CN106908526B - 动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法和应用。将样品直接绞碎均质后加水匀浆，采用乙酸乙酯为提取溶剂，经正己烷脱脂净化后，用液相色谱‑串联质谱仪检测，外标法定量。本发明首次提供了一种动物源性食品中得曲恩特残留检测的标准方法，也填补了本领域技术空白。本发明回归方程相关系数达到0.99以上，测定低限为0.3µg/kg，在0.3µg/kg～3µg/kg添加浓度水平上的回收率为80%～120%，实验室内相对标准偏差≤20%。本发明方法操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量科学准确，能够为我国相关监管部门制定得曲恩特最高残留限量提供技术支持。

Description

动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法和应用
技术领域
本发明涉及兽药残留的检测技术领域，更具体地，涉及一种动物源性材料尤其是羊肉、羊肝或羊肾中得曲恩特残留的测定方法和应用。
背景技术
动物源性食品中兽药的残留直接影响人体的健康。
得曲恩特(Derquantel)，别名2-Deoxoparaherquamide，分子式为C28H37N3O4，分子量为分子量为479.61100，其结构式如式(Ⅰ)所示：
得曲恩特(Derquantel)是一种新型高效的家畜用驱肠线虫药，目前仅用于绵羊。新西兰食品安全局(NZFSA)2010年对新西兰食品中农药化合物最大残留限量标准进行修改。新标准规定绵羊肥/瘦肉及内脏内的得曲恩特(Derquantel)的最高残留限量MRL：0.1mg/kg；我国食品法典委员会(CAC)2015年增加了该药的最高残留限量MRL：羊肉0.3μg/kg，羊肝0.8μg/kg，羊肾0.4μg/kg。
目前尚未有动物源性食品中得曲恩特残留量检测的标准方法，也未见任何相关检测方法的文献报道。得曲恩特检测方法的缺乏，难以为我国相关监管部门制定得曲恩特最高残留限量提供技术支持。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于针对得曲恩特残留检测的技术不足，提供一种动物源性材料或食品中得曲恩特残留量的测定方法。
本发明要解决的另一技术问题是提供所述检测方法的应用，尤其是在羊肉、羊肝和/或羊肾食品中得曲恩特残留量测定方面的应用。
本发明目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种动物源性材料或食品中得曲恩特残留量的测定方法，是将动物源性材料直接绞碎至匀浆和均质得到待测样品，采用乙酸乙酯为提取溶剂提取待测样品，经正己烷脱脂净化后，用液相色谱-串联质谱仪检测，外标法定量；所述液相色谱-串联质谱仪测定条件为：
液相色谱条件为：
色谱柱：Atlantis T3(4.6mm×100mm，粒径3μm)，或相当者；
流动相：乙腈-5mM甲酸水溶液(45+55，体积比)；流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压IS：5000V；CUR：35；CAD：medium；辅助加热气温度：550℃；GS1：65；GS2：70；去集簇电压DP：180V；入口电压EP：10V；碰撞池出口电压CXP：10V；驻留时间：0.1s；定性离子对和碰撞能量：480.3>405.3，碰撞能量40V；480.3>148.2，碰撞能量50V；定量离子对：480.3>405.3。
优选地，所述加水匀浆处理的条件为12000r/min下匀浆处理30s；加水的量按照动物源性材料与水的质量体积比为5±0.05g：10mL确定。
优选地，所述采用乙酸乙酯提取是提取两次，合并两次提取液并定容，取上清液于玻璃试管中40℃氮吹浓缩至干；所述定容采用的定容液是乙腈与5mM甲酸水溶液按照体积比1:1混匀所得。
优选地，所述乙酸乙酯提取的第一次提取是水平振荡提取15min，离心处理；所述乙酸乙酯提取的第二次提取是水平振荡提取10min，离心处理；
所述的离心处理是在4000r/min条件下离心处理5min。
优选地，所述正己烷脱脂净化是将乙酸乙酯提取所得液体经漩涡处理后静置分层，弃正己烷层；再加正己烷，重复脱脂一次。
本发明检测方法具体步骤如下：
S1.样品预处理：
S11.取动物源性可食性组织，绞碎，并均质，分别得到供试试料、空白试料和空白添加试料；将所得供试试料、空白试料和空白添加试料进行检测或于-18℃以下保存备用；
所述供试试料、空白试料和空白添加试料的制备方法分别为具体是取动物源性可食性组织，绞碎，并均质；取均质后的供试样品，作为供试试料；取均质后的空白样品，作为空白试料；取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
S12.提取：
称取试料加水后匀浆处理得匀浆试料；取乙酸乙酯洗涤匀浆用刀头，洗涤液与匀浆试料合并，第一次提取后离心处理，取乙酸乙酯层于比色管中，残渣加乙酸乙酯再提取一次，合并两次提取液并定容，取上清液于玻璃试管中40℃氮吹浓缩至干。
S13.净化：
