CN106857247A - 一种麻疯树无菌苗各组织诱导愈伤的方法 - Google Patents

一种麻疯树无菌苗各组织诱导愈伤的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种麻疯树无菌苗各组织的诱导愈伤的方法。该方法首先利用L16(44)正交实验设计配制愈伤诱导培养基，再将麻疯树无菌苗的子叶接种于上述培养基中，连续观察愈伤诱导效果，然后将真叶、带真叶的叶柄、茎段、子叶、带子叶的叶柄、子叶叶柄、带叶柄下胚轴和下胚轴接种于愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织，并观察愈伤诱导效果。该方法可实现15d内对无菌苗各组织，尤其是对子叶、茎段、带子叶的叶柄、带叶柄的下胚轴的大量愈伤组织实现快速诱导。本发明对无菌苗形态学上的各种组织均有显著的愈伤诱导效果且诱导时间短，可实现一种配方对多种组织的快速诱导，节省了麻疯树的组培快繁时间，且提高了无菌苗材料的利用效率。

Description

一种麻疯树无菌苗各组织诱导愈伤的方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，更具体地，涉及一种麻疯树无菌苗各组织诱导愈伤的方法。
背景技术
近年来，伴随着经济的快速发展，能源需求的巨大缺口已经升级为一个国际性的大问题。因此，为了人类的可持续发展，寻找和开发具有可再生能力的生物质能源日益成为21世纪农业科技革命的新亮点。大戟科植物(Euphorbiaceae)麻疯树(Jatropha curcasL.)是一种含油量较高的重要木本油料植物，其种子含油量约为30～40％，种仁含油量达50～70％。
目前，麻疯树育种与生产上还存在种子产量低下、含油量较低、油脂组分比例不佳等问题，因此，积极完善繁育与栽培技术，解决麻疯树大规模生产中的实际问题，是培育优质高产的新品种的基本环节和关键步骤。由于麻疯树遗传起源不够清晰，遗传多样性相对较低等种质资源的局限性，采用传统的育种方法存在耗时长且效率低等问题，难以取得突破性进展。另外，以高通量测序为核心的现代生物基因工程技术，虽然可以快速获得育种所需目标性状相关的基因序列，但仍然需要高效的再生体系以实现麻疯树的遗传转化和随后的良种选育及其大量扩繁研究。因此，开发高效的麻疯树组织培养再生体系是麻疯树功能基因组学研究和优质麻疯树遗传材料快速扩繁的必要前提。
近些年，对有关麻疯树愈伤组织诱导的技术所用外植体材料庞杂，主要以叶片和茎段为主，但不同材料所需愈伤诱导的配方差异较大，且诱导效果参差不齐。另外，现有技术配方诱导愈伤耗时较长，限制了麻疯树组培快繁体系建立的整体时间周期。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足和缺陷，提出一种麻疯树无菌苗各组织诱导愈伤的方法。该方法可实现15d内对无菌苗各组织，尤其是对子叶、茎段、带子叶的叶柄、带叶柄的下胚轴的大量愈伤组织实现快速诱导。本发明对无菌苗形态学上的各种组织均有显著的愈伤诱导效果且诱导时间短，可实现一种配方对多种组织的快速诱导，节省了麻疯树的组培快繁时间，且提高了无菌苗材料的利用效率。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种麻疯树无菌苗各组织诱导愈伤的方法，包括如下具体步骤：
S1.选取麻疯树种子，去除种皮后对种仁进行消毒；
S2.配制MS培养基，并于121℃灭菌15～20min，取出放置于无菌操作室冷却，待培养基凝固后使用；
S3.在消毒后种仁的子叶顶端位置切口，露出子叶顶端，将处理后的种仁插入播种在步骤S2的MS培养基上培养，使切口端不接触培养基，培养20d后得到麻疯树无菌苗的子叶；培养30d后得到无菌苗的真叶、带真叶的叶柄、茎段、子叶、带子叶的叶柄、子叶叶柄、带叶柄下胚轴和下胚轴；
S4.切取步骤S3培养的麻疯树无菌苗的子叶，将子叶的叶片切为块状，将块状子叶混合后，接种于愈伤组织诱导培养基中，各处理10瓶重复，每瓶2～5片子叶，在温度22～28℃，光照12h/d，光照强度2000～2500lx条件下愈伤诱导5～20d，观察麻疯树子叶愈伤组织的诱导情况；
S5.切取步骤S3培养的麻疯树无菌苗的真叶、带真叶的叶柄、茎段、子叶、带子叶的叶柄、子叶叶柄、带叶柄下胚轴和下胚轴，分别接种于愈伤组织诱导培养基中培养；各处理10瓶重复，每瓶3～7片组织，在温度22～28℃，光照12h/d，光照强度2000～2500lx条件下愈伤诱导15d后，观察上述8种麻疯树组织的愈伤诱导情况。
