CN106811518A - 一种甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒及其应用,所述甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒,对NKX2‑1、FOXE1和HLA‑DRB1与甲状腺癌相关基因的多态性位点进行检测,能了解个体在甲状腺癌方面的遗传因素,评估甲状腺癌发病的相对风险,对于甲状腺癌早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义。同时还能辅助甲状腺癌的诊断,指导合理用药,帮助预测后代患病风险等。
Description
技术领域
本发明涉及一种检验技术领域,具体是一种甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒及其应用。
背景技术
随着人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)的完成,大量疾病相关基因的发现,促进了传统生物医学模式向可预测性、可预防性、个体化和参与性的基因组医学模式转变,为未来发展预防、诊断、治疗长期困扰人类的诸如癌症、心脑血管疾病、糖尿病、神经和精神疾病等重大复杂性疾病开辟了新途径,也为基因科学的产业化提供了良好的机遇。
全基因组关联分析(Genome Wide Association Studies,GWAS)是应用人类基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)为标记进行病例一对照关联分析,即在一定人群中收集病例组和对照组DNA,进行SNPs芯片扫描,采用关联分析比较受检SNPs标记的某一等位基因频率在病例组和对照组间有无显著性差异,筛选与疾病关联的基因序列变异,做出该SNPs是否与疾病关联的判断,预测疾病的患病率及风险。该方法研究前不需构建任何假设,不再局限于候选基因或候选染色体区域作为关联分析对象,而是针对基因组中所有SNPs,随机进行基因分型,分析SNPs与疾病的关联度,可在全基因组水平上,开展多中心、大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究,全面及时疾病发生、发展和治疗的相关遗传基因。
目前发现遗传因素,或其与环境因素之间的相互作用参与了几乎所有的人类疾病的发生过程。一些复杂的疾病往往不是由单一基因突变引起的,其发生发展与多基因多位点变异有关,且这些位点的变异可能与环境因素相关,这些位点可提高或降低个体患某种疾病的相对风险,被称为该种疾病的易感位点。根据大量的GWAS结果,已经发现并证明的一系列复杂疾病的易感位点已被普遍应用于基因检测领域。
甲状腺癌(Thyroid Carcinoma)是一种常见的内分泌系统恶性肿瘤,占头颈部肿瘤的首位,占所有恶性肿瘤的3%,其多发病于青壮年,发病高峰出现在40-60岁,男女发病比例约为1:3(How J,Tabah R.Explaining the increasing incidence ofdifferentiated thyroid cancer[J].Canadian Medical Association Journal,2007,177(11):1383-4.;Nix P,Nicolaides A,Coatesworth A P.Thyroid cancer review 1:presentation and investigation of thyroid cancer[J].International Journal ofClinical Practice,2005,59(11):1340-4.)。2009年美国国家癌症研究所(NCI)调查显示:甲状腺癌全球发病率约为14.4/10万,并呈现逐年上升的趋势。乳头状甲状腺癌(PTC)起源于甲状腺滤泡上皮细胞,约占甲状腺癌的80%-85%,最为常见,多发病于青壮年,女性多见。
甲状腺转录因子-1(Thyroid Transcription Factor-1,TITF-1),也称甲状腺特异增强子结合蛋白(NKX2-1),位于14q13,是甲状腺组织特异性转录因子的家族成员之一(Park S M,Chatterjee V K.Genetics of congenital hypothyr oidism.[J].Journalof Medical Genetics,2005,42(5):379-89.),因能与大鼠甲状腺球蛋白相互作用而被发现,编码的蛋白含有371个氨基酸残基,相对分子质量为38000,其中包含3个外显子和1个内含子。NKX2-1常在胚胎发育、分化时期表达,其缺失或异常表达可能与许多人类疾病关系密切,其中包括先天性甲状腺功能减退、肿瘤及神经系统发育缺陷等疾病(Katoh R,KawaoiA,Miyagi E,et al.Thyroid transcription factor-1in normal,hyperplastic,and neoplastic follicular thyroid cells examined by immunohistochemistry andnonradioactive in situ hybridization.