CN106834139A - 一种半生红树林植物阔苞菊内生真菌及其用途、硒富集的方法 - Google Patents

一种半生红树林植物阔苞菊内生真菌及其用途、硒富集的方法 Download PDF

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廖日权
钟书明
尹艳镇
张瑞瑞
郑韵英
王芸
焦淑菲
刘敏敏
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Abstract

本发明公开了一种半生红树林植物阔苞菊内生真菌及其用途、硒富集的方法，所述半生红树林植物阔苞菊内生真菌及其用途、硒富集的方法包括以下步骤：采用半生红树林植物阔苞菊作为半生红树林植物阔苞菊内生真菌分离培养对象，再接种培养、纯化、分离后得到半生红树林植物阔苞菊内生真菌；将得到半生红树林植物阔苞菊内生真菌的加入硒溶液、碳源和盐，进行硒富集培养；本发明通过采用半生红树林植物阔苞菊作为半生红树林植物阔苞菊内生真菌分离培养对象，再接种培养、纯化、分离后得到半生红树林植物阔苞菊内生真菌活性好，易硒富集，提高有机硒的转化率。

Description

一种半生红树林植物阔苞菊内生真菌及其用途、硒富集的 方法
技术领域
本发明涉及内生真菌硒富集技术领域。更具体地说，本发明涉及一种半生红树林植物阔苞菊内生真菌及其用途、硒富集的方法。
背景技术
海洋生物资源是创新天然药物研究中最为丰富，也是最具生物多样性特征的资源，因此，作为海洋生物资源的重要组成部分，即红树林植物，已成为了现今研究界的讨论热点。
阔苞菊属半红树植物，同时也属于菊科植物，其植株为灌木，树高约为2～3米，其叶片呈楔形倒卵形或倒卵形。该植物既能于潮间带生长，也能自然繁殖于陆地环境，高盐度的环境使得阔苞菊根部长期处于无氧呼吸状态，而其枝叶却长期接受高强光的照射。特殊的生长条件也决定了阔苞菊植物内生真菌的代谢途径与普通植物相比存在极大的差异。相关研究表明，阔苞菊植物经过分离能得到大量的萜类化合物，且半萜类成分居多。萜类化合物是菊科植物大量存在的特征性代谢产物之一，而普通菊科植物的代谢产物却少有半萜类物质。另外，阔苞菊提取物中的酮类物质对谷禾类种子与豆类具有抑制作用，抗肿瘤活性显著；动物实验证明阔苞菊能作为药理物质，作用于神经系统，能达到抗溃疡和抑制炎性反应的目的；在表现利尿作用的同时未检测出阔苞菊具备急性毒性。由此可知，阔苞菊作为海洋药物的一种，具有无限的开发可能。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种半生红树林植物阔苞菊内生真菌及其用途、硒富集的方法。
本发明提供的技术方案为：
一种半生红树林植物阔苞菊内生真菌，所述半生红树林植物阔苞菊内生真菌由以下方法制成：
步骤一、采取半生红树林植物阔苞菊作为半生红树林植物阔苞菊内生真菌分离培养对象，具体说可将整株的半生红树林植物阔苞菊作为内生真菌的培养对象，优选半生红树林植物阔苞菊的根、茎、叶；
步骤二、将采取半生红树林植物阔苞菊采用无菌水清洗干净后、晾干，放进超净台进行紫外线灭菌，采用一般紫外线灭菌，温度一般不超过150℃；
步骤三、将经过紫外线灭菌的半生红树林植物阔苞菊剪成不大于1厘米的小段，将半生红树林植物阔苞菊小段依次经过无菌水、200mg/L次氯酸钠溶液、质量分数75％乙醇、无菌水清洗后，采用经过灭菌的滤纸将半生红树林植物阔苞菊表面的水吸干，经过200mg/L次氯酸钠溶液一般3-5秒，时间久了会破坏阔苞菊细胞，所以3-5秒为佳；
步骤四、将经过步骤三的半生红树林植物阔苞菊放在固体培养基上培养，再经过纯化，分离后，接种到液体培养基里培养得到半生红树林植物阔苞菊内生真菌；其中固体培养基一般为：去皮马铃薯200g/L、葡萄糖15g/L、海盐5g/L、琼脂15g/L，pH自然，分装规格为100ml/瓶，于121℃条件下灭菌30min；液体培养基一般为：去皮马铃薯200g/L、葡萄糖15g/L、海盐5g/L、pH自然，分装规格为100ml/瓶，于121℃条件下灭菌30min。
