CN106908502A - 碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法 - Google Patents

碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，涉及电化学传感技术领域。本发明提供了一种新型制备碳包覆磁性铁氧体的方法，并将其运用在制作葡萄糖传感器酶电极中，基于碳包覆磁性铁氧体具有比表面积大、生物相容性好的特点，采用碳包覆磁性铁氧体修饰酶电极有利于葡萄糖氧化酶的固定，增加电极表面酶的负载量；同时，本发明采用磁性功能化石墨，其表面颗粒具有粒径小、导电性好、吸附能力强的特点，减少了葡萄糖氧化酶活性中心与电极之间的距离，有利于电子快速传递。本发明提供的葡萄糖传感器酶电极在应用中具有性能稳定、灵敏度高的优势，可广泛应用于临床、医药以及食品工业等领域。

Description

碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法
技术领域
本发明属于电化学传感技术领域，具体为一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法。
背景技术
葡萄糖是动植物体内碳水化合物的主要组成部分，其定量测定在生物化学、临床化学和食品分析中具有重要的地位。葡萄糖传感器是生物传感器领域研究最多的生物传感器。目前以葡萄糖氧化酶为基础的酶电极葡萄糖传感器正受到越来越广泛的关注。
葡萄糖氧化酶酶(GOx)是一种能对β-D-葡萄糖进行专一性催化的高分子物质。利用其高催化活性和生物分子识别的特点，GOx常被选为葡萄糖传感器中首选的活性物质，具体机理为：葡萄糖氧化酶酶(GOx)氧化葡萄糖为葡萄糖酸，并且放出电子，同时溶液中的氧气被还原为过氧化氢，通过检测生成的过氧化氢能够反映葡萄糖的含量。
现有技术中，将葡萄糖氧化酶酶(GOx)固定在具有生物相容性的电极表面可发生一个相当快的电子传递反应，利用该电子传递性质可以对底物分子进行电化学测定。然而，葡萄糖氧化酶酶(GOx)的氧化还原活性中心黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)被包埋在一层厚厚的蛋白质中，不能接近电极表面，难以实现黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)与电极间的快速的电子传递。因此如何对电极表面进行修饰和处理，在实现固定葡萄糖氧化酶的同时，能够减小葡萄糖氧化酶酶(GOx)的活性中心与电极表面之间的距离，进而实现黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的快速电子传递，成为葡萄糖传感器应用需要解决的技术问题。
发明内容
鉴于克服现有技术的不足，本发明提供一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，该制备方法制得的葡萄糖传感器酶电极能够实现黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)与电极间的快速的电子传递，具有线性范围广、性能稳定、灵敏度高、生物相容性好的特点。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，包括如下步骤：
步骤A：制备碳包覆磁性铁氧体；
A1：将草酸亚铁溶解于酸溶液中制得草酸亚铁酸性溶液，在惰性气体氛围下搅拌均匀，并逐滴加入三乙胺至溶液颜色不再加深为止，继续搅拌至溶液中产生墨绿色颗粒，得到第一混合溶液；
A2：将氧化石墨经超声处理溶解于去离子水中制得氧化石墨溶液；将所述第一混合溶液与氧化石墨溶液混合制得第二混合溶液，在惰性气体氛围下搅拌6～24小时，然后将溶液滤出后充分洗涤磁性产物，将所述磁性产物在真空条件下进行高温处理，制得碳包覆磁性铁氧体；
