CN106841619A - 三种蛋白质用作鉴定淋巴结转移胃癌的分子标记的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及三种蛋白质用作鉴定淋巴结转移胃癌的分子标记的应用。本发明首次揭示Profilin‑1、类HRG,Transferrinvariant三个蛋白质具有作为能够区分淋巴结转移与否的胃癌的标志物（ROC曲线下面积达0.91），对淋巴结转移胃癌的临床诊断提供依据。

Description

三种蛋白质用作鉴定淋巴结转移胃癌的分子标记的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及三种蛋白质用作鉴定淋巴结转移胃癌的分子标记的应用。
背景技术
1.胃癌现状概述
胃癌(Gastric cancer,GC)是目前世界上发病率第五高和致死率第三高的癌症[1,2]，已严重威胁到人类的生活和健康。2012年有951600新生患者，死亡人数达723100人[1]。胃癌在东南亚地区发病率最高，尤其在中国、韩国和日本等国家，在亚洲国家发病率高达50/100000[3]；另外，全球范围内，男性的发病率是女性的两倍2。另外，胃癌的5年总体存活率低于25％，尤其是在中国、美国和欧洲等地区[4,5]。
中国是胃癌高发地区之一，2014年中国因胃癌导致死亡的人数排世界第三，且占中国总死亡人数的3.56％，达32万多人，死亡人数仅仅也只比肝癌和肺癌死亡人数少。根据全国肿瘤登记中心The National Central Cancer Registry of China(NCCR)数据显示，2015年中国的胃癌男性的发病率和致死率都高于女性两倍多；同时，其中华东地区和南方地区的胃癌发病率最高[6]。
2.胃癌的TNM分期
肿瘤的分期(staging)是根据原发肿瘤的大小、浸润的深度、范围以及是否累及邻近器官、有无局部和远处淋巴结的转移、有无血源性或其他远处转移等参数来确定的，其的实质是反映肿瘤的侵袭转移程度，是评价恶性肿瘤侵袭转移范围、病程进展程度和预后的重要指标。
TNM分期系统由Pierre Denoix在1943-1952年间提出的[7]，1974年首次提出了针对胃癌的TNM分期系统[8]，TNM三个字母分别表示肿瘤(tumor)、淋巴结(node)和转移(metastasis)。TNM分期系统已成为最常用的分期系统，并且是针对实体瘤分期的公认标准，它能够反映恶性肿瘤进展、判断预后的最可靠的独立指标[9]。
TNM定义癌症发展过程中的了3个层次的关键信息：1)原发肿瘤(T)：该分期描述原发肿瘤的大小和性质，以及它侵染胃壁层和临近器官的速度；其中，T1表示肿瘤侵犯粘膜层，T4表示侵犯浆膜层。2)区域淋巴结(N)：分期描述肿瘤侵染临近或者区域性淋巴结的程度和速度；其中，N0表示区域淋巴结无转移，N+表示区域淋巴结有转移。3)远处转移(M)：该分期描述了肿瘤远端转移的程度；其中，M0表示无远处转移，M1表示有远处转移。
精确的肿瘤分期不仅是准确预测恶性肿瘤生物学行为及预后的可靠指标，也能为临床医师提供准确的患者分层管理依据，还是选择辅助治疗方案、提高治疗效果的基本前提。
3.生物标志物
生物标志物的筛选已经成为目前生物医学领域研究的热点。一个具有临床应用价值的生物标志物不仅要具有足够的组织特异性用于疾病预测，而且还需要较高的灵敏度。
4.血清蛋白质检测的重要意义
人体近5L的血液通过血液循环系统流经超过6万英里的动脉、静脉和毛细血管，血液为细胞运送氧气、营养物质，其运出二氧化碳和代谢废物。一方面，血清作为血液主要成分，包含了特定生理病理状态下整个机体的充分信息，能充分反映机体的代谢状况；另一方面，血液蛋白质组具有包含其他任何特定细胞中的蛋白质的潜力[10-12]。所以测定血清中蛋白质的浓度变化对于疾病的诊断、发展、分子病理病因的研究以及药物疗效检测具有十分重要的意义。
5.三种相关蛋白质
Transferrin variant目前的研究还很少，其主要分子功能是结合三价铁离子，并具有三价铁离子膜转运子活性，因此参与细胞内铁离子内稳态重要的生物过程。
类HRG，similar to Homo sapienshistidine-rich glycoprotein，则主要具有丝氨酸型内肽酶抑制活性。
Profilin蛋白家族主要是肌动蛋白结合蛋白，调节肌动蛋白的聚合，在细胞黏附、运动、生长、胞质分裂、信号传导、细胞形态学的构成和维持等方面都有重要作用。而Profilin-1是最早发现的肌动蛋白结合蛋白之一，也是最重要的成员。有研究表明，高表达profilin-1，将会减少乳腺癌细胞的浸润。Profilin-1的肌动蛋白结合位点是有助于抑制肿瘤。