优选地，步骤S1中所述消毒的方法为：用75％的乙醇消毒40～50s后，用无菌水冲洗50～70s，再用消毒试剂消毒8～15min，无菌水冲洗5次，每次50～70s；所述消毒试剂为1～2％的辛吉尔灭或2～5％的NaClO。
优选地，步骤S2中所述MS培养基的成分为MS营养物，蔗糖和琼脂粉。
优选地，所述MS营养物：蔗糖：琼脂粉的质量比为：(4.4～4.5)：(25～30)：(6～8)。
优选地，步骤S3中所述切口的长度为2～3mm；所述的插入播种的方式为水平横放或垂直插入。
优选地，步骤S4中所述块状的尺寸为宽3～5mm，长0.5～1.5cm。
优选地，步骤S4中所述的愈伤组织诱导培养基的成分为步骤S2所述MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、1-萘乙酸和水解酪蛋白。
优选地，所述2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、1-萘乙酸和水解酪蛋白的质量比为(0.25～1.5)：(0.1～0.75)：(0.5～1.25)：(50～400)，所述2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、1-萘乙酸和水解酪蛋白的总质量与MS培养基的质量体积比为(50.85～403.5)：1mg/L。
更为优选地，所述2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、1-萘乙酸和水解酪蛋白的质量比为0.3：0.1：0.15：80，所述2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、1-萘乙酸和水解酪蛋白的总质量与MS培养基的质量体积比为402.75：1mg/L。
优选地，步骤S5中所述麻疯树无菌苗的真叶、茎段、子叶、子叶叶柄和下胚轴均水平横放于愈伤组织诱导培养基上，所述带真叶的叶柄、带子叶的叶柄和带叶柄下胚轴均垂直插入愈伤组织诱导培养基中。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明用植物组织培养方法，采用愈伤组织诱导培养基对麻疯树无菌苗各组织进行愈伤诱导，在原有的MS培养基的基础上，增加了2,4-二氯苯氧乙酸，6-苄氨基腺嘌呤，1-萘乙酸和水解酪蛋白不同浓度的激素类物质。该方法具有培养周期短，将现有技术的培养周期20～30d缩短至5d即可长出愈伤，15d可诱导出大量愈伤组织。
2.本发明适用于麻疯树无菌苗的真叶、带真叶的叶柄、茎段、子叶、带子叶的叶柄、子叶叶柄、带叶柄下胚轴和下胚轴等外植体材料，均有显著的愈伤诱导效果。
3.本发明对麻疯树无菌苗各组织部分都可实现诱导愈伤，相对于现有的主要以叶片和茎段为主的诱导愈伤，显著提高了材料的利用率，减少了资源的浪费，且缩短了麻疯树组培快繁体系建立的整体时间周期。
附图说明
图1为实施例1中编号15的子叶的诱导效果。
图2为实施例3的带真叶的叶柄愈伤组织的诱导效果。
图3为实施例3的带子叶的叶柄愈伤组织的诱导效果。
图4为实施例3的子叶叶柄愈伤的诱导效果。
图5为实施例3的真叶愈伤组织的诱导效果。
图6为实施例3的茎段愈伤组织的诱导效果。
图7为实施例3的带叶柄的下胚轴愈伤组织的诱导效果。
图8为实施例3的下胚轴愈伤组织的诱导效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步说明本发明的内容，实验过程中所用的实验试剂、仪器和设备均为常规试剂、仪器和设备。
在实施例1-3中：
所述麻疯树种子采自海南省海口市国营新海林场东山基地麻疯树无性系测定林中6号无性系(云南怒江)。
MS培养基为Murashige and Skoog培养基。该培养基富含植物生长所需的各种营养元素，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，主要成分为MS营养物(Phyto Technology Laboratories，美国)4.4～4.5g/L，蔗糖(GenView，美国)25～30g/L，琼脂粉(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，日本分装)6～8g/L。
