CN105717178A - 一种基于二氧化钛基二维纳米复合材料的电化学己烯雌酚传感器的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于二氧化钛基二维纳米复合材料的电化学己烯雌酚传感器的制备方法。属于新型纳米功能材料与生物传感器技术领域。本发明首先制备了一种新型二维片状的磁性纳米光敏材料FeCo?NTiO₂，利用该材料的良好的生物相容性、大的比表面积和铁磁性，负载上己烯雌酚抗体，然后通过戊二醛的交联作用固定辣根过氧化物酶，在进行检测时，由于辣根过氧化物酶可以催化过氧化氢，产生电化学信号，再利用抗体与抗原的特异性定量结合对电子传输能力的影响，使得电流强度相应降低，最终制得了成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测己烯雌酚的电化学生物传感器。

Description

一种基于二氧化钛基二维纳米复合材料的电化学己烯雌酚传 感器的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种电化学己烯雌酚传感器的制备方法。属于新型纳米功能材料与生物传感器技术领域。

背景技术

环境雌激素是指一类进入机体后，具有干扰体内正常内分泌物质的合成、释放、运输、结合、代谢等过程，激活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏维持机体稳定性和调控作用的化合物，环境雌激素种类繁多，包括人工合成化合物及植物天然雌激素，广泛分布于自然界中。己烯雌酚便是一种人工合成的非甾体雌激素物质。目前，检测己烯雌酚的方法主要有色谱法、质谱法等。此类方法仪器贵重、操作复杂，化验人员需要专业培训后才能进行检测。因此，研发成本低、检测快、灵敏度高、特异性强的己烯雌酚传感器具有重要意义。

电化学生物传感器由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点被广泛应用于临床诊断、药物分析、环境监测等领域。其中尤以无标记电化学免疫传感器研究较多，其关键的技术是提高修饰电极对抗体的固定量和对测试底液的信号响应速度和大小。二氧化钛是应用最为广泛的一种光催化剂材料，同时由于生物相容性好，也常被用作电极基质材料。由于片状二氧化钛纳米材料能够暴露更多的高指数晶面，具有更高的催化活性，二氧化钛纳米片具有比纳米粒子更好地应用前景，对于二氧化钛纳米片的研究也备受关注。但是，二氧化钛导电性差也限制了由单一二氧化钛纳米材料构建的电化学传感器的灵敏度普遍不高，不利于实际应用。在半导体纳米材料上修饰或复合特殊的纳米材料，一方面增加了电极比表面积，增强电极导电能力，另一方面二者可以产生协同催化作用，更大的增强对过氧化氢溶液H₂O₂的催化响应速度和电流响应信号大小，大大提高检测灵敏度。因此，设计、制备高效、稳定的二氧化钛纳米片及其修饰物是制备电化学传感器的关键技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备简单、灵敏度高、检测快速、特异性强的电化学己烯雌酚传感器的制备方法，所制备的传感器，可用于己烯雌酚的快速、灵敏检测。基于此目的，本发明首先制备了一种二维片状的磁性纳米材料，即铁和钴双金属原位复合的氮掺杂二氧化钛纳米片FeCo-N@TiO₂，利用该材料的良好的生物相容性、大的比表面积和铁磁性，负载上己烯雌酚抗体，然后通过戊二醛的交联作用固定辣根过氧化物酶，在进行检测时，由于辣根过氧化物酶可以催化过氧化氢，产生电化学信号，再利用抗体与抗原的特异性定量结合对电子传输能力的影响，使得电流强度相应降低，最终实现了采用无标记的电化学方法检测己烯雌酚的生物传感器的构建。

本发明采用的技术方案如下：

1. 一种基于二氧化钛基二维纳米复合材料的电化学己烯雌酚传感器的制备方法，所述的二氧化钛基二维纳米复合材料为铁和钴双金属原位复合的氮掺杂二氧化钛纳米片FeCo-N@TiO₂，所述的电化学己烯雌酚传感器由工作电极、FeCo-N@TiO₂、己烯雌酚抗体、牛血清白蛋白、戊二醛、辣根过氧化物酶组成；

其特征在于，所述的制备方法包括以下制备步骤：

a. FeCo-N@TiO₂的制备；

b. 电化学己烯雌酚传感器的制备；

其中，步骤a制备FeCo-N@TiO₂的具体步骤为：

首先，取0.8 mmol铁盐、0.8~1.2 mmol钴盐和1 mmol铵盐加入到5 mL钛酸四丁酯中，搅拌过程中，缓慢加入0.5~0.8 mL氢氟酸，160~200 ℃下在反应釜中反应18~24小时，冷却至室温后，用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次后，50℃下真空干燥；然后，将研磨的粉末放入马弗炉中，升温速度为1~3 ℃/min，480~560℃下在氮气保护下，煅烧10~60 min；最后，将煅烧后的粉末冷却至室温，即制得FeCo-N@TiO₂；

