CN106831689A - 蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法，其方法为：步骤一、以蓝莓果实为原料制备蓝莓花青素纯化液；步骤二、采用酸水解法及固相萃取法制备蓝莓花青素总苷元；步骤三、采用半制备型高效液相色谱制备蓝莓花青素苷元单体；步骤四、采用分析型高效液相色谱对蓝莓花青素总苷元及单体进行定性及定量分析。有益效果：本发明有利于发挥蓝莓花青素的生物活性，更能提高蓝莓深加工产品的市场竞争力。简化了蓝莓花青素苷元的纯化步骤，缩短了生产周期，提高了花青素苷元的生产效率。并能减少产品中的有机溶液残留。能够满足保健食品或高端药品、化妆品领域的原材料需求。

Description

蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种蓝莓花青素的制备方法，特别涉及一种蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法。

背景技术

蓝莓(Blueberry)在我国又称为笃斯越桔(Vaccinium uliginosum L.)、都柿、甸果等，为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属植物(Vaccinium Sp.)。由于蓝莓的营养保健作用日益被人们接受，世界各国对蓝莓的需求量在不断增加，全世界的蓝莓种植面积及产量都在剧增。传统的蓝莓消费方式以直接鲜食为主，但蓝莓不易保存，冷冻后的蓝莓在口感上较差，只有加工成蓝莓制品也更有利于消费。目前，我国市面上的蓝莓制品逐渐增多，如蓝莓饮料、蓝莓果酱、蓝莓干等深加工产品。这些蓝莓制品的出现，尽管拓宽了蓝莓的应用领域，但与市场上其它果蔬制品相比，尚未展现出较强的竞争性，只有开发高附加值蓝莓制品，才能真正带动蓝莓产业的健康发展。

蓝莓果实中含有丰富的多酚类物质，如黄酮类、酚酸类、花青素类等生物活性物质。蓝莓已被联合国粮农组织FAO列为“人类五大健康食品之一”，美国人类营养研究中心USDA的研究人员发现蓝莓是花青素含量最丰富的水果之一。花青素已受到越来越多的关注，已有研究表明，花青素对人类健康有诸多益处，如抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗辐射、防止动脉粥样硬化、促进视网膜中视紫质再生等生理功效。

自然界中蓝莓花青素多以花青素衍生物形式存在于果蔬之中，如花青素糖基化、酰基化形式，而游离的花青素苷元形式则鲜有报道。目前市面上已有几种形式的蓝莓花青素制品，如蓝莓花青素提取物、蓝莓花青软胶囊、蓝莓花青素口服液、蓝莓花青素补水面膜等。随着研究的不断深入，更多的蓝莓花青素的产品也将逐渐走向市场。市面上已有的蓝莓花青素制品均属于花青素的衍生物形式，如花青素糖基化形式、花青素酰基化形式，而花青素的游离苷元形式则尚不多见。从理论上讲，花青素结构中糖基的存在，导致花青素的相对分子量大、水溶性好、膜通透性差、不易吸收，相比之下，苷元形式的花青素的分子量减少、脂溶性增加、更易于透过细胞膜发挥作用。国内外已有研究表明，蓝莓花青素苷元形式具有更强的生物活性，我们的前期研究也同样表明，花青素苷元形式具有更强的抗氧化、抗肿瘤活性，且更容易被人体内组织吸收，进而发挥花青素的功效。因此，研究蓝莓花青素苷元的制备方法具有非常好的应用前景，能够为蓝莓花青素苷元产品的开发具有广泛指导意义。