各实施例均在无菌操作台上进行操作，所用镊子、解剖刀、支架均用明火灭菌，每次操作使用后均再次用酒精灯灼烧灭菌。
实施例1麻疯树愈伤组织诱导培养基
以麻疯树无菌苗的子叶为外植体，MS培养基为基础培养基，设置2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)(0.25、0.5、1、1.5mg/L)，6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)(0.1、0.25、0.5、0.75mg/L)，1-萘乙酸(NAA)(0.5、0.75、1、1.25mg/L)，水解酪蛋白(0.05、0.1、0.2、0.4g/L)，4种不同激素浓度梯度的4因素4水平正交实验，每个组合10次重复，筛选愈伤诱导最佳培养基。实验组合如表1所示。
表1麻疯树愈伤组织诱导培养基筛选正交实验
表1为麻疯树愈伤组织诱导培养基筛选正交实验。在MS培养基的基础上设计了4种激素的16种添加配方组合，并分别接入子叶，观察愈伤组织诱导(生长)效果，寻找诱导效果最好(愈伤长的最多的)配方做为最佳激素配比。
实施例2
S1.选取麻疯树种子，去除种皮后对种仁进行消毒，用75％的乙醇消毒40s后，用无菌水冲洗50s，再用1～2％的辛吉尔灭消毒15min，无菌水冲洗5次，每次50s。
S2.配制MS培养基，并于121℃灭菌20min，取出放置于无菌操作室冷却，待培养基凝固后使用。
S3.在消毒后种仁的子叶顶端位置切2mm的切口，露出子叶顶端，将处理后的种仁水平横放播种在步骤S2的MS培养基上培养，使切口端不接触培养基，培养20d后得到麻疯树无菌苗的子叶。
S4.切取麻疯树无菌苗的子叶，将子叶的叶片切为宽3～5mm，长0.5～1.5cm的块状，将块状子叶混合后，接种于愈伤组织诱导培养基中，各处理10瓶重复，每瓶2～5片子叶，在温度22～28℃，光照12h/d，光照强度2000～2500lx条件下分别在接入子叶后愈伤诱导5d～20d后，观察麻疯树子叶愈伤组织的诱导情况。
表2为不同愈伤组织诱导培养基对麻疯树子叶的愈伤诱导效果。其中的实验编号与表1相对应。表1中16种激素配比组合诱导子叶愈伤组织生长情况的连续观察记录结果，由表2可知，子叶接入5d后，即在周围切口处出现愈伤组织。10d后，子叶周围和叶脉处愈伤组织进一步增加，呈粗线状。15d后，不同培养基诱导愈伤效果出现明显差异，9号、10号、15号、16号愈伤效果最佳。随着愈伤诱导时间的进一步延长，20d后不同培养基的愈伤诱导效果差异更加明显，15号培养基的愈伤诱导效果最好。因此，筛选出最佳激素配比为15号，即愈伤组织诱导培养基为MS为基础培养基，2-4-D(1.5mg/L)，6-BA(0.5mg/L)，NAA(0.75mg/L)，水解酪蛋白(0.4g/L)。
表2不同愈伤组织诱导培养基对麻疯树子叶的愈伤诱导效果
实施例3
S1.选取麻疯树种子，去除种皮后对种仁进行消毒；用75％的乙醇消毒50s后，用无菌水冲洗70s，再用2～5％的NaClO消毒8min，无菌水冲洗5次，每次70s。
S2配制MS培养基，并于121℃灭菌20min，取出放置于无菌操作室冷却，待培养基凝固后使用；
S3.在消毒后种仁的子叶顶端位置切3mm的切口，露出子叶顶端，将处理后的种仁垂直插入播种在步骤S2的MS培养基上培养，使切口端不接触培养基，培养30d后得到无菌苗的真叶、带真叶的叶柄、茎段、子叶、带子叶的叶柄、子叶叶柄、带叶柄下胚轴和下胚轴；
S4.切取麻疯树无菌苗的真叶、带真叶的叶柄、茎段、子叶、带子叶的叶柄、子叶叶柄、带叶柄下胚轴和下胚轴，分别接种于表1中15号配方的愈伤组织诱导培养基中培养；各处理10瓶重复，每瓶3～7片组织，在温度22～28℃，光照12h/d，光照强度2000～2500lx条件下愈伤诱导15d后，观察上述8种麻疯树无菌苗组织的愈伤诱导情况。
将麻疯树无菌苗不同组织部位的材料接入愈伤组织诱导培养基中，观察愈伤诱导情况。图2～8分别为实施例3的带真叶的叶柄、带子叶的叶柄、子叶叶柄、真叶、茎段、带叶柄的下胚轴和下胚轴的愈伤组织诱导效果的照片。从照片中可以看出，经过15d培养后诱导出的愈伤组织疏松、呈黄绿色。带真叶的叶柄(图2)、带子叶的叶柄(图3)、子叶叶柄(图4)、真叶(图5)、茎段(图6)、带叶柄的下胚轴(图7)和下胚轴(图8)这8种组织均能快速诱导出愈伤组织，尤其是子叶、茎段、带子叶的叶柄、带叶柄的下胚轴可诱导出大量愈伤组织。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种麻疯树无菌苗各组织诱导愈伤的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