步骤B：制备葡萄糖传感器酶电极；
将步骤A制得的碳包覆磁性铁氧体溶解于去离子水中制得碳包覆磁性铁氧体悬浮液，然后将碳包覆磁性铁氧体悬浮液滴蘸在经过预处理的工作电极上，常温条件下在惰性气体氛围中进行干燥处理；然后将葡萄糖氧化酶溶解于pH缓冲液配制得到葡萄糖氧化酶溶液，所述pH缓冲液的pH值为6.8～7.4，采用物理吸附法将葡萄糖氧化酶固定在所述工作电极上，经干燥处理得到葡萄糖传感器酶电极。
本发明中步骤A中酸溶液的pH值为3～6，优选为pH＝4的酸溶液；具体组成可以包括稀盐酸、稀硫酸等。
本发明中步骤A中工作电极可以为任何合适的惰性电极，具体为玻碳电极、金电极或者铂电极，作为优选实施方式，选择玻碳电极作为工作电极。
本发明中步骤A中氧化石墨可以直接采用市售氧化石墨，也可以将石墨粉在酸性条件下氧化制备而成，根据本发明优选实施例，氧化石墨的制备方法如下：将石墨粉与质量分数为98％的浓硫酸(简称为98％浓硫酸)混合，其中：石墨粉与98％浓硫酸的混合比例为1g石墨粉与20mL～25mL98％浓硫酸混合，将上述混合溶液置于冰水浴中混合均匀；依次加入硝酸钠和高锰酸钾，使得硝酸钾、高锰酸钾与石墨粉的质量比为0.5～1∶5～8∶2，在常温下对溶液进行搅拌，继而对溶液升温进行搅拌，然后加入去离子水进行稀释后升温至95℃～100℃搅拌均匀，最后加适量去离子水和适量质量份数为30％的过氧化氢溶液终止反应；静置处理后除去上清液得到产物，将上述产物进行离心处理(转速为8000rpm～12000rpm)，离心所得产物首先通过多次酸洗处理，然后再通过多次水洗处理，水洗至溶液无SO4 2-被检测出为止；最终通过干燥处理得到氧化石墨(烘干温度为40℃～80℃)。
本发明中步骤A中氧化石墨溶液的浓度为0.5mg/mL～2mg/mL。
本发明中步骤A中第二混合溶液中碳元素与铁元素的质量比为1∶4～11，最佳比例为10∶78。
通过调控草酸亚铁、三乙胺和氧化石墨之间的不同配比，能够得到具有不同的磁性和结构特征的碳包覆磁性铁氧体。
本发明中步骤A中高温处理的温度为120℃～200℃，处理时间为8～24小时。
本发明中步骤B中碳包覆磁性铁氧体悬浮液的浓度为0.5mg/mL～2mg/mL。
本发明中步骤B中葡萄糖氧化酶溶液的浓度为1mg/mL～10mg/mL。
本发明中步骤B中pH缓冲液是通过磷酸二氢钠或者磷酸二氢钾与磷酸氢二钠或者磷酸氢二钾共同溶解于水中配制而成。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新型制备碳包覆磁性铁氧体的方法，并将其运用在制作葡萄糖传感器酶电极中，基于碳包覆磁性铁氧体具有比表面积大、生物相容性好的特点，采用碳包覆磁性铁氧体修饰酶电极有利于葡萄糖氧化酶的固定，增加电极表面酶的负载量；同时，本发明采用磁性功能化石墨，其表面颗粒具有粒径小、导电性好、吸附能力强的特点，减少了葡萄糖氧化酶活性中心与电极之间的距离，有利于电子快速传递。根据本发明具体实施例可以看出本发明提供的基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极能够对浓度在0.5～10mM范围内的葡萄糖溶液进行检测，并且具有性能稳定、灵敏度高的优势。此外，本发明提供的制备基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的方法流程简单，成本低廉，可广泛应用于临床、医药以及食品工业等领域。
附图说明
图1是本发明实施例制得氧化石墨的扫描电镜图。
图2是本发明实施例制得碳包覆磁性铁氧体的扫描电镜图。
图3是本发明实施例制得碳包覆磁性铁氧体的能量色散谱(EDAX)。
图4是本发明实施例制得碳包覆磁性铁氧体的X射线衍射图。
图5是碳包覆磁性铁氧体葡萄糖传感器酶电极和未滴加碳包覆磁性铁氧体悬浮液制备的酶电极在缓冲液中50mV/s下的循环伏安曲线图。