目前国内针对蓝莓花青素苷元的生产技术报道较少，涉及的相关专利技术有5项，专利1(申请号：201610160804.7，专利名称，一种制备蓝莓花青素苷元的方法)、专利2(201610160610.7，专利名称：一种纯天然的蓝莓花青素苷元口服液及制备方法)。专利1和专利2中主要采用大孔树脂柱及凝胶色谱柱进行花青素总苷元的纯化，考虑到凝胶色谱填料较细，导致纯化周期较长，本发明拟采用大孔树脂柱结合固相萃取柱进行蓝莓花青素总苷元的纯化，有效降低生产成本和提高工作效率。此外，本发明将在制得蓝莓花青素总苷元的基础上，利用半制备型高效液相色谱对几种主要的蓝莓花青素单体进行分离制备，以便获得高纯度、高活性的蓝莓花青素苷元单体。专利3(申请号：200910185829.2，专利名称：植物花青素的微生物或/和生物酶提取方法)、专利4(申请号：201210516999.6，专利名称：一种阳离子花青素苷元的提取方法)和专利5(申请号：201310112792.7，专利名称：天然花青素活性苷元的提取方法)，三个发明专利均属于花青素总苷元的生物技术制备领域，未涉及花青素苷元单体的制备，且操作过程中均需用到裂解花青素糖苷的酶类、生物活性剂、微生物、细菌、盐类等多种生化试剂，且操作流程较长、操作参数复杂、生产成本较高、生产效率相对较低，产品化学残留也较多，后期应用潜力有限。

发明内容

本发明的目的是为了实现规模化生产蓝莓花青素苷元产品提供技术参数，为综合利用蓝莓资源及制备高附加值蓝莓花青素产品提供技术指导而提供的一种蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法。

本发明提供的蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法，其方法如下所述：

步骤一、以蓝莓果实为原料制备蓝莓花青素纯化液；

步骤二、采用酸水解法及固相萃取法制备蓝莓花青素总苷元；

步骤三、采用半制备型高效液相色谱制备蓝莓花青素苷元单体；

步骤四、采用分析型高效液相色谱对蓝莓花青素总苷元及单体进行定性及定量分析。

步骤一中所述的蓝莓花青素纯化液制备方法如下：

(1)原料预处理：取新鲜或冷冻的蓝莓果实，进行清洗、研磨粉碎，制成匀浆；

(2)提取：配制50-80％的乙醇溶液，按体积比向蓝莓果浆中加入5-10倍的乙醇溶液，用盐酸溶液调节pH值为1.0-3.0，搅拌1-3小时后，在温度25-35℃下浸泡12-24小时；残渣再进行提取2-3次；

(3)萃取：合并提取液，在温度40-60℃、真空度-0.09～-0.1MPa条件下真空浓缩至原体积的1/5-1/10，采用乙酸乙脂进行萃取，按花青素提取液：乙酸乙脂体积比为1：1-1：3进行萃取2-4次，时间为6-12小时/次，温度为室温条件；

(4)大孔树脂纯化：将萃取后的蓝莓花青素溶液通过湿法装入大孔树脂柱，上样量为树脂体积的1/8-1/12，先用0.01-0.05％盐酸酸化的水进行洗脱，洗脱5-10倍柱体积后，再用浓度35-50％的0.01-0.05％盐酸酸化的乙醇溶液洗脱，收集35-50％的乙醇洗脱液，在温度40-60℃、真空度-0.09～-0.1MPa条件下真空浓缩到原体积的1/15-1/10，制得蓝莓花青素纯化液。

步骤二中所述酸水解及固相萃取制备蓝莓花青素总苷元的技术条件如下：

酸水解：配制2.5-3.0mol/L盐酸溶液，将步骤一中蓝莓花青素纯化液与盐酸溶液按体积比：1：3-1：6进行混合，并向混合液中加入10-20％的无水乙醇，制得蓝莓花青素反应液，在闭光条件下，将反应液置于80-100℃的水浴温度下充分反应1-3小时，取出迅速冷却室温，制得蓝莓花青素苷元水解液；

固相萃取：将苷元水解液在40-60℃条件下进行真空浓缩，将蓝莓花青素苷元浓缩液上固相萃取柱，上样量为柱体积的1/2-1/5，先用0.01-0.05％盐酸酸化的水进行洗脱，洗脱2-5倍柱体积，再用浓度50-80％的0.01-0.05％盐酸酸化的乙醇溶液洗脱，收集50-80％的乙醇洗脱液，在温度40-60℃、真空度-0.09～-0.1MPa条件下真空浓缩，回收乙醇，再经真空冷冻干燥，制得紫红色蓝莓花青素总苷元。