2014年，Yan Ma等人发现无淋巴结转移的胃癌组织样本中，profiling-1是上调的，而在淋巴结转移样本中并未发现[13]。同样的，在其它种类癌症中也有相似结果，如2012年，研究发现在浸润性膀胱癌中profilin1也显著下调[14]；2014年，Z Ding等人研究表明随着乳腺癌细胞转移的增加，profilin-1蛋白表达逐渐降低；对应的当沉默profilin-1基因，癌细胞获得高侵袭力，且高表达MMP9蛋白(基质金属蛋白酶9)，有利于细胞转移[15]；2016年，Guy R.Adami等人同样在口腔鳞状上皮细胞癌中发现，随着淋巴结转移profilin-1也明显减少[16]。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同用于制备或筛选胃癌诊断试剂的用途。
本发明中全文，所述Transferrinvariant的Uniprot Accession为Q53H26。
本发明中全文，所述Profilin-1的Uniprot Accession为P07737。
本发明中全文，所述HRG-like protein的Uniprot Accession为B2R8I2。
本发明的另一目的在于提供特异识别Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白的试剂在制备胃癌诊断试剂盒中的用途。
本发明的另一目的在于提供一种胃癌诊断试剂盒。
本发明的另一目的在于提供Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-likeprotein这三个蛋白联合共同作为胃癌标志物的用途。
本发明的另一目的在于提供一种胃癌诊断方法。
为了实现上述目的及其他相关目的，本发明是采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同用于制备或筛选胃癌诊断试剂的用途。
较优的，Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同作为生物标志物。
更优的，Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同作为血清生物标志物。
优选地，Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个联合蛋白联合共同用于制备或筛选胃癌诊断试剂，包括两方面的内容：
其一，Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同用于制备胃癌诊断试剂，是指将Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同作为胃癌诊断指标应用于胃癌诊断试剂的制备。在一些实施方式中，可将Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同作为标准品或阳性对照，用于样本血清中的Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白水平的检测。
其二，Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同用于筛选胃癌诊断试剂，是指将Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同作为胃癌的识别靶标筛选同时或分别特异性识别这三个蛋白的试剂，从而作为胃癌诊断试剂，来检测胃癌。
在一些实施方式中，基于所述的Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-likeprotein这三个蛋白共同筛选同时或分别特异性结合Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白共同的抗体或配体，从而作为胃癌诊断试剂。
优选地，所述胃癌为淋巴结转移胃癌。
本发明的第二方面，提供了同时或分别特异性识别Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白的试剂在制备胃癌诊断试剂盒中的用途。
在一些实施方式中，所述的同时或分别特异性识别Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白的试剂选自同时或分别特异性结合Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白的抗体或配体。
在一些实施方式中，所述抗体包括包括单克隆抗体和多克隆抗体。
优选地，所述胃癌为淋巴结转移胃癌。
在本发明的第三方面，提供了一种胃癌诊断试剂盒，所述的试剂盒中至少含有同时或分别特异性识别Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白共同的试剂。