图6是在缓冲盐中逐渐加入葡萄糖的传感器计时电流曲线图。
图7是计时电流曲线的拟合曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施例结合说明书附图对本发明进行详细说明：
实施例1：
制备氧化石墨的方法，具体包括如下步骤：
准确称量1克石墨粉与23mL质量分数为98％的浓硫酸，将二者放于同一容器中，并置于4℃冰水浴中混合均匀；依次缓慢加入0.5g硝酸钠和3g高锰酸钾，在常温下搅拌30分钟，继而将溶液升温至35℃继续搅拌30分钟，然后缓慢加入去离子水升温至98℃搅拌30分钟，最后加入140mL去离子水和30mL质量份数为30％的过氧化氢溶液终止反应；静置处理后除去上清液得到产物，将上述产物进行离心处理(转速为9000rpm)，离心所得产物首先通过1～2次酸洗处理，然后再通过多次水洗处理，直至溶液无SO4 2-被检测出为止；最终在50℃的温度下烘干得到氧化石墨。
如图1所示为本实施例制得氧化石墨的扫描电镜图，从图中可以看出：制备的氧化石墨结构疏松，呈多层结构，适合磁性铁氧体的生长。
实施例2：
一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，包括如下步骤：
步骤A：制备碳包覆磁性铁氧体；
A1：将草酸亚铁溶解于pH＝4的酸溶液中制得浓度为0.04M的草酸亚铁酸性溶液，在氮气氛围下搅拌均匀，并逐滴加入三乙胺(分析纯，99％以上)至溶液颜色不再加深为止，继续搅拌至溶液中产生墨绿色颗粒，得到第一混合溶液；
A2：将实施例1制得的氧化石墨溶解于去离子水中制得浓度为0.06mg/mL的氧化石墨溶液，在100W超声仪中超声处理30分钟；将所述第一混合溶液与氧化石墨溶液等体积混合制得第二混合溶液，在惰性气体氛围下搅拌12小时，得到磁性产物；采用磁铁将磁性产物吸附在反应容器底部后将溶液滤出，然后充分洗涤所得磁性产物，将所述磁性产物置于温度为150℃的真空环境中处理8小时，制得碳包覆磁性铁氧体粉末；
经检测，本发明制得碳包覆磁性铁氧体具有较好的磁性和清水性，即使在悬浊液状态下也可以轻易地被磁铁吸附；
如图2、图3和图4所示分别为本实施例制得碳包覆磁性铁氧体粉末的扫描电镜照片、EDAX图谱和X射线衍射图，从图2中可以看出：碳包覆磁性铁氧体颗粒在氧化石墨的层状结构之间生长，具有很大的比表面性，适合葡萄糖氧化酶的吸附和固定；从图3中可以看出：本发明制备的碳包覆磁性铁氧体含有大量的碳、铁和氧元素；从图3中可以看出：衍射峰涵盖了四氧化三铁以及三氧化二铁的铁相峰。
步骤B：制备葡萄糖传感器酶电极；
本实施例采用玻碳电极作为工作电极，优选地，玻碳电极的直径为3毫米，根据本领域人员公知常识，在制备操作进行前还应对电极进行预处理步骤以除去玻碳电极上的杂质，提高玻碳电极的电化学性能，具体操作为：依次采用分别通过3.0μm和0.05μm氧化铝水浆处理过的抛光布进行打磨得到光滑镜面，然后依次在无水乙醇和去离子水分别超声清洗10分钟，然后用氮气吹干；
将碳包覆磁性铁氧体溶解于去离子水中制得浓度为1mg/mL的碳包覆磁性铁氧体悬浮液，然后使用移液管取2μL碳包覆磁性铁氧体悬浮液滴蘸于上述经预处理后的玻碳电极上，常温条件下在惰性气体氛围中进行干燥处理；
分别准确称取0.1mol磷酸二氢钠和0.1mol磷酸氢二钠，并将二者置于1L容量瓶中，以去离子水作为溶剂进行标定，配制得到pH缓冲液，量取0.1mL待用；
准确称取0.5mg葡萄糖氧化酶，然后溶解于上述0.1mL的pH缓冲溶液中，混合均匀，配制得到葡萄糖氧化酶溶液，然后使用移液管取0.5μL葡萄糖氧化酶溶液滴蘸于上述经碳包覆磁性铁氧体修饰的玻碳电极上，在温度为4℃的氮气环境中进行干燥处理；待干燥处理完成后，将酶电极在上述pH缓冲液轻轻蘸取，移除未被固定的葡萄糖氧化酶，继续在温度为4℃的氮气环境中进行干燥处理，最终制得碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极。