步骤三中所述的半制备型高效液相色谱的运行条件如下：

色谱柱规格为ODS反相色谱柱φ20.0mm×250mm,5μm；以色谱级甲醇为流动相A，以2-5％的甲酸水溶液为流动相B；洗脱方式为梯度洗脱；柱温为常温，流速1.5-3mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长为520nm，分析时间110min，样品浓度为200mg蓝莓花青素总苷元溶于50mL 3％甲酸水溶液，单次进样体积为5mL，分部收集蓝莓花青素单体洗脱液，在温度40-60℃、真空度-0.09～-0.1MPa条件下真空浓缩，再经真空冷冻干燥，制得蓝莓花青素苷元单体；此步骤中梯度洗脱程序如下：流动相B初始比例：85％，0-3min；85-80％，4-7min；80-75％，8-10min；75％，11-55min；75-30％，56–60min；30％，61-65min；85％B,66–110min；85％。

此步骤分离蓝莓花青素苷元单体的原理是：按照不同花青素苷元单体在色谱图上的保留时间不同，极性较大的单体较之极性小的单体先洗脱下来，分部收集不同时间流出的每种单体的洗脱液，从而实现不同单体的分离。

步骤四中分析型高效液相色谱的运行条件如下：

色谱柱规格：ODS反相色谱柱φ4.6mm×150mm，5μm；流动相A为色谱级甲醇，流动相B为2-5％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速0.5-1.0mL/min，柱温为常温，检测器为PDA二极管阵列检测器，检测波长：520nm，分析时间：60min，样品浓度为2mg蓝莓花青素苷元溶于10mL 3％甲酸水溶液，单次进样体积为5μL，以矢车菊素为花青素苷元标准品，对蓝莓花青素总苷元及单体中苷元种类及纯度进行分析，此步骤中梯度洗脱程序如下：流动相B初始比例：85％，0-3min；85-80％，4-15min；80-75％，16-25min；75％，26-30min；30％，31-46min；30％，47-52min；85％，53-60min；85％。

此步骤中蓝莓花青素总苷元及单体样品的定性及定量分析原理为：以矢车菊素为花青素苷元标准品，利用分析型高效液相色谱法对蓝莓花青素总苷元及单体样品中的花青素苷元种类进行定性分析；通过测定不同浓度梯度标准品的峰面积，绘制标准曲线，对蓝莓花青素总苷元及单体样品中苷元纯度进行测定，实现定量分析。

本发明的有益效果：

(1)本发明属于蓝莓资源的精深加工领域，重点在于提供了一种蓝莓花青素降解苷元的制备技术，而已有专利技术大多只针对蓝莓花青素衍生物展开，将花青素降解成苷元，更有利于发挥蓝莓花青素的生物活性，更能提高蓝莓深加工产品的市场竞争力。

(2)本发明改进了蓝莓花青素及苷元纯化的参数条件，引入了固相萃取技术用于花青素苷元的纯化，能有效脱除反应液中糖类杂质，并能有效洗脱出花青素苷元部分，简化了蓝莓花青素苷元的纯化步骤，缩短了生产周期，提高了花青素苷元的生产效率。

(3)在蓝莓花青素苷元的纯化过程中采用的有机溶剂种类较少，且安全无毒、均可回收再利用，既环保又节约生产成本，并能减少产品中的有机溶液残留。

(4)本发明制备出的蓝莓花青素苷元产品保留了果实中原有花青素苷元的种类及特性，具有极高的抗氧化、抗肿瘤活性，且易于被人体吸收利用，能够满足保健食品或高端药品、化妆品领域的原材料需求。