在一些实施方式中，所述的同时或分别特异性识别Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白的试剂选自同时或分别特异性结合Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白的抗体或配体。
在一些实施方式中，所述抗体包括包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在一些实施方式中，所述的试剂盒中还含有：免疫结合(如抗原抗体结合)试剂；或酶联免疫检测(ELISA)试剂。
优选地，所述胃癌为淋巴结转移胃癌。
在本发明的第四方面，提供了Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-likeprotein这三个蛋白联合共同作为胃癌生物标志物的用途。
较优的，所述生物标志物为血清生物标志物。
在本发明的第五方面，提供了一种诊断胃癌的方法，包括检测样本血清中Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白的水平。
优选地，所述胃癌为淋巴结转移胃癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明首次揭示Profilin-1,类HRG,Transferrinvariant三个蛋白质具有作为能够区分淋巴结转移与否的胃癌的标志物(ROC曲线下面积达0.91)，对淋巴结转移胃癌的临床诊断提供依据。
附图说明
图1：蛋白Transferrinvariant在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。
图2：蛋白Profilin-1在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。
图3：蛋白HRG-like protein在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。
图4：Transferrinvariant:用于鉴定淋巴结转移胃癌的ROC曲线。
图5：Profilin-1用于鉴定淋巴结转移胃癌的ROC曲线。
图6：HRG-like protein共同用于鉴定淋巴结转移胃癌的ROC曲线。
图7：Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein共同用于鉴定淋巴结转移胃癌的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECμLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECμLARBIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODSIN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，SanDiego，1999；和METHODS IN MOLECμLAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1试剂与实验流程
1.试剂与耗材
注：所有缓冲液均用Milli-Q水(Millipore)配制。
2.人类血浆样本的收集与制备
本章工作共涉及到30例人类血清样本：T1N0M0(10例，浸润深度为粘膜层，无淋巴结转移，无远端转移)，后文简写T1N0；T1N+M0(10例，浸润深度为粘膜层，有淋巴结转移，无远端转移)，后文简写为T1N+；T4aN0M0(10例，浸润深度为浆膜层，无淋巴结转移，无远端转移)，后文简写为T4N0。所有30例样本均来源于复旦大学附属中山医院。人血液样品的获取严格遵照中国法律和伦理委员会的指导方针进行，每个病人都签署了知情同意书。
3.高丰度蛋白质的去除
采用Agilent公司的MARS(multiple affinity removal system 5188-6408)去除7种人类血浆蛋白质高丰度组分(白蛋白，IgG，IgA，转铁蛋白，结合珠蛋白，抗胰蛋白酶，纤维蛋白)[17]。具体操作为：
1)用A液将12μL血清稀释到200μL，再利用0.22μm的超滤管，4℃,1000g,离心15min除去脂类，保存滤液；
2)用4mL A液平衡MARS柱子后，取过滤后的滤出液(200μL)于柱子上，4℃，200g，离心1min。保存滤液；
3)再加入300μL A液，4℃，200g，离心1min，保存滤液；
4)再加入400μL A液，4℃，200g，离心1min，保存滤液；
5)将2)、3)、4)三步中得到的滤液合并至新离心管中，即得到除高丰度蛋白质的血清样本；冻干，-80℃保存；
6)用1.8mL B液缓缓洗脱下结合在柱子上的高丰度蛋白质组分。再用4mL A液平衡柱子，平衡后的柱子可重复使用。