往步骤S12吹干的玻璃试管中加入定容液，溶解待测化合物，第一次旋涡处理，加溶剂脱脂处理，第二次旋涡处理，取脱脂处理后的下层溶液离心处理，滤膜过滤，得到待测试液，进行液相色谱-串联质谱测定。
步骤S12中，试料与水的质量体积比为5±0.05g：10mL。
步骤S12中，所述匀浆处理的条件为12000r/min下匀浆处理30s。
步骤S12中，所述第一次提取是水平振荡提取15min。所述的离心处理是在4000r/min条件下离心处理5min。
步骤S13中，所述的定容液的制备方法为取50mL乙腈和50mL 5mM甲酸水溶液，充分混匀，备用。
步骤S13中，所述第一次旋涡处理的时间为2min，所述第二次旋涡处理的时间为1min。
步骤S13中，所述溶剂为正己烷，所述脱脂处理是第一次加正己烷，旋涡处理，静置分层，弃正己烷层，再加正己烷，重复脱脂一次。
步骤S13中，所述离心处理是在12000r/min下离心处理5min。
S2.进行液相色谱-串联质谱测定：
S21.标准曲线的制备
精密量取100ng/mL得曲恩特标准工作液适量，用定容液稀释，配制成得曲恩特浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0μg/L的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。以得曲恩特的特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；
S22.液相色谱-串联质谱仪测定条件：
其中，液相色谱条件为：
色谱柱：Atlantis T3(4.6mm×100mm，粒径3μm)，或相当者；
流动相：乙腈－5mM甲酸水溶液(45+55，体积比)；流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压IS：5000V；CUR：35；CAD：medium；辅助加热气温度：550℃；GS1：65；GS2：70；去集簇电压DP：180V；入口电压EP：10V；碰撞池出口电压CXP：10V；驻留时间：0.1s；定性离子对和碰撞能量：480.3>405.3，碰撞能量40V；480.3>148.2，碰撞能量50V；定量离子对：480.3>405.3。
本发明同时提供所述检测方法的应用，应用于动物源性材料的得曲恩特残留检测，包括定性检测或定量检测。
所述定性检测方法为：通过试料色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性。试料与标准品保留时间的相对偏差不大于5％；试料特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过规定值，则可判断试样中存在相应的被测物。
所述定量检测方法为：取试料溶液和标准溶液，按外标法以峰面积计算。标准溶液及试料溶液中的得曲恩特的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
标准曲线校准：由As＝a×cs+b求得a和b，则
试料中得曲恩特残留量按式(Ⅱ)计算：
式中：
As————标准溶液中得曲恩特的峰面积；
cs————标准溶液中得曲恩特的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
c————试料溶液中得曲恩特的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
A————试料中得曲恩特的峰面积；
X————供试试料中得曲恩特的残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
V————溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；
m————供试试料质量，单位为克(g)。
D————稀释倍数。
上述公式中稀释倍数为5。其中，计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
优选地，本发明检测方法可以更好地应用于羊肉、羊肝或羊肾中得曲恩特残留量的测定。
本发明的有益效果如下：
本发明首次提供了一种动物源性材料(食品)中得曲恩特残留检测的标准方法，也填补了本领域技术空白。本发明直接将样品绞碎加水匀浆处理，本发明优化了提取和净化处理步骤和条件，样品处理操作简单，不用添加复杂的化学试剂。基于所述样品前处理所得待测溶液，本发明针对性提供了检测方法和检测条件，成功建立了动物源性材料(食品)中得曲恩特残留检测的标准方法。
本发明回归方程相关系数达到0.99以上，测定低限为0.3μg/kg，在0.3μg/kg～3μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～120％，实验室内相对标准偏差≤20％。
本发明方法操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量科学准确，能够为我国相关监管部门制定得曲恩特最高残留限量提供技术支持。
附图说明
图1得曲恩特标准溶液特征离子质量色谱图(0.2μg/L)，(480.3>405.3)。
图2得曲恩特标准溶液特征离子质量色谱图(0.2μg/L)，(480.3>148.2)。