附图说明

图1为蓝莓花青素水解前后高效液相色谱结果示意图。

图2为蓝莓花青素苷元单体的半制备高效液相色谱分析图(520nm)。

图中所示：

1、飞燕草素-3-O-半乳糖苷； 2、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷；

3、矢车菊素-3-O-半乳糖苷； 4、飞燕草素-3-O-阿拉伯糖苷；

5、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷； 6、牵牛花素-3-O-半乳糖苷；

7、矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷； 8、牵牛花素-3-O-葡萄糖苷；

9、牵牛花素-3-O-阿拉伯糖苷； 10、芍药色素-3-O-葡萄糖苷；

11、锦葵色素-3-O-半乳糖苷； 12、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷；

13、锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷； 14、飞燕草素； 15、矢车菊素；

16、牵牛花素； 17、芍药色素； 18、锦葵色素； 19、飞燕草素；

20、矢车菊素； 21、牵牛花素； 22、锦葵色素。

具体实施方式

实施例1

步骤一、以蓝莓果实为原料制备蓝莓花青素纯化液；

(1)原料预处理：取新鲜或冷冻的蓝莓果实，进行清洗、研磨粉碎，制成匀浆；

(2)蓝莓花青素提取：配制70％的乙醇溶液，向蓝莓果浆中加入8倍的乙醇溶液，用盐酸溶液调节pH值为2.0，搅拌2小时后，在温度25℃下浸泡24小时；残渣再进行提取3次；

(3)萃取：合并提取液，在温度55℃、真空度-0.09MPa条件下真空浓缩至原体积的1/8，采用乙酸乙脂进行萃取，按花青素提取液：乙酸乙脂体积比为1：1进行萃取3次，时间为12小时/次，温度为室温条件；

(4)大孔树脂纯化：将萃取后的蓝莓花青素溶液通过湿法装入Amberlite XAD-7HP大孔树脂柱，上样量为树脂体积的1/10，先用0.01％盐酸酸化的水进行洗脱，洗脱8倍柱体积后，再用浓度35％的0.01％盐酸酸化的乙醇溶液洗脱，收集35％的乙醇洗脱液，在温度55℃、真空度-0.09MPa条件下真空浓缩到原体积的1/10，制得蓝莓花青素纯化液。

步骤二、采用酸水解法及固相萃取法制备蓝莓花青素总苷元；

蓝莓花青素苷元水解液制备：配制3.0mol/L盐酸溶液，将步骤一中蓝莓花青素纯化液与盐酸溶液按体积比1：4进行混合，并向混合液中加入20％的无水乙醇，制得蓝莓花青素反应液，在闭光条件下，将反应液置于95℃的水浴温度下充分反应1.5小时，取出迅速冷却室温，制得蓝莓花青素苷元水解液。

固相萃取：将苷元水解液在55℃条件下进行真空浓缩，将蓝莓花青素苷元浓缩液上固相萃取柱SEP-C18，上样量为柱体积1/3，先用0.01％盐酸酸化的水进行洗脱，洗脱4倍柱体积，再用浓度70％的0.01％盐酸酸化的乙醇溶液洗脱，收集70％的乙醇洗脱液，在温度55℃、真空度-0.09MPa条件下真空浓缩，回收乙醇，再经真空冷冻干燥，制得紫红色蓝莓花青素总苷元，经高效液相色谱法测定其纯度为72.3％。

步骤三、采用半制备型高效液相色谱制备蓝莓花青素苷元单体；

所用色谱柱规格为ODS反相色谱柱(φ20.0mm×250mm,5μm)；以色谱级甲醇为流动相A，以2-5％的甲酸水溶液为流动相B；洗脱方式为梯度洗脱；柱温为常温，流速2mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长为520nm，分析时间110min。此步骤中梯度洗脱程序如下：流动相B初始比例：85％，0-3min；85-80％，4-7min；80-75％，8-10min；75％，11-55min；75-30％，56–60min；30％，61-65min；；85％B,66–110min；85％。样品浓度为200mg蓝莓花青素总苷元溶于50mL 3％甲酸水溶液，单次进样体积为5mL，分部收集蓝莓花青素单体洗脱液，在温度55℃、真空度-0.09MPa条件下真空浓缩，再经真空冷冻干燥，制得蓝莓花青素苷元单体。按照不同花青素单体在色谱图上的出峰先后顺序，分部收集每种单体的洗脱液，真空浓缩，再经真空冻干燥，共制得4种蓝莓花青素苷元单体，经鉴定分别为：飞燕草素，矢车菊素，牵牛花素，锦葵色素。