所述的铁盐选自下列之一：硫酸铁、氯化铁、硝酸铁；

所述的钴盐选自下列之一：硫酸钴、氯化钴、硝酸钴；

所述的铵盐选自下列之一：硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸铵；

步骤b制备电化学己烯雌酚传感器的具体步骤为：

（1）以玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂8~12 µL的FeCo-N@TiO₂溶胶，室温下晾干；

（2）将步骤（1）中得到的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂8~12 µL 10 µg/mL的己烯雌酚抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（3）将步骤（2）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂8~12 µL 浓度为100 µg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（4）将步骤（3）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂2~4 µL 的戊二醛溶液，4℃ 冰箱中保存晾干；

（5）将步骤（4）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂6~10 µL 浓度为20 µg/mL的辣根过氧化物酶溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（6）将步骤（5）中得到的电极用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得电化学己烯雌酚传感器；

所述的FeCo-N@TiO₂溶液为将50 mg 的FeCo-N@TiO₂粉末溶于10 mL超纯水中，并超声30 min后制得的水溶胶；

所述的PBS为10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4；

所述的戊二醛溶液为体积比为2.5%的戊二醛水溶液。

2. 本发明所述的制备方法所制备的电化学己烯雌酚传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：

a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的己烯雌酚标准溶液；

b. 工作电极修饰：将如权利要求1所述的制备方法所制备的电化学己烯雌酚传感器为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的己烯雌酚标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 ℃冰箱中保存；

c. 工作曲线绘制：将饱和甘汞电极电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在电解槽中先后加入15 mL PBS和20 µL 5 mol/L的H₂O₂；通过计时电流法检测组装的工作电极对H₂O₂的响应；空白标样的响应电流记为I₀，含有不同浓度的己烯雌酚标准溶液的响应电流记作I_i，响应电流降低的差值为ΔI = I₀-I_i，ΔI与己烯雌酚标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔI－C工作曲线；

d. 己烯雌酚的检测：用待测样品代替步骤a中的己烯雌酚标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值ΔI和工作曲线，得到待测样品中己烯雌酚的含量。

本发明的有益成果

（1）本发明所述的电化学己烯雌酚传感器制备简单，操作方便，实现了对样品的快速、灵敏、高选择性检测，并且成本低，可应用于便携式检测，具有市场发展前景；

（2）本发明首次制备了新型二维片状光敏材料FeCo-N@TiO₂，由于铁、钴在二氧化钛纳米片上的原位生长而充分与二氧化钛纳米片接触，利用铁、钴的金属表面等离子体作用以及二者的相互促进作用，有效提高了半导体基质共振能量转移能力，解决了二氧化钛纳米片虽然比表面积比较大及介孔特性适用于电化学基质材料，但是电化学活性不高及电流信号不稳定的技术问题；同时由于氮的掺杂而使得二氧化钛纳米片更好的加大层隙间距和充分分散，极大地增大了二氧化钛纳米片的高能晶面的暴露、电子传递和充分分散，极大地增大了电子传递能力，解决了二氧化钛纳米片导电性差和电流响应信号弱而不利于制备电化学传感器的技术问题，因此，该材料的有效制备，具有重要的科学意义和应用价值；

（3）本发明首次将FeCo-N@TiO₂应用于电化学生物传感器的制备中，显著提高了电流信号的强度和稳定性，大大提高了电化学传感器的检测灵敏度，使得电化学生物传感器实现了在实际工作中的应用；该材料的应用，也为相关生物传感器，如光电化学传感器、电致化学发光传感器等提供了技术参考，具有广泛的潜在使用价值。

具体实施方式

实施例1 FeCo-N@TiO₂的制备

首先，取0.8 mmol铁盐和0.8 mmol钴盐和1 mmol铵盐加入到5 mL钛酸四丁酯中，搅拌过程中，缓慢加入0.5 mL氢氟酸，160 ℃下在反应釜中反应24小时，冷却至室温后，用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次后，50℃下真空干燥；然后，将研磨的粉末放入马弗炉中，升温速度为1 ℃/min，在 480 ℃下煅烧60 min；最后，将煅烧后的粉末冷却至室温，即制得FeCo-N@TiO₂；