4.蛋白质或肽段荧光定量
蛋白质中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸可以吸收270-300nm的紫外光而发出紫外荧光；当用295nm波长作为激发光时，色氨酸在350nm有最大吸收，于是本实验用色氨酸荧光法定量蛋白质浓度[18]。首先，将色氨酸配成0、50、100、200、300、400ng/μL的标准品，以及将除高丰度后冻干的30例血清样本用150ul 4M UA缓冲液(4M Urea,0.1M Tris-HCl,pH8.5)复溶。再将各浓度标准品和样本分别取2.5μL溶于1.5mL Dilution buffer(8MUrea，20mM Tris-HCl，pH7.6)中，用荧光分光光度计测量。各浓度标准品结果用于绘制标准曲线，测得的样本浓度是色氨酸的浓度，再除以1.3％得到样本蛋白质或肽段的浓度。
5.溶液内酶解
1)根据荧光定量的结果，取100μg用4M UA缓冲液复溶的样品置于1.5mL离心管，再加入2μL 1MDTT(配在4M UA缓冲溶液中)，并置于37℃温箱中2.5h；
2)再向体系中加入10μL 1M IAA(配在4M UA缓冲溶液中)，室温暗反应40min，由此蛋白质完全变性，二硫键被打开，巯基被封闭；
3)再将溶液置于1.5mL 10K超滤管，用200μL0.1M TEAB，13000g离心15min，洗涤3次，弃掉滤液；
4)加入100μL 0.1M TEAB，并按质量比(胰酶：蛋白质＝1:25)向超滤管中加入胰蛋白酶，置于37℃摇床中，酶解16h；
5)再按酶：蛋白质＝1:25向超滤管中补加一次胰蛋白酶继续酶解4h；
6)酶解后的肽段混合物13000g离心收集滤出液，冻干-80℃保存待用。
6.二甲基稳定同位素标记
三个通道(轻、中、重)，每一个通道标记一个样品，3个为一组，每组添加Mix内参样本。共30个样本，其中T1N0组为对照组(无淋巴结转移，浸润深度仅为粘膜层)做两次重复，T1N+和T4N0为实验组，分别10个样本，所以共标记20组，具体标记顺序如下表1。每个样本肽段为12μg。
具体实验操作步骤为：
1)三组样本标记平行操作，将肽段溶解在100μL 0.1M TEAB中；
2)分别加入4μL 4％(v/v)的CH2O(轻)，CD2O(中)或13CD2O(重)，混匀；
3)加4μL 0.6M NaBH3CN到轻标和中标样本，4μL 0.6M NaBD3CN到重标样本，混匀；
4)在混匀器上常温孵育1h；
5)加16μL 1％(v/v)氨水，振荡混匀，终止标记反应；
6)加8μL 5％甲酸(v/v)进一步终止反应并酸化样本；
7)再将每组的三种标记样本混合在一起，冻干-80℃保存待用。
方法参考文献[19]。
表1.样品标记信息
注：GC：gastric cancer；L：“light”；M：“intermediate”；H：“heavy。
7.肽段C18Stage Tip脱盐
因为是小体积脱盐(<20ug),于是将每一标记组冻干后样品用600μL 0.2％TFA的水溶液充分溶解，并平行操作3份。
1)2层C18Disk填料填于200μL枪头中，200μL甲醇活化，室温2000g离心至少量液体剩余，去掉滤液；
2)加200μL0.2％TFA in 80％ACN洗填料，以最大限度去除污染物，2500g离心，重复一次；
3)加200μL0.2％TFA的水溶液平衡填料3次，2500g离心，去滤液；
4)每个样品取200μL结合到stage-tip上，1000g离心5min，以保证样品与C18填料充分结合；
5)加200μL含0.2％TFA的水溶液洗涤3次，2500g离心，以去除盐类等不能与C18填料结合的亲水成分；
6)最后，用50μL含0.2％TFA in 90％ACN洗脱2次，2500g离心，收集滤液；
7)将同一标记组的3份脱盐样本合并，冻干-80℃保存待用；
方法参考文献[20]。
8.肽段分级
利用PierceTM High pH Reversed-Phase Petide Fraction Kit试剂盒进行肽段分级，具体步骤：
1)配制0.1％的三氟乙酸(TFA in H2O)和分级洗脱溶液(ACN inTriethylamine)，洗脱液见table1；
2)去掉底部白色保护套，放置于2mL离心管(sample tube)，5000g离心2min除去内置溶液，以及压紧树脂材料；
3)去掉上端螺丝帽，再加入300μL ACN，盖好盖子，5000g离心2min，弃ACN，重复洗涤一次；
4)再用300μL 0.1％TFA，5000g离心2min，洗涤两次，由此柱子准备完毕即可用于分级；
5)将脱盐冻干的样品溶于300μL 0.1％的TFA(注:肽段样品需要充分溶解，并且不含有ACN、DSMO等有机溶剂，含尿素的样品，其尿素终浓度<1M)；