本发明采用滴涂法制备碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极，根据实际操作需要，取液量并不做限制。在本实施例中，移液枪吸取碳包覆磁性铁氧体悬浮液的体积为0.5～3μL，优选为2μL；移液枪吸取吸取葡萄糖氧化酶溶液的体积为0.3～2μL，优选为0.5μL。
将本实施例制得的葡萄糖传感器酶电极组装形成葡萄糖氧化酶生物传感器，并在电化学工作站上测试该生物传感器的性能；
本实施例采用铂电极作为对电极，电极面积1cm2，采用Ag/AgCl标准电极作为参比电极，采用本实施制得的碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极作为工作电极，采用PBS溶液作为测试底液；在-0.65～0.5V的电位范围下，对氮气饱和的PBS溶液进行循环伏安扫描；作为对照，本实施例还将未滴加碳包覆磁性铁氧体悬浮液仅滴加等量葡萄糖氧化酶的玻碳电极置于同样环境下进行对比伏安循环扫描测试；循环伏安扫面的结果如图6所示；从图6中可以看出：在经过碳包覆磁性铁氧体修饰过的酶电极上获得一系列明显的葡萄糖氧化酶的氧化还原峰，而未滴加碳包覆磁性铁氧体悬浮液的酶电极则没有。这说明碳包覆磁性铁氧体修饰的酶电极能够有效地促进葡萄糖氧化酶与电极之间的电子转移。
将碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极置于PBS溶液中，然后逐渐加入葡萄糖，在-0.45V(相对于Ag/AgCl参比电极)的恒定电压下测试响应电流，得到如图6所示计时电流响应结果图；从图6中可以看出：随着葡萄糖浓度的增加，碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的响应电流阶梯式增加。
图7为外加电压为-0.45V的计时电流响应的校准曲线，从图7中可以看出：酶电极在0.5mol/L～10mol/L葡萄糖浓度范围内线性增加，酶电极的灵敏度为4.31μA/mmol。
实施例3：
一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，包括如下步骤：
步骤A：制备碳包覆磁性铁氧体；
A1：将草酸亚铁溶解于pH＝4的酸溶液中制得浓度为0.08M的草酸亚铁酸性溶液，在氮气氛围下搅拌均匀，并逐滴加入三乙胺(分析纯，99％以上)至溶液颜色不再加深为止，继续搅拌至溶液中产生墨绿色颗粒，得到第一混合溶液；
A2：将市售的氧化石墨溶解于去离子水中制得浓度为0.1mg/mL的氧化石墨溶液，在100W超声仪中超声处理30分钟；将所述第一混合溶液与氧化石墨溶液等体积混合制得第二混合溶液，在惰性气体氛围下搅拌12小时，得到磁性产物；采用磁铁将磁性产物吸附在反应容器底部后将溶液滤出，然后充分洗涤所得磁性产物，将所述磁性产物置于温度为150℃的真空环境中处理8小时，制得碳包覆磁性铁氧体粉末；
步骤B：制备葡萄糖传感器酶电极；
本实施例采用玻碳电极作为工作电极，优选地，玻碳电极的直径为3毫米，根据本领域人员公知常识，在制备操作进行前还应对电极进行预处理步骤以除去玻碳电极上的杂质，提高玻碳电极的电化学性能，具体操作为：依次采用分别通过3.0μm和0.05μm氧化铝水浆处理过的抛光布进行打磨得到光滑镜面，然后依次在无水乙醇和去离子水分别超声清洗10分钟，然后用氮气吹干；
将碳包覆磁性铁氧体溶解于去离子水中制得浓度为1mg/mL的碳包覆磁性铁氧体悬浮液，然后使用移液管取1μL碳包覆磁性铁氧体悬浮液滴蘸于上述经预处理后的玻碳电极上，常温条件下在惰性气体氛围中进行干燥处理；
分别准确称取0.1mol磷酸二氢钠和0.1mol磷酸氢二钠，并将二者置于1L容量瓶中，以去离子水作为溶剂进行标定，配制得到pH缓冲液，量取0.1mL待用；