所述的铁盐为硫酸铁；

所述的钴盐为硫酸钴；

所述的铵盐为硫酸铵。

实施例2 FeCo-N@TiO₂的制备

首先，取0.8 mmol铁盐和1.0 mmol钴盐和1 mmol铵盐加入到5 mL钛酸四丁酯中，搅拌过程中，缓慢加入0.65 mL氢氟酸，180 ℃下在反应釜中反应21小时，冷却至室温后，用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次后，50℃下真空干燥；然后，将研磨的粉末放入马弗炉中，升温速度为2 ℃/min，在 520 ℃下煅烧30 min；最后，将煅烧后的粉末冷却至室温，即制得FeCo-N@TiO₂；

所述的铁盐为氯化铁；

所述的钴盐为氯化钴；

所述的铵盐为氯化铵。

实施例3 FeCo-N@TiO₂的制备

首先，取0.8 mmol铁盐和1.2 mmol钴盐和1 mmol铵盐加入到5 mL钛酸四丁酯中，搅拌过程中，缓慢加入0.8 mL氢氟酸，200 ℃下在反应釜中反应18小时，冷却至室温后，用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次后，50℃下真空干燥；然后，将研磨的粉末放入马弗炉中，升温速度为3 ℃/min，在 560℃下煅烧10 min；最后，将煅烧后的粉末冷却至室温，即制得FeCo-N@TiO₂；

所述的铁盐为硝酸铁；

所述的钴盐为硝酸钴；

所述的铵盐为硝酸铵。

实施例4 电化学己烯雌酚传感器的制备方法

（1）将宽为1 cm、长为4 cm的玻碳电极作为工作电极，在电极表面滴涂8 µL的FeCo-N@TiO₂溶胶，室温下晾干；

（2）将步骤（1）中得到的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂8 µL 10 µg/mL的己烯雌酚抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（3）将步骤（2）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂8 µL 浓度为100 µg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（4）将步骤（3）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂2 µL 的戊二醛溶液，4℃ 冰箱中保存晾干；

（5）将步骤（4）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂6 µL 浓度为20 µg/mL的辣根过氧化物酶溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（6）将步骤（5）中得到的电极用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得电化学己烯雌酚传感器；

所述的FeCo-N@TiO₂溶胶为将50 mg 的FeCo-N@TiO₂粉末溶于10 mL超纯水中，并超声30 min后制得的水溶胶；

所述的PBS为10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4；

所述的戊二醛溶液为体积比为2.5%的戊二醛水溶液。

实施例5 电化学己烯雌酚传感器的制备方法

（1）将宽为1 cm、长为4 cm的玻碳电极作为工作电极，在电极表面滴涂10 µL的FeCo-N@TiO₂溶胶，室温下晾干；

（2）将步骤（1）中得到的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂10 µL 10 µg/mL的己烯雌酚抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（3）将步骤（2）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂10 µL 浓度为100 µg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（4）将步骤（3）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂3 µL 的戊二醛溶液，4℃ 冰箱中保存晾干；

（5）将步骤（4）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂8 µL 浓度为20µg/mL的辣根过氧化物酶溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（6）将步骤（5）中得到的电极用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得电化学己烯雌酚传感器；

所述的FeCo-N@TiO₂溶胶为将50 mg 的FeCo-N@TiO₂粉末溶于10 mL超纯水中，并超声30 min后制得的水溶胶；

所述的PBS为10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4；

所述的戊二醛溶液为体积比为2.5%的戊二醛水溶液。

实施例6 电化学己烯雌酚传感器的制备方法

（1）将宽为1 cm、长为4 cm的玻碳电极作为工作电极，在电极表面滴涂12 µL的FeCo-N@TiO₂溶胶，室温下晾干；

（2）将步骤（1）中得到的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂12 µL 10 µg/mL的己烯雌酚抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（3）将步骤（2）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂12 µL 浓度为100 µg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（4）将步骤（3）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂4 µL 的戊二醛溶液，4℃ 冰箱中保存晾干；

（5）将步骤（4）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂10 µL 浓度为20µg/mL的辣根过氧化物酶溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（6）将步骤（5）中得到的电极用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得电化学己烯雌酚传感器；