图3羊肉空白试样特征离子质量色谱图，(480.3>405.3)。
图4羊肉空白试样特征离子质量色谱图，(480.3>148.2)。
图5羊肉空白添加得曲恩特试样特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(480.3>405.3)。
图6羊肉空白添加得曲恩特试样特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(480.3>148.2)。
图7羊肝空白试样特征离子质量色谱图，(480.3>405.3)。
图8羊肝空白试样特征离子质量色谱图，(480.3>148.2)。
图9羊肝空白添加得曲恩特试样特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(480.3>405.3)。
图10羊肝空白添加得曲恩特试样特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(480.3>148.2)。
具体实施方式
下面结合附图和实施过程对本发明作进一步说明，除非特别说明，本发明采用的试剂及仪器为本技术领域常规的试剂及仪器。
实施例1：羊肉或羊肝中得曲恩特检测
1.以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。
得曲恩特标准品：含量≥98％。乙腈：色谱纯。乙酸乙酯。正己烷。甲酸：色谱纯。5mM甲酸水溶液：取甲酸192μL，用水溶解并稀释至1000mL。
定容液：取50mL乙腈和50mL 5mM甲酸水溶液，充分混匀，备用。
100μg/mL得曲恩特标准贮备液：精密称取得曲恩特标准品10mg，于100mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100μg/mL的得曲恩特标准贮备液，-18℃以下避光保存。
5μg/mL得曲恩特标准中间液：精密量取100μg/mL的得曲恩特标准贮备液5.00mL，于100mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为5μg/mL的得曲恩特标准中间液，-18℃以下避光保存。
100ng/mL得曲恩特标准工作液：精密量取5μg/mL得曲恩特标准中间液1.00mL，于50mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为100ng/mL的乙腈标准工作液，-18℃以下避光保存。
2.仪器和设备
液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。分析天平：感量0.00001g。天平：感量0.01g。肉类组织捣碎机。旋涡振荡器。水平振荡仪。组织匀浆机。离心机。氮吹仪。离心管：50mL。离心管：1.5mL。滤膜：0.22μm。
3.试料的制备与保存
S11.试料的制备
取羊肉或羊肝空白或供试可食性组织，绞碎，并使均质。-18℃以下保存。
——取均质后的供试样品，作为供试试料。
——取均质后的空白样品，作为空白试料。
——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
S12.提取
称取试料5g±0.05g，于50mL离心管中，加水10mL，12000r/min匀浆30s，另取一50mL离心管加乙酸乙酯25mL，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液合并入第一支离心管中，水平振荡提取15min，4000r/min离心5min，取乙酸乙酯层于50mL比色管中，残渣加乙酸乙酯20mL再提取一次，合并两次提取液并定容至50mL，分取上清液10mL于玻璃试管中，40℃氮吹浓缩至干。
S12.净化
吹干的玻璃试管中加1mL前述定容液溶解待测化合物，旋涡2min，加正己烷3mL，旋涡1min，静置分层，弃正己烷层，再加正己烷3mL，重复脱脂一次，取下层溶液于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。
S2.液相色谱-串联质谱测定
S21.标准曲线的制备
精密量取100ng/mL得曲恩特标准工作液适量，用定容液稀释，配制成得曲恩特浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0μg/L的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。以得曲恩特的特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
S22.测定
液相色谱条件：
色谱柱：Atlantis T3(4.6mm×100mm，粒径3μm)，或相当者。
流动相：乙腈－5mM甲酸水溶液(45+55，体积比)。流速：0.35mL/min。柱温：40℃。进样量：5μL。
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源。扫描方式：正离子扫描。检测方式：多反应监测。喷雾电压IS：5000V。CUR：35。CAD：medium。辅助加热气温度：550℃。GS1：65。GS2：70。去集簇电压DP：180V。入口电压EP：10V。碰撞池出口电压CXP：10V。驻留时间：0.1s。定性离子对和碰撞能量：480.3>405.3，碰撞