所述半生红树林植物阔苞菊内生真菌用来硒富集。
所述半生红树林植物阔苞菊内生真菌硒富集的方法：包括将半生红树林植物阔苞菊内生真菌加入硒溶液、碳源和盐，进行硒富集培养。
优选的是，所述硒溶液添加量为10-50ml，硒溶液浓度为50-200ug/ml。
优选的是，所述硒溶液添加量为30ml，硒溶液浓度为100ug/ml。
优选的是，所述碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖中的一种或几种。
优选的是，所述碳源的浓度为10-30g/L。
优选的是，所述盐的浓度为0-10g/L。
优选的是，半生红树林植物阔苞菊内生真菌加入30ml浓度为100ug/ml硒溶液，碳源为葡萄糖，浓度为15g/L，盐浓度为5g/L，进行硒富集培养24小时。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明提供一种半生红树林植物阔苞菊内生真菌，本发明内生真菌通过采用半生红树林植物阔苞菊作为半生红树林植物阔苞菊内生真菌分离培养对象，再接种培养、纯化、分离后得到半生红树林植物阔苞菊内生真菌活性好，该内生真菌可用来硒富集；为开发新的含硒药物提供依据；本发明半生红树林植物阔苞菊内生真菌硒富集方法简单，采用本发明内生真菌易硒富集，通过添加硒溶液及碳源、盐溶液，控制各添加量有效提高有机硒的转化率，优选的方案使得菌丝体硒含量达到299.8ug/g，生物量达到10.9g/L，富硒总量达到3267.7ug/L，有机硒转化率达到27.23％。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明不同硒的浓度对菌株富集硒的影响图；
图2为本发明不同培养时间对菌株富集硒的影响图；
图3为本发明不同碳源对菌株富集硒的影响图；
图4为本发明不同碳源浓度对菌株富集硒的影响图；
图5为本发明不同盐浓度对菌株富集硒的影响图。
具体实施方式
结合下面实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明试验基础：
1.1菌种与试剂
本研究阔苞菊采样地点为广西钦州市茅尾海。
化学试剂包括：硒粉、高氯酸(质量分数为70％，优级纯)、浓硝酸(质量分数为65％，优级纯)、盐酸、结晶紫染色剂、氟化钠、碘化钾、阿拉伯树胶等，上述化学试剂如无特殊说明均为分析纯。
培养基的碳源供给物质包括：葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖；采用马铃薯(市售食品级)作为本研究培养基的氮源供给物质；为模拟阔苞菊的生长环境；采用精制海盐来配比培养基的盐度。
1.2仪器与设备
本试验所使用的主要仪器如表1所示：
1.3培养基制备配方
固体培养基或菌种活化培养基(固体)：去皮马铃薯200g/L、葡萄糖15g/L、海盐5g/L、琼脂15g/L，pH自然，分装规格为100ml/瓶，于121℃条件下灭菌30min，备用。
液体培养基或种子培养基(液体)：去皮马铃薯200g/L、葡萄糖15g/L、海盐5g/L、pH自然，分装规格为100ml/瓶，于121℃条件下灭菌30min，备用。
富硒培养基(液体)：去皮马铃薯200g/L，按照正交实验要求加入碳源(葡萄糖、乳糖、麦芽糖及蔗糖)；碳源浓度为15～35g/L；海盐浓度为0～7g/L；培养基具有不同的硒含量是通过添加不同体积的硒标准液实现，其体积添加范围为10～50ml，其中，硒标准液浓度为40ug/ml。上述数值范围如无特殊说明，均分为5个梯度进行试验。
1.4培养方法
菌种培养、分离、纯化：将采得阔苞菊(根、茎，叶等)作为培养对象；将采取半生红树林植物阔苞菊采用无菌水清洗干净后、晾干，放进超净台进行紫外线灭菌；将经过紫外线灭菌的半生红树林植物阔苞菊剪成不大于1厘米的小段，将半生红树林植物阔苞菊小段依次经过无菌水、200mg/L次氯酸钠溶液、质量分数75％乙醇、无菌水清洗后，采用经过灭菌的滤纸将半生红树林植物阔苞菊表面的水吸干；将半生红树林植物阔苞菊放在固体培养基上培养，再经过纯化，分离后，接种到液体培养基里培养得到半生红树林植物阔苞菊内生真菌放在实验室保藏冰箱保藏待用。