步骤四、采用分析型高效液相色谱对蓝莓花青素总苷元及单体进行定性及定量分析。

色谱柱规格：ODS反相色谱柱(φ4.6mm×150mm，5μm)；流动相A为色谱级甲醇，流动相B为3％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速0.5mL/min，柱温为常温，检测器为PDA二极管阵列检测器，检测波长：520nm，分析时间：60min。此步骤中梯度洗脱程序如下：流动相B初始比例：85％，0-3min；85-80％，4-15min；80-75％，16-25min；75％，26-30min；30％，31-46min；30％，47-52min；85％，53-60min；85％。4种蓝莓花青素苷元单体，经高效液相色谱法测定纯度，得出飞燕草素纯度99.1％，矢车菊素纯度96.5％，牵牛花素纯度92.6％，锦葵色素纯度94.3％。

实施例2

步骤一、以蓝莓果实为原料制备蓝莓花青素纯化液；

(1)原料预处理：取新鲜或冷冻的蓝莓果实，进行清洗、研磨粉碎，制成匀浆。

(2)蓝莓花青素提取：配制60％的乙醇溶液，向蓝莓果浆中加入6倍的乙醇溶液，用盐酸溶液调节pH值为3.0，搅拌1.5小时后，在温度30℃下浸泡12小时；残渣再进行提取3次。

(3)萃取：合并提取液，在温度50℃、真空度-0.09MPa条件下真空浓缩至原体积的1/10，采用乙酸乙脂进行萃取，按花青素提取液：乙酸乙脂体积比为1：1.5进行萃取2次，时间为12小时/次，温度为室温条件。

(4)大孔树脂纯化：将萃取后的蓝莓花青素溶液通过湿法装入AB-8大孔树脂柱，上样量为树脂体积的1/10，先用0.01％盐酸酸化的水进行洗脱，洗脱5倍柱体积后，再用浓度40％的0.02％盐酸酸化的乙醇溶液洗脱，收集40％的乙醇洗脱液，在温度50℃、真空度-0.09MPa条件下真空浓缩到原体积的1/10，制得蓝莓花青素纯化液。

步骤二、采用酸水解法及固相萃取法制备蓝莓花青素总苷元；

蓝莓花青素苷元水解液制备：配制2.5mol/L盐酸溶液，将步骤一中蓝莓花青素纯化液与盐酸溶液按体积比1：5进行混合，并向混合液中加入10％的无水乙醇，制得蓝莓花青素反应液，在闭光条件下，将反应液置于95℃的水浴温度下充分反应1小时，取出迅速冷却室温，制得蓝莓花青素苷元水解液。

固相萃取：将苷元水解液在50℃条件下进行真空浓缩，将蓝莓花青素苷元浓缩液上固相萃取柱SEP-C18，上样量为柱体积1/5，先用0.01％盐酸酸化的水进行洗脱，洗脱3倍柱体积，再用浓度60％的0.01％盐酸酸化的乙醇溶液洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，在温度50℃、真空度-0.09MPa条件下真空浓缩，回收乙醇，再经真空冷冻干燥，制得紫红色蓝莓花青素总苷元，经高效液相色谱法测定其纯度为66.8％。

步骤三、采用半制备型高效液相色谱制备蓝莓花青素苷元单体：

同实例一。经半制备型高效液相色谱分离，共制备出4种蓝莓花青素苷元单体，经高效液相色谱法鉴定分别为：飞燕草素，矢车菊素，牵牛花素，锦葵色素。

步骤四、采用分析型高效液相色谱对蓝莓花青素总苷元及单体进行定性及定量分析。

同实例1。经高效液相色谱法测定4种蓝莓花青素苷元纯度，得出飞燕草素纯度97.2％，矢车菊素纯度94.0％，牵牛花素纯度92.4％，锦葵色素纯度95.6％。

Claims (5)

1.一种蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法，其特征在于：其方法如下所述：

步骤一、以蓝莓果实为原料制备蓝莓花青素纯化液；

步骤二、采用酸水解法及固相萃取法制备蓝莓花青素总苷元；

步骤三、采用半制备型高效液相色谱制备蓝莓花青素苷元单体；

步骤四、采用分析型高效液相色谱对蓝莓花青素总苷元及单体进行定性及定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法，其特征在于：所述的步骤一中所述的蓝莓花青素纯化液制备方法如下：

(1)原料预处理：取新鲜或冷冻的蓝莓果实，进行清洗、研磨粉碎，制成匀浆；

(2)提取：配制50-80％的乙醇溶液，按体积比向蓝莓果浆中加入5-10倍的乙醇溶液，用盐酸溶液调节pH值为1.0-3.0，搅拌1-3小时后，在温度25-35℃下浸泡12-24小时；残渣再进行提取2-3次；