S23.测定法
定性测定：通过试料色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性。试料与标准品保留时间的相对偏差不大于5％；试料特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断试样中存在相应的被测物。
表1相对离子丰度的允许偏差范围
相对离子丰度％ ＞50 ＞20～50 ＞10～20 ≤10
允许的相对偏差％ ±20％ ±25 ±30 ±50
定量测定：
取试料溶液和标准溶液，按外标法以峰面积计算。标准溶液及试料溶液中的得曲恩特的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱-质谱条件下，标准溶液、空白试料溶液和空白添加试料溶液中特征离子质量色谱图见附图1～10所示。
1.空白试验
除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。
2.结果计算
标准曲线校准：由As＝a×cs+b求得a和b，则
试料中得曲恩特残留量按式(Ⅱ)计算：
式中：
As————标准溶液中得曲恩特的峰面积；
cs————标准溶液中得曲恩特的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
c————试料溶液中得曲恩特的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
A————试料中得曲恩特的峰面积；
X————供试试料中得曲恩特的残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
V————溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；
m————供试试料质量，单位为克(g)。
D————稀释倍数。
上述公式中稀释倍数为5。其中，计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
本实施例得曲恩特标准溶液特征离子质量色谱图见图1所示，得曲恩特标准溶液特征离子质量色谱图见图2所示，羊肉空白试样特征离子质量色谱图见图3所示，羊肉空白试样特征离子质量色谱图见图4所示，羊肉空白添加得曲恩特试样特征离子质量色谱图见图5所示，羊肉空白添加得曲恩特试样特征离子质量色谱图见图6所示，羊肝空白试样特征离子质量色谱图见图7所示，羊肝空白试样特征离子质量色谱图见图8所示，羊肝空白添加得曲恩特试样特征离子质量色谱图见图9所示，羊肝空白添加得曲恩特试样特征离子质量色谱图见图10所示。
实施例2本发明检测方法灵敏度、准确度和精密度试验
灵敏度试验方法如下：
定量限的确定，是根据信噪比(S/N)的值来确定的。在空白羊肉和羊肝中分别添加0.3μg/kg的得曲恩特标准溶液，测定其信号与噪声的比值，当S/N≥10时且回收率和相对标准偏差均符合残留检测方法要求时的浓度为定量限。实验结果：本方法的定量限为0.3μg/kg。
准确度试验方法如下：
准确称取5.0g空白试料于50mL离心管中，加入己知浓度的系列标准工作液，制成含得曲恩特药物浓度分别为0.3、0.6、3.0μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算加标回收率。实验结果：本方法在0.3μg/kg～3μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～120％。
精密度试验方法如下：
准确称取5.0g空白试料于50mL离心管中，加入己知浓度的系列标准工作液，制成含得曲恩特药物浓度分别为0.3、0.6、3.0μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算室内相对标准偏差。实验结果：本方法的实验室内相对标准偏差≤20％。

Claims (10)

1.一种动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法，其特征在于，是将动物源性材料直接绞碎均质后加水匀浆处理后采用乙酸乙酯提取，提取液经正己烷脱脂净化后得到待测试液，用液相色谱-串联质谱仪定性或定量检测待测试液，所述定量检测采用外标法；所述液相色谱-串联质谱仪测定条件为：
液相色谱条件为：
色谱柱：Atlantis T3；
流动相：体积比为45：55的乙腈-5mM甲酸水溶液；流速：0.35 mL/min；柱温：40℃；进样量：5 µL；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压IS：5000 V；CUR：35；CAD：medium；辅助加热气温度：550℃；GS1：65；GS2：70；去集簇电压DP：180V；入口电压EP：10 V；碰撞池出口电压CXP：10 V；驻留时间：0.1 s；定性离子对和碰撞能量：480.3>405.3，碰撞能量40 V；480.3>148.2，碰撞能量50 V；定量离子对：480.3>405.3。