菌种的活化：将试验菌种于实验室保藏冰箱中取出，在超净化工作台下接种到斜面培养基(菌种活化培养基)后，置于26℃培养箱中恒温培养72h，菌种长满平板时待用。
液体种子的制备：在长满菌种的斜面培养基中加入5～8ml无菌水，刮取菌丝，采用胶头滴管吸取适量的混合液体(菌丝+无菌水)于种子培养基中，30℃、150r/min摇床培养48h，菌丝体长满摇瓶后待用。
富硒培养：往长满菌体的摇瓶中加入不同体积(10～50)的硒标准溶液，以达到控制硒浓度的目的。将其置于26℃，150r/min摇床中培养12～60h。
1.5硒含量测定方法
1.5.1生物量的测定
硒元素富集时间结束后，用滤纸过滤菌丝，并蒸馏水洗涤3～5次，刮取菌丝体于烘干至恒重的培养皿中，60℃下烘干至恒重，称量其质量即可得生物量，以g/L表示。
1.5.2样品消解
称取0.1g经干燥粉碎的均匀试样于25ml的比色管中，加入消解液5ml(浓硝酸与高氯酸混合比例为4∶1)后盖上玻璃塞并进行24h冷消化处理。采用水浴加热的方式进行热消化处理，加热期间可定时震荡比色管以促进样品粉末的完全溶解。待样品溶液呈现透亮、清澈状态时，则表明样品消化完毕，样品消解过程耗时大致为3～5h。于澄清溶液中加入5ml6mol/L盐酸，沸水浴环境中进行30mim驱赶硝酸操作，样品溶液冷却后于比色管中加入测定液，以纯水定容至刻度，混和均匀后进行测定。
1.5.3测定液的组成与使用量
测量样品硒含量时，添加的测定液主要包括：HCl溶液1.0ml(1mol/L)、KI溶液1.0ml(2mol/L)、NaF溶液1.5ml(2mol/L)、阿拉伯树胶溶液1.5ml(10.0g/L)。
1.5.4硒含量标准曲线绘制
准确称取0.1000g硒粉，按照1.5.2的方法对硒粉进行消解处理，处理完毕后定容至1000ml，此溶液作为硒储备液，其浓度为100ug/ml，通过溶液配制操作将硒储备液配成浓度为40ug/ml的硒标准液备用。分别吸取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml硒标准液，将其置于25ml比色管中，以试剂空白为参比，于352nm波长下测定溶液的吸光值。测得其溶液吸光度A与溶液硒浓度间线性关系良好，标准曲线为A＝0.1235Cx+0.1463，R2＝0.9946。
1.5.5计算方法
硒含量计算公式如下：
其中，Cx--于校准曲线查得的硒含量，单位：ug/L；
V--样品消解液的定容体积，单位：L；
M--测量的样品质量，单位：g；
X--硒含量，单位：ug/g干菌体。
硒元素富集总量计算方法：
富硒总量(ug/L)＝生物量(g/L)×硒含量(ug/g干菌体)
有机硒转化率计算方法：
转化率＝(富硒总量/硒元素添加总量)×100％
1.6单因素试验
通过单因素试验研究不同的碳源、碳源浓度、盐浓度、培养时间以及硒溶液添加量(硒溶液浓度)对该株绿色内生真菌富硒能力的影响。
1.7正交试验
选择对菌种富硒能力影响较大的硒标准液添加量、培养时间、碳源浓度和盐浓度四个因素进行L9(34)正交试验，因素水平表如表2所示。通过测定每组菌丝的硒含量(ug/g)，以确定最佳培养条件。
2试验结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1硒溶液添加量对菌株富集硒的影响
设置不同的硒标准溶液添加量，即10ml、20ml、30ml、40ml、50ml，添加至液体种子(葡萄糖15g/L、盐溶度5g/L条件培养而成)中，将其置于26℃，150r/min摇床环境中培养24h。其结果如图1所示：当硒溶液添加量为30ml时，菌株的单位硒含量、生物量及富硒总量达到最大值。此外，30ml硒溶液添加量的条件下，菌丝硒含量为268ug/g，有机硒的转化率为25.19％。