S1.选取麻疯树种子，去除种皮后对种仁进行消毒；
S2.配制MS培养基，并于121℃灭菌15～20min，取出放置于无菌操作室冷却，待培养基凝固后使用；
S3.在消毒后种仁的子叶顶端位置切口，露出子叶顶端，将处理后的种仁插入播种在步骤S2的MS培养基上培养，使切口端不接触培养基，培养20d后得到麻疯树无菌苗的子叶；培养30d后得到无菌苗的真叶、带真叶的叶柄、茎段、子叶、带子叶的叶柄、子叶叶柄、带叶柄下胚轴和下胚轴；
S4.切取步骤S3培养的麻疯树无菌苗的子叶，将子叶的叶片切为块状，将块状子叶混合后，接种于愈伤组织诱导培养基中，各处理10瓶重复，每瓶2～5片子叶，在温度22～28℃，光照12h/d，光照强度2000～2500lx条件下愈伤诱导5～20d，观察麻疯树子叶愈伤组织的诱导情况；
S5.切取步骤S3培养的麻疯树无菌苗的真叶、带真叶的叶柄、茎段、子叶、带子叶的叶柄、子叶叶柄、带叶柄下胚轴和下胚轴，分别接种于愈伤组织诱导培养基中培养；各处理10瓶重复，每瓶3～7片组织，在温度22～28℃，光照12h/d，光照强度2000～2500lx条件下愈伤诱导15d后，观察上述8种麻疯树组织的愈伤诱导情况。
2.根据权利要求1所述麻疯树无菌苗各组织的诱导愈伤的方法，其特征在于，步骤S1中所述消毒的方法为：用75％的乙醇消毒40～50s后，用无菌水冲洗50～70s，再用消毒试剂消毒8～15min，无菌水冲洗5次，每次50～70s；所述消毒试剂为1～2％的辛吉尔灭或2～5％的NaClO。
3.根据权利要求1所述麻疯树无菌苗各组织的诱导愈伤的方法，其特征在于，步骤S2中所述MS培养基的成分为MS营养物，蔗糖和琼脂粉。
4.根据权利要求3所述麻疯树无菌苗各组织的诱导愈伤的方法，其特征在于，所述MS营养物：蔗糖：琼脂粉的质量比为(4.4～4.5)：(25～30)：(6～8)。
5.根据权利要求1所述麻疯树无菌苗各组织诱导愈伤的方法，其特征在于，步骤S3中所述切口的长度为2～3mm；所述的插入播种的方式为水平横放或垂直插入。
6.根据权利要求1所述麻疯树无菌苗各组织的诱导愈伤的方法，其特征在于，步骤S4中所述块状的尺寸为宽3～5mm，长0.5～1.5cm。
7.根据权利要求1所述麻疯树无菌苗组织的诱导愈伤的方法，其特征在于，步骤S4中所述的愈伤组织诱导培养基的成分为步骤S2所述MS培养基、2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、1-萘乙酸和水解酪蛋白。
8.根据权利要求7所述麻疯树无菌苗各组织诱导愈伤的方法，其特征在于，所述2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、1-萘乙酸和水解酪蛋白的质量比为(0.25～1.5)：(0.1～0.75)：(0.5～1.25)：(50～400)，所述2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、1-萘乙酸和水解酪蛋白的总质量与MS培养基的质量体积比为(50.85～403.5)：1mg/L。
9.根据权利要求8所述麻疯树无菌苗各组织诱导愈伤的方法，其特征在于，所述2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、1-萘乙酸和水解酪蛋白的质量比为0.3：0.1：0.15：80，所述2,4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、1-萘乙酸和水解酪蛋白的总质量与MS培养基的质量体积比为402.75：1mg/L。
10.根据权利要求1所述麻疯树无菌苗组织的诱导愈伤的方法，其特征在于，步骤S5中所述麻疯树无菌苗的真叶、茎段、子叶、子叶叶柄和下胚轴均水平横放于愈伤组织诱导培养基上，所述带真叶的叶柄、带子叶的叶柄和带叶柄下胚轴均垂直插入愈伤组织诱导培养基中。
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