60℃时加入除过菌的4％无水乙醇。分装试管摇匀，摆成斜面，冷却后30℃培养48h。观察试管斜面干净无菌，方可用于实验；2)液体培养基：酵母膏1％，葡萄糖1％，其余为水。分装试管于0.1MPa灭菌30min，在无菌室内待培养基冷却至60℃时加入除过菌的4％无水乙醇，30℃培养2d，观察试管内清亮无菌，方可用于实验；(3)产酸培养基：其三角瓶增殖培养基为5°Bx-6°Bx麦芽汁糖化液，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.03％，分装三角瓶，装量为20mL/300mL三角瓶，用中间为棉花的6层纱布和牛皮纸封口，0.1MPa灭菌30min，在无菌室内待培养基冷却到60℃时，加入除过菌的4％无水乙醇，30℃培养2d，观察培养基清亮无菌，才能进行实验，产酸培养基的含量及制作方法均同三角瓶增殖培养基，培养基装量为100mL/1000mL三角瓶，无菌室内加入除过菌的5.5％无水乙醇。
仪器：OLYMPUS BH-2生物显微镜，MJ-II型恒温培养箱，FA上皿电子天平，超净工作台，总酸的测定：采用NaOH滴定法。
实施例1
把As 1.41菌种接种到斜面培养基上，30℃培养24h，将经过200℃干热灭菌2h的碳酸钙少许加入到斜面上，将液体试管培养基灌入试管内，高度至管口2cm，换上灭菌的橡皮塞。置冰箱2～4℃保藏。分别保藏3、6、9、12、15、18、21、24月后取出观察，若干天后将该保藏法保藏的醋酸菌接种于增殖三角瓶内，30″C静置培养48h，然后按10％接种量转移到产酸三角瓶内，30℃静置培养，每天测定酸度。7d后结束发酵实验。
对比实施例1：
把As1.41菌种接种到斜面培养基上30℃培养24h后，换上灭菌的橡皮塞置冰箱2～4℃保藏，。分别保藏3、6、9、12、15、18、21、24月后取出观察，将该保藏法保藏的醋酸菌接种于增殖三角瓶内，30℃静置培养48h，然后按10％接种量转移到产酸三角瓶内，30℃静置培养，每天测定酸度。7d后结束发酵实验。
对比实施例2：
把As1.41菌种接种到斜面培养上，30℃培养24h后，灌入冷却后的经过0.1MPa灭30min和200℃干热灭菌24h的液体石蜡，灌至斜面方1cm高度塞上橡皮塞，置冰箱2～4℃保藏，分别保藏3、6、9、12、15、18、21、24月后取出观察，若干天后将该保藏法保藏的醋酸菌接种于增殖三角瓶内，30″C静置培养48h，然后按10％接种量转移到产酸三角瓶内。30℃静置培养，每天测定酸度。7d后结束发酵实验。
对比实施例3：
把As1.41菌种接种到液体试管内，30℃培养36h，待液面长出白色的菌膜，有清香味时放入适量的碳酸钙，换上灭菌的橡皮塞，置冰箱2～4℃保藏，分别保藏3、6、9、12、15、18、21、24月后取出观察，若干天后将该保藏法保藏的醋酸菌接种于增殖三角瓶内，30″C静置培养48h，然后按10％接种量转移到产酸三角瓶内。30℃静置培养，每天测定酸度，7d后结束发酵实验。
检测结果实施例：
(一)各种保藏方法保藏期限的存活期限的检测
把As1.41菌种接种到斜面培养基试管和液体培养基试管内，待斜面上长满菌苔和液体表面长有薄膜和清香味时，按照4种保藏方法处理，置2℃～4℃冰箱内保藏，每过3个月接种到各方法所用的培养基上观察其存活情况，结果见表1。
表1：4种保藏方法保藏醋酸菌的存活时间
| 时间/月 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 | 18 | 21 | 24 |
| 对比实施例1 | + | - | ||||||
| 对比实施例2 | ++ | ++ | + | - | ||||
| 对比实施例3 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | + | - | |
| 实施例1 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | + |
注：“十”表示生长，“++”表示生长良好，“-”表示不生长。
从表1可以看出，醋酸菌经斜面保藏法即对比实施例1保藏的期限不超过3个月；经液体石蜡保藏法即对比实施例2保藏的期限不超过9个月；经液体保藏法即对比实施例3保藏的期限不能超过18个月；经本实施例的方法保藏的期限可以达到24个月。造成醋酸菌菌种保藏期限受到限制的原因之是醋酸菌所产的酸。虽然醋酸菌具有一定的抗酸性，但随着保藏时间的延长，醋酸菌一直处在酸性环境中，会被自己产的酸所杀灭，醋酸菌中，特别是能产生香酯的菌种.每过十几天即死亡。斜面保藏和液体石蜡保藏虽然培养基内加了碳酸钙，但有部分碳酸钙在底部沉淀，和醋酸菌接触不充分；液体保藏的碳酸钙是在醋酸菌培养结束后加到液体内.以中和所产的酸；而实施例1中保藏的醋酸菌在试管斜面上充分接触氧气，长出丰厚的菌苔，菌种生长的很健壮后又加入碳酸钙和液体培养基，使菌种在生长和保护方面较液体保藏更加先进了一步，相比之下保藏效果更好一些。