2.1.2培养时间对菌株富集硒的影响
设置不同的培养时间，即12h、24h、36h、48h、60h，分别培养液体种子(其他条件：葡萄糖15g/L、盐溶度5g/L)，将其置于26℃，150r/min摇床环境中培养，其中，硒溶液添加量均为30ml。其结果如图2所示：当培养时间为24h时，菌株的单位硒含量、生物量及富硒总量达到最大值，随着培养时间的延长，各项指标指数均有所下降。此外，培养时间为24h时的条件下，菌丝硒含量为256ug/g，有机硒的转化率为26.28％。
2.1.3碳源种类对菌株富集硒的影响
采用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、及蔗糖四种糖类分别作为液体种子的碳源条件，(其他条件：碳源浓度15g/L、盐溶度5g/L)，将其置于26℃，150r/min摇床环境中培养24h，硒溶液添加量均为30ml。其结果如图3所示：当添加碳源为葡萄糖时，菌株的单位硒含量、生物量达到最大值，而采用碳源时这两项指标数值最小；但四种碳源条件下培养所得生物量曲线趋于平稳，表明生物量数值近似相等。此外，葡萄糖作为培养碳源的条件下，菌丝硒含量为288ug/g，有机硒的转化率为25.92％。
2.1.4碳源浓度对菌株富集硒的影响
设置不同的碳源浓度，即10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L添加至种子培养基中(其他条件：以葡萄糖为碳源、盐溶度5g/L)，将其置于26℃，150r/min摇床环境中培养24h，硒溶液添加量均为30ml。其结果如图4所示：当添加碳源浓度为15g/L时，菌株的单位硒含量、富硒总量达到最大值，五组试验组间生物量指数波动较大，表明碳源浓度对菌株硒富集能力具有不稳定性。此外，碳源浓度为15g/L条件下，菌丝硒含量为292ug/g，有机硒的转化率为26.16％。
2.1.5盐浓度对菌株富集硒的影响
设置不同的盐浓度，即0g/L、1.5g/L3g/L、5g/L、7g/L添加至种子培养基中(其他条件：葡萄糖15g/L、盐溶度5g/L)，将其置于26℃，150r/min摇床环境中培养24h，硒溶液添加量均为30ml。其结果如图5所示：当盐浓度为5g/L时，菌株的单位硒含量、生物量及富硒总量达到最大值。此外，盐浓度为5g/L条件下，菌丝硒含量为293ug/g，有机硒的转化率为26.18％
2.2正交试验
2.2.1四因素三水平正交试验
选择硒标准溶液添加量、培养时间、碳源(葡萄糖)浓度、盐浓度四项于菌株富集硒能力影响较大的因素以进行四因素三水平的培养基正交试验。其结果如表3所示：四种因素极差的从小到大顺序为DABC，表明本试验中，盐浓度对培养条件的影响最大，碳源浓度的影响最小；富硒培养基最佳的组合水平为A2B3C1D2，即硒标准溶液添加量30ml，培养时间24h，碳源(葡萄糖)浓度15g/L，盐浓度5g/L。
2.2.2结果验证
设置硒标准溶液添加量30ml，培养时间24h，碳源(葡萄糖)浓度15g/L，盐浓度5g/L四项条件进行正交试结果验证，本试验结果为：菌丝体硒含量为299.8ug/g，生物量为10.9g/L，富硒总量为3267.7ug/L，经计算，在最优水平条件下，有机硒转化率为27.23％。
实施例1
一种半生红树林植物阔苞菊内生真菌，所述半生红树林植物阔苞菊内生真菌由以下方法制成：
步骤一、在广西钦州市茅尾海采取半生红树林植物阔苞菊作为半生红树林植物阔苞菊内生真菌分离培养对象，其中有根、茎、叶、花等；
步骤二、将根、茎、叶、花采用无菌水清洗干净后、晾干，放进超净台进行紫外线灭菌，紫外线灭菌一般不超过150℃；
步骤三、将经过紫外线灭菌的根、茎、叶、花剪成不大于1厘米的小段，将小段依次经过无菌水清洗后、再经过200mg/L次氯酸钠溶液浸泡3-5秒、经过质量分数75％乙醇清洗、最后采用无菌水清洗后，采用经过灭菌的滤纸将半生红树林植物阔苞菊表面的水吸干；