2.根据权利要求1所述动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法，其特征在于，所述加水匀浆处理的条件为12000r/min下匀浆处理30 s；加水的量按照动物源性材料与水的质量体积比为5±0.05 g：10 mL确定。
3.根据权利要求1所述动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法，其特征在于，所述采用乙酸乙酯提取是提取两次，合并两次提取液并定容，取上清液于玻璃试管中40℃氮吹浓缩至干；所述定容采用的定容液是乙腈与5mM甲酸水溶液按照体积比1:1混匀所得。
4.根据权利要求3所述动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法，其特征在于，所述乙酸乙酯提取的第一次提取是水平振荡提取15 min，离心处理；所述乙酸乙酯提取的第二次提取是水平振荡提取10min，离心处理；
所述的离心处理是在4000 r/min条件下离心处理5 min。
5.根据权利要求1所述动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法，其特征在于，所述正己烷脱脂净化是将乙酸乙酯提取所得液体经漩涡处理后静置分层，弃正己烷层；再加正己烷，重复脱脂一次。
6.根据权利要求1至5任一项所述动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.样品预处理；
S11. 取动物源性可食性组织，绞碎，并均质，取均质后的供试样品，作为供试试料；取均质后的空白样品，作为空白试料；取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料；将所得供试试料、空白试料和空白添加试料进行检测或于-18℃以下保存备用；
S12.提取：
称取试料加水后匀浆处理得匀浆试料；取乙酸乙酯洗涤匀浆用刀头，洗涤液与匀浆试料合并，第一次提取后离心处理，取乙酸乙酯层于比色管中，残渣加乙酸乙酯再提取一次，合并两次提取液并定容，取上清液于玻璃试管中40℃氮吹浓缩至干；
S13.净化：
往步骤S12吹干的玻璃试管中加入定容液，溶解待测化合物，第一次旋涡处理，加溶剂脱脂处理，第二次旋涡处理，取脱脂处理后的下层溶液离心处理，滤膜过滤，得到待测试液，进行液相色谱-串联质谱测定；
S2.进行液相色谱-串联质谱测定：
S21.制备得曲恩特标准工作液的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定；以得曲恩特的特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；
S22.液相色谱-串联质谱仪测定；
所述液相色谱-串联质谱仪测定的条件为：
液相色谱条件为：
色谱柱： Atlantis T3；
流动相：体积比为45：55的乙腈－5mM甲酸水溶液；流速：0.35 mL/min；柱温：40℃；进样量：5 µL；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压IS：5000 V；CUR：35；CAD：medium；辅助加热气温度：550℃；GS1：65；GS2：70；去集簇电压DP：180V；入口电压EP：10 V；碰撞池出口电压CXP：10 V；驻留时间：0.1 s；定性离子对和碰撞能量：480.3>405.3，碰撞能量40 V；480.3>148.2，碰撞能量50 V；定量离子对：480.3>405.3。
7.根据权利要求6所述动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法，其特征在于，步骤S12中，试料与水的质量体积比为5±0.05 g：10 mL；步骤S12中，所述匀浆处理的条件为12000r/min下匀浆处理30 s；所述第一次提取是水平振荡提取15 min；所述的离心处理是在4000 r/min条件下离心处理5 min。
8.根据权利要求6所述动物源性材料中得曲恩特残留的测定方法，其特征在于，步骤S13中，所述脱脂处理是第一次加正己烷，第一次旋涡处理2 min，静置分层，弃正己烷层，再加正己烷，第一次旋涡处理1 min。
9.权利要求1至8任一项所述测定方法的应用，其特征在于，应用于定性检测或定量检测动物源性材料中得曲恩特残留；
所述定性检测方法为：通过试料色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性；试料与标准品保留时间的相对偏差不大于5％；试料特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过规定值，判断试样中存在相应的被测物；
所述定量检测方法为：取试料溶液和标准溶液，按外标法以峰面积计算。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，应用于羊肉、羊肝或羊肾中得曲恩特残留的测定。
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