(3)萃取：合并提取液，在温度40-60℃、真空度-0.09～-0.1MPa条件下真空浓缩至原体积的1/5-1/10，采用乙酸乙脂进行萃取，按花青素提取液：乙酸乙脂体积比为1：1-1：3进行萃取2-4次，时间为6-12小时/次，温度为室温条件；

(4)大孔树脂纯化：将萃取后的蓝莓花青素溶液通过湿法装入大孔树脂柱，上样量为树脂体积的1/8-1/12，先用0.01-0.05％盐酸酸化的水进行洗脱，洗脱5-10倍柱体积后，再用浓度35-50％的0.01-0.05％盐酸酸化的乙醇溶液洗脱，收集35-50％的乙醇洗脱液，在温度40-60℃、真空度-0.09～-0.1MPa条件下真空浓缩到原体积的1/15-1/10，制得蓝莓花青素纯化液。

3.根据权利要求1所述的一种蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法，其特征在于：所述的步骤二中所述酸水解及固相萃取制备蓝莓花青素总苷元的技术条件如下：

酸水解：配制2.5-3.0mol/L盐酸溶液，将步骤一中蓝莓花青素纯化液与盐酸溶液按体积比：1：3-1：6进行混合，并向混合液中加入10-20％的无水乙醇，制得蓝莓花青素反应液，在闭光条件下，将反应液置于80-100℃的水浴温度下充分反应1-3小时，取出迅速冷却室温，制得蓝莓花青素苷元水解液；

固相萃取：将苷元水解液在40-60℃条件下进行真空浓缩，将蓝莓花青素苷元浓缩液上固相萃取柱，上样量为柱体积的1/2-1/5，先用0.01-0.05％盐酸酸化的水进行洗脱，洗脱2-5倍柱体积，再用浓度50-80％的0.01-0.05％盐酸酸化的乙醇溶液洗脱，收集50-80％的乙醇洗脱液，在温度40-60℃、真空度-0.09～-0.1MPa条件下真空浓缩，回收乙醇，再经真空冷冻干燥，制得紫红色蓝莓花青素总苷元。

4.根据权利要求1所述的一种蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法，其特征在于：所述的步骤三中所述的半制备型高效液相色谱的运行条件如下：

色谱柱规格为ODS反相色谱柱φ20.0mm×250mm,5μm；以色谱级甲醇为流动相A，以2-5％的甲酸水溶液为流动相B；洗脱方式为梯度洗脱；柱温为常温，流速1.5-3mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长为520nm，分析时间110min，样品浓度为200mg蓝莓花青素总苷元溶于50mL 3％甲酸水溶液，单次进样体积为5mL，分部收集蓝莓花青素单体洗脱液，在温度40-60℃、真空度-0.09～-0.1MPa条件下真空浓缩，再经真空冷冻干燥，制得蓝莓花青素苷元单体；此步骤中梯度洗脱程序如下：流动相B初始比例：85％，0-3min；85-80％，4-7min；80-75％，8-10min；75％，11-55min；75-30％，56-60min；30％，61-65min；85％B,66-110min；85％。

5.根据权利要求1所述的一种蓝莓花青素总苷元及其单体的制备方法，其特征在于：所述的步骤四中分析型高效液相色谱的运行条件如下：

色谱柱规格：ODS反相色谱柱φ4.6mm×150mm，5μm；流动相A为色谱级甲醇，流动相B为2-5％的甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；流速0.5-1.0mL/min，柱温为常温，检测器为PDA二极管阵列检测器，检测波长：520nm，分析时间：60min，样品浓度为2mg蓝莓花青素苷元溶于10mL 3％甲酸水溶液，单次进样体积为5μL，以矢车菊素为花青素苷元标准品，对蓝莓花青素总苷元及单体中苷元种类及纯度进行分析，此步骤中梯度洗脱程序如下：流动相B初始比例：85％，0-3min；85-80％，4-15min；80-75％，16-25min；75％，26-30min；30％，31-46min；30％，47-52min；85％，53-60min；85％。