所述的FeCo-N@TiO₂溶胶为将50 mg 的FeCo-N@TiO₂粉末溶于10 mL超纯水中，并超声30 min后制得的水溶胶；

所述的PBS为10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4；

所述的戊二醛溶液为体积比为2.5%的戊二醛水溶液。

实施例7 实施例1~6制备的电化学己烯雌酚传感器，应用于己烯雌酚的检测，步骤如下：

（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的己烯雌酚标准溶液；

（2）工作电极修饰：将如权利要求1所述的制备方法所制备的电化学己烯雌酚传感器为工作电极，将步骤（1）中配制的不同浓度的己烯雌酚标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4℃ 冰箱中保存；

（3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在电解槽中先后加入15 mL PBS和20 µL 5 mol/L的H₂O₂；通过计时电流法检测组装的工作电极对H₂O₂的响应；空白标样的响应电流记为I₀，含有不同浓度的己烯雌酚标准溶液的响应电流记作I_i，响应电流降低的差值为ΔI = I₀-I_i，ΔI与己烯雌酚标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔI－C工作曲线；己烯雌酚的线性检测范围为：0.006~200 ng/mL，检出限为：2.2 pg/mL；

（4）己烯雌酚的检测：用待测样品代替步骤（1）中的己烯雌酚标准溶液，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值ΔI和工作曲线，得到待测样品中己烯雌酚的含量。

Claims (2)

1.一种基于二氧化钛基二维纳米复合材料的电化学己烯雌酚传感器的制备方法，所述的二氧化钛基二维纳米复合材料为铁和钴双金属原位复合的氮掺杂二氧化钛纳米片FeCo-N@TiO₂，所述的电化学己烯雌酚传感器由工作电极、FeCo-N@TiO₂、己烯雌酚抗体、牛血清白蛋白、戊二醛、辣根过氧化物酶组成；

其特征在于，所述的制备方法包括以下制备步骤：

a. FeCo-N@TiO₂的制备；

b. 电化学己烯雌酚传感器的制备；

其中，步骤a制备FeCo-N@TiO₂的具体步骤为：

首先，取0.8 mmol铁盐、0.8~1.2 mmol钴盐和1 mmol铵盐加入到5 mL钛酸四丁酯中，搅拌过程中，缓慢加入0.5~0.8 mL氢氟酸，160~200 ℃下在反应釜中反应18~24小时，冷却至室温后，用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次后，50℃下真空干燥；然后，将研磨的粉末放入马弗炉中，升温速度为1~3 ℃/min，480~560℃下在氮气保护下，煅烧10~60 min；最后，将煅烧后的粉末冷却至室温，即制得FeCo-N@TiO₂；

所述的铁盐选自下列之一：硫酸铁、氯化铁、硝酸铁；

所述的钴盐选自下列之一：硫酸钴、氯化钴、硝酸钴；

所述的铵盐选自下列之一：硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸铵；

步骤b制备电化学己烯雌酚传感器的具体步骤为：

（1）以玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂8~12 µL的FeCo-N@TiO₂溶胶，室温下晾干；

（2）将步骤（1）中得到的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂8~12 µL 10 µg/mL的己烯雌酚抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（3）将步骤（2）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂8~12 µL 浓度为100 µg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（4）将步骤（3）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂2~4 µL 的戊二醛溶液，4℃ 冰箱中保存晾干；

（5）将步骤（4）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂6~10 µL 浓度为20 µg/mL的辣根过氧化物酶溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

（6）将步骤（5）中得到的电极用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得电化学己烯雌酚传感器；

所述的FeCo-N@TiO₂溶液为将50 mg 的FeCo-N@TiO₂粉末溶于10 mL超纯水中，并超声30min后制得的水溶胶；

所述的PBS为10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4；

所述的戊二醛溶液为体积比为2.5%的戊二醛水溶液。

2.如权利要求1所述的制备方法所制备的电化学己烯雌酚传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：

a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的己烯雌酚标准溶液；

b. 工作电极修饰：将如权利要求1所述的制备方法所制备的电化学己烯雌酚传感器为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的己烯雌酚标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 ℃冰箱中保存；

c. 工作曲线绘制：将饱和甘汞电极电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在电解槽中先后加入15 mL PBS和20 µL 5 mol/L的H₂O₂；通过计时电流法检测组装的工作电极对H₂O₂的响应；空白标样的响应电流记为I₀，含有不同浓度的己烯雌酚标准溶液的响应电流记作I_i，响应电流降低的差值为ΔI = I₀-I_i，ΔI与己烯雌酚标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔI－C工作曲线；

d. 己烯雌酚的检测：用待测样品代替步骤a中的己烯雌酚标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值ΔI和工作曲线，得到待测样品中己烯雌酚的含量。