准确称取0.5mg葡萄糖氧化酶，然后溶解于上述0.1mL的pH缓冲溶液中，混合均匀，配制得到葡萄糖氧化酶溶液，然后使用移液管取0.5μL葡萄糖氧化酶溶液滴蘸于上述经碳包覆磁性铁氧体修饰的玻碳电极上，在温度为4℃的氮气环境中进行干燥处理；待干燥处理完成后，将酶电极在上述pH缓冲液轻轻蘸取，移除未被固定的葡萄糖氧化酶，继续在温度为4℃的氮气环境中进行干燥处理，最终制得碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极。
以上结合附图对本发明的实施例进行了阐述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (9)

1.一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：制备碳包覆磁性铁氧体；
A1：将草酸亚铁溶解于酸溶液中制得草酸亚铁酸性溶液，在惰性气体氛围下搅拌均匀，并逐滴加入三乙胺至溶液颜色不再加深为止，继续搅拌至溶液中产生墨绿色颗粒，得到第一混合溶液；
A2：将氧化石墨经超声处理溶解于去离子水中制得氧化石墨溶液；将所述第一混合溶液与氧化石墨溶液混合制得第二混合溶液，在惰性气体氛围下搅拌6～24小时，然后将溶液滤出后充分洗涤磁性产物，将所述磁性产物在真空条件下进行高温处理，制得碳包覆磁性铁氧体；
步骤B：制备葡萄糖传感器酶电极；
将步骤A制得的碳包覆磁性铁氧体溶解于水中制得碳包覆磁性铁氧体悬浮液，然后将碳包覆磁性铁氧体悬浮液滴蘸在经过预处理的工作电极上，常温条件下在惰性气体氛围中进行干燥处理；然后将葡萄糖氧化酶溶解于pH缓冲液配制得到葡萄糖氧化酶溶液，所述pH缓冲液的pH值为6.8～7.4，采用物理吸附法将葡萄糖氧化酶固定在所述工作电极上，经干燥处理得到葡萄糖传感器酶电极。
2.根据权利要求1所述的一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，其特征在于，所述工作电极为玻碳电极、金电极或者铂电极。
3.根据权利要求1所述的一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，其特征在于，所述步骤A中酸溶液的pH值为3～6。
4.根据权利要求1所述的一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，其特征在于，所述步骤A中氧化石墨溶液的浓度为0.5mg/mL～2mg/mL。
5.根据权利要求4所述的一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，其特征在于，所述步骤A中第二混合溶液中碳元素与铁元素的质量比为1∶4～11。
6.根据权利要求1所述的一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，其特征在于，所述步骤A中高温处理的温度为120℃～200℃，处理时间为8～24小时。
7.根据权利要求1所述的一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖酶电极的制备方法，其特征在于，所述步骤B中碳包覆磁性铁氧体悬浮液的浓度为0.5mg/mL～2mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖酶电极的制备方法，其特征在于，所述步骤B中葡萄糖氧化酶溶液的浓度为1mg/mL-10mg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种基于碳包覆磁性铁氧体修饰的葡萄糖传感器酶电极的制备方法，其特征在于，所述步骤B中pH缓冲液是通过磷酸二氢钠或者磷酸二氢钾与磷酸氢二钠或者磷酸氢二钾共同溶解于水中配制而成。
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