6)换新的2mL离心管，将300μL样品溶液加入柱子中，盖上盖子，3000g离心2min，得到组分Ft(flow-through fraction)；
7)换新的2mL离心管，加入300μL水，3000g离心2min，得到组分Fw(washfraction)；
8)依次换新的2mL离心管，按梯度加入300μL洗脱液(Table 1)，3000g离心2min，收集各组分(F1,F2,F3…F8)；
9)将同一个标记组的分级组分Ft、Fw、F8合并到F1，最后共计7个组分；并冻干-80℃保存待用。
9.多维液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析
LC-MS/MS分析用的液相是Ultimate 300(Thermo Fisher)，质谱仪是LTQ-Orbitrap-Velos(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA),C18反相色谱柱为实验室自制喷针反相柱75μm×150mm，3μm填料，流动相A液是0.1％甲酸的水溶液(0.1％FA in H2O)，B液是0.1％甲酸的乙腈溶液(0.1％FA in ACN)。首先，色谱梯度设置(％B:时间)具体如下：5％2min；5％-27％68min；27％-40％5min；40％-90％5min；90％-90％3min；90％-1％0.1min；1％-1％0.69min；分离总时间90min，流速是250nL/min。其次，数据采集模式是“高-低”模式，利用Orbitrap做一级全扫，范围是300-2000m/z，分辨率为60 000@m/z 200，AGC为1E6；二级扫描则用Ion Trap、正离子模式检测，数据依赖性采集模式(DDA)，其中取强度top20，CID碎裂，扫描范围200-2000m/z,35.0％NCE，AGC为1E4。最后，按按照重复次数为1、重复时间30s、排除时间120s标准设置动态排除。
10.数据库搜索
质谱仪采集的原始RAW文件用Maxquant1.5.2.8软件进行分析，采用的数据库是2016年3月9号下载的Uniprot homo sapiens数据库。固定修饰设置为半胱氨酸羧甲基化(CystineCarbamidomethyl)；可变修饰为蛋白质N段乙酰化(N-acetylation)和甲硫氨酸氧化(oxidized methionine)，酶解模式选择Trypsin/P，酶切损失位点最大为2个，每条肽段最多5个修饰，肽段First search和Main search的质量容忍度分别为20ppm和4.5ppm，Decoy模式选择Revert，肽段最大质量是4600Da，肽段和蛋白质的假阳性率FDR(falsediscovery rate)均为0.01，勾选Second peptides identification，提高肽段的鉴定数。
11.统计学及生物信息学分析
将数据用中位数归一化，然后除以Mix组内参样品数据，对数据做校正，再以Log2取对数。所有数据分析和统计学检验都使用R安装包或者Excel完成。
实施例2差异蛋白质分析与标志物寻找
差异蛋白质分析基于统计数值p值(p value)，它是当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率。根据小概率原理，如果原假设发生的概率很小，我们就有理由拒绝原假设，当p值越小，我们拒绝原假设的理由越充分。总之，p值越小，表明结果越显著。本研究中，选定当p<0.05时表示有差异。同时，为了进一步确定差异蛋白质，在p值的基础上，我们还通过蛋白质在不同组间表达量变化差异倍数(Fc，fold-change)来衡量差异蛋白质，我们选取的倍数是上调1.3倍，或者下调0.77倍。标志物的诊断价值可以通过ROC曲线(受试者工作特征曲线)的曲线下面积判断，ROC曲线指受试者工作特征曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标,是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高。一般认为，曲线下面积高于0.9时诊断价值较高。
表2.T1N0与T1N+两组差异蛋白具体信息
T1N0组、T1N+组、T4N0组两两比较时，利用独立样本T检验(t-test)，其p值小于0.05，且Fc大于1.3或小于0.77，发现Profilin-1,类HRG,Transferrinvariant三个蛋白质在胃癌淋巴结转移不同的两组(T1N0和T1N+)中表达具有显著差异。其中Transferrinvariant蛋白质随着淋巴结转移(T1N+组中)而表达上调，Profilin-1,HRG-like protein两个蛋白质则在T1N+组中表达下调。具体信息见表2。与此同时，在T1N0与T4N0两组比较中，该三个蛋白质没有显著差异，其p值都大于0.05。利用这三个蛋白质分别做受试者工作特征曲线(ROC曲线)，它们的曲线下面积(AUC)最小为0.74，最大也只有0.85。而当我们将三种蛋白质整合在一起为指标来做受试者工作特征曲线，发现ROC曲线下面积达到0.91，表明将它们共同作为标志物，具有非常高鉴定淋巴结转移胃癌的诊断指标价值。