(二)四种保藏方法菌种活性的检测
将经过4种方法保藏的醋酸菌转接到斜面培养基上，30℃培养若干天观察其在斜面生长情况，并显微镜检菌体形态，结果见表2。
表2：4种保藏方法保藏的醋酸菌经保藏后的斜面生长情况
| 实施例 | 保藏期/月 | 生长时间/h | 生长状况 | 菌体形态 |
| 对比实施例1 | 3 | 96 | 针状小点 | 不规则，成链少 |
| 对比实施例2 | 9 | 72 | 针状小点 | 不规则，成链少 |
| 对比实施例3 | 18 | 48 | 菌苔较薄 | 规则，2～3个成链状 |
| 实施例 | 24 | 48 | 菌苔丰厚 | 规则，3～4成链状居多 |
醋酸菌经过一段时间的保藏后，在斜面培养基上生长的情况能反映出菌种活力的强弱及衰老的程度。一株醋酸菌在平板分离的瞬间就有改变其原来性质的可能性。如传代次数过多就有可能使醋酸菌发生变异。延长保藏期限，减少传代次数是保藏醋酸菌的必要措施。从表2可以看出，4种保藏方法进行斜面观察时其转接间隔时间分别为3个月、9个月、18个月、24个月的醋酸菌在斜面培养基上生长的时间分别为96h、72h、48h、48h。由于接种时取1环接种，正常生长应该是长满划线的位置，但斜面法即对比实施例1中的方法致液体石蜡法保藏的醋酸菌在第96h和第72h才能见到明显的单个、稀疏的小菌落。菌体形态不规则，说明长势弱，大部分菌已经死亡。液体法对比实施例3保藏的菌种在第48h可见清晰的菌苔，菌体形态规则，兑明菌种长势好，死亡少。而实施例1中的保藏法保藏的菌种在第48h可见清晰凸现的菌苔，菌体形态规则、健壮，说明长势好，活性恢复快、死亡少。
(三)4种保藏方法保藏醋酸菌的产酸能力比较
将经4种保藏方法保藏在有效保藏期内的醋菌，在斜面培养基上转接2代后，接种到二角瓶中30℃静置培养48h，按10％接种量接种到产酸培养中，30℃静置发酵7d，每天测定酸度，结果见表3。
表3：各种保藏方法醋酸菌产酸效果
从表3中可以看出，以4种方式保藏的醋酸菌的发酵产酸量在第6d分别为3.29g/100mL、3.50g/100mL、4.07g/100mL、4.49g/100mL，后面3种方法较斜面法产酸量分别高6％、19.2％、26.7％，说明由于传代次数少。液体石蜡保藏法和液体保藏法均比斜面保藏法的产酸量高，斜面液体保藏法的醋酸菌较好的保持了产酸性能和活性，产酸量最高。
Claims (10)
1.一种长期保藏微生物菌种的方法，包括以下步骤：
(1)培养基的重量配比为：酵母膏0.5～2％，葡萄糖0.5～2％，碳酸钙1～3％，水93％～98％；
(2)培养基分装灭菌：将培养基组份混溶后倒入三角瓶内，灭菌20～30min，在无菌室内待培养基冷却至40～70℃时加入除菌的无水乙醇水溶液，分装试管摇匀，摆成斜面，冷却后20～40℃培养40～60h，如果观察到干净无菌，可用于下一步的菌种培养；
(3)接种培养保藏：把菌种接种到斜面培养基上，20～40℃培养20～30h，将经过干热灭菌的碳酸钙少许加入到斜面上，将液体试管培养基灌入试管内，换上灭菌的橡皮塞，置冰箱2～4℃保藏。
2.如权利要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于：所述的微生物菌种为醋酸菌。
3.如权利要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于：在步骤(1)中的培养基的重量配比为：酵母膏1％，葡萄糖1％，碳酸钙1％，水97％。
4.如权利要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于：在步骤(2)中的培养基灭菌时间为25min。
5.如权利要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于：在步骤(2)中灭菌后冷却的温度为60℃。
6.如权利要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于：在步骤(2)中加入的除菌的无水乙醇水溶液的浓度是4％。
7.如权利要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于：在步骤(2)中将试管摆成斜面后冷却至30℃，培养48h。
8.如权利要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于：在步骤(3)是在菌种接种后，在30℃下培养24h。
9.如权利要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于：在步骤(3)中的碳酸钙在200℃下灭菌2h。
10.如权利要求1所述的长期保藏微生物菌种的方法，其特征在于：在步骤(3)中的，液体试管培养内液体的高度为2cm。
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