步骤四、制作固体培养基：去皮马铃薯200g/L、葡萄糖15g/L、海盐5g/L、琼脂15g/L，pH自然，分装规格为100ml/瓶，于121℃条件下灭菌30min；将经过步骤三的半生红树林植物阔苞菊放在固体培养基上培养，再经过纯化，分离后，接种到液体培养基里培养得到半生红树林植物阔苞菊内生真菌；液体培养基：去皮马铃薯200g/L、葡萄糖15g/L、海盐5g/L、pH自然，分装规格为100ml/瓶，于121℃条件下灭菌30min。
将得到培养、纯化、分离得到半生红树林植物阔苞菊内生真菌进行硒富集培养，包括加入硒溶液、碳源以及盐溶液，一般硒溶液指亚硒酸钠溶液，可选浓度及用量，优选，所述硒溶液添加量为10-50ml，硒溶液浓度为50-200ug/ml；
更优选的是，所述硒溶液添加量为30ml，硒溶液浓度为100ug/ml。
其中碳源是提供能量作用，一般的能量物质即可，如糖类；优选的是，所述碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖中的一种或几种。
优选的是，所述碳源的浓度为10-30g/L。
本发明所需的盐一般无机盐，卤族盐等，如氯化钠、碘化钠；优选的是，所述盐的浓度为0-10g/L。
优选的实施例是，具体地，将半生红树林植物阔苞菊内生真菌加入30ml浓度为100ug/ml硒溶液，培养基碳源为葡萄糖，浓度为15g/L，氯化钠浓度为5g/L，进行硒富集培养24小时；菌丝体硒含量为299.8ug/g，生物量为10.9g/L，富硒总量为3267.7ug/L，经计算，在最优水平条件下，有机硒转化率为27.23％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (9)

1.一种半生红树林植物阔苞菊内生真菌，其特征在于，所述半生红树林植物阔苞菊内生真菌由以下方法制成：
步骤一、采取半生红树林植物阔苞菊作为半生红树林植物阔苞菊内生真菌分离培养对象；
步骤二、将采取半生红树林植物阔苞菊采用无菌水清洗干净后、晾干，放进超净台进行紫外线灭菌；
步骤三、将经过紫外线灭菌的半生红树林植物阔苞菊剪成不大于1厘米的小段，将半生红树林植物阔苞菊小段依次经过无菌水、200mg/L次氯酸钠溶液、质量分数75％乙醇、无菌水清洗后，采用经过灭菌的滤纸将半生红树林植物阔苞菊表面的水吸干；
步骤四、将经过步骤三的半生红树林植物阔苞菊放在固体培养基上培养，再经过纯化，分离后，接种到液体培养基里培养得到半生红树林植物阔苞菊内生真菌。
2.一种根据权利要求1所述的半生红树林植物阔苞菊内生真菌的用途，其特征在于，所述的半生红树林植物阔苞菊内生真菌用来硒富集。
3.一种根据权利要求1或2所述的半生红树林植物阔苞菊内生真菌硒富集的方法，其特征在于，所述方法包括将半生红树林植物阔苞菊内生真菌加入硒溶液、碳源和盐，进行硒富集培养。
4.根据权利要求3所述的半生红树林植物阔苞菊内生真菌硒富集的方法，其特征在于，所述硒溶液添加量为10-50ml，硒溶液浓度为50-200ug/ml。
5.根据权利要求4所述的半生红树林植物阔苞菊内生真菌硒富集的方法，其特征在于，所述硒溶液添加量为30ml，硒溶液浓度为100ug/ml。
6.根据权利要求3所述的半生红树林植物阔苞菊内生真菌硒富集的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的半生红树林植物阔苞菊内生真菌硒富集的方法，其特征在于，所述碳源的浓度为10-30g/L。
8.根据权利要求3所述的半生红树林植物阔苞菊内生真菌硒富集的方法，其特征在于，所述盐的浓度为0-10g/L。
9.根据权利要求3所述的半生红树林植物阔苞菊内生真菌硒富集的方法，其特征在于，半生红树林植物阔苞菊内生真菌加入30ml浓度为100ug/ml硒溶液，碳源为葡萄糖，浓度为15g/L，盐浓度为5g/L，进行硒富集培养24小时。
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