2.三种蛋白质在不同组内的定量展示
如图1～3一系列图展示了Transferrinvariant，Profilin-1,HRG-like protein三个蛋白质在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。
3.三种蛋白质用于鉴定淋巴结转移胃癌的ROC曲线
如图4～7系列图表示Transferrinvariant Profilin-1 HRG-like protein各个蛋白质及其整合结果用于鉴定淋巴结转移胃癌的ROC曲线。
综上所述，胃癌作为世界上发病率第五高和致死率第三高的癌症，已经严重威胁到人类的健康。肿瘤的分期(staging)的实质是反映肿瘤的侵袭转移程度，精确的肿瘤分期不仅是准确预测恶性肿瘤生物学行为及预后的可靠指标。因此，对于胃癌淋巴结转移不同的特异生物标志物的发现，能及时有效方便地区分不同淋巴结转移的胃癌，以此为医师提供准确的患者分层管理依据，并选择适宜的治疗方案，以减少病患者痛苦和提高治疗效果。本工作基于稳定同位素二甲基标记策略精确定量分析了对临床胃癌血清样本的蛋白质组，揭示Profilin-1,类HRG,Transferrinvariant三个蛋白质具有作为能够区分淋巴结转移与否的胃癌的标志物(ROC曲线下面积达0.91，T1N0与T1N+两组比较p值<0.05,而T1N0与T4N0两组比较p值>0.05)，这些蛋白质可对淋巴结转移胃癌的临床诊断提供依据。
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以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同用于制备或筛选胃癌诊断试剂的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同作为血清生物标志物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同作为血清生物标志物。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个联合蛋白联合共同用于制备或筛选胃癌诊断试剂，包括两方面的内容：其一，Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同用于制备胃癌诊断试剂，是指将Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同作为胃癌诊断指标应用于胃癌诊断试剂的制备；其二，Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同用于筛选胃癌诊断试剂，是指将Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同作为胃癌的识别靶标筛选同时或分别特异性识别这三个蛋白的试剂，从而作为胃癌诊断试剂，来检测胃癌。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胃癌为淋巴结转移胃癌。
6.同时或分别特异性识别Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白的试剂在制备胃癌诊断试剂盒中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的同时或分别特异性识别Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白的试剂选自同时或分别特异性结合Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白的抗体或配体。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述胃癌为淋巴结转移胃癌。
9.一种胃癌诊断试剂盒，所述的试剂盒中至少含有同时或分别特异性识别Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白共同的试剂。
10.Transferrinvariant、Profilin-1、HRG-like protein这三个蛋白联合共同作为胃癌生物标志物的用途。
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