[J].Modern Pathology,2000,13(5):570-576.)。Hoshi等研究了NKX2-1在致癌剂诱导小鼠甲状腺癌变中的作用,认为NKX2-1基因突变或表达异常可增加甲状腺癌发病风险(Hoshi S,Hoshi N,Okamoto M,et al.Role ofNKX2-1in N-bis(2-hydroxypropyl)-nitrosamine-induced thyroid adenoma in mice[J].Carcinogenesis,2009,30(9).)。GWAS研究发现,rs944289(14q3.3)多态性与乳头状甲状腺癌在欧洲人群中存在关联,并在日本人群中得到验证(Feuchtmayr H,Grey J.Commonvariants on 9q22.33and 14q13.3predispose to thyroid cancer in Europeanpopulations.[J].Nature Genetics,2009,41(4):460-464.;Matsuse M,Takahashi M,Mitsut ake N,et al.The FOXE1and NKX2-1loci are associated with susceptibility to papillary thyroid carcinoma in the Japanese population.[J].Jou rnal ofMedical Genetics,2011,48(9):645-8.)。
叉头框E1(FOXE1,fork head box E1)又称甲状腺转录因子2。定位于染色体9q22,只含一个外显子,从属于叉头/螺旋翼结构的转录因子家族,在甲状腺滤泡细胞中高表达,是胚胎形成的重要调节剂,在细胞生长和分化中起到重要作用,并直接参与肿瘤生成。FOXE1功能主要是具有RNA聚合酶II转录因子活性,参与外胚层发育、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录负调控、DNA依赖性转录调控和RNA聚合酶Ⅱ启动子转录等生物过程。FOXE1对维持甲状腺分化状态以及表达甲状腺特异基因也非常重要。Inigo Landa等利用大样本研究发现FOXE1基因rs1867277位点多态性与PTC易感性及甲状腺肿瘤特异性存在显著相关性并阐述了可能的机制(Landa I,Ruizllorente S,Monteroconde C,et al.The variant r s1867277inFOXE1gene confers thyroid cancer susceptibility through the recruitment ofUSF1/USF2transcription factors.[J].Plos Genetics,2009,5(9):140-145.)。MeikoTakahashi等研究表明,FOXE1基因rs965513等位点的多态性与PTC易感性及发生发展成正相关(Takahashi M,Saenko V A,Rogounovitch T I,et al.The FOXE1locus is a majorgenetic determinant for radiation-related thyroid carcinoma in Chernobyl.[J].Human Molec ular Genetics,2010,19(19):2516-23.)。
NRG-1基因定位于8p2.1-p1.2,包含21个可选择性剪切的外显子(Steinthorsdottir V,Stefansson H,Ghosh S,et al.Multiple novel transcriptioninitiation sites for NRG1[J].Gene,2004,342(1):97-105.),跨距大于1.1M b,它编码产物为NRG-1蛋白,是一种44KD的糖蛋白,属于表皮生长因子相关蛋白家族,是体内ErbB受体的配体(Burden S,Yarden Y.Neuregulins and Thei r Receptors:A VersatileSignaling Module in Organogenesis and Oncogen esis[J].Neuron,1997,18(6):847-55.)。NRG-1基因的转录过程中可选择性剪切产生多种亚型的表皮生长因子相关蛋白,根据其结构可归为三种主要亚型:T ypeI、TypeII、TypeIII(Meyer D,Yamaai T,Garratt A,etal.Isoform-speci fic expression and function of neuregul in.[J].Development,1997,124(18):3575-86.),三型均含有表皮生长因子样结构域(epidermal growth factor-like,EGF-like)。其在肿瘤组织中高表达可能与其促进细胞生长有关(Gilm our L M,Macleod K G,Mccaig A,et al.Neuregulin expression,function,and signaling inhuman ovarian cancer cells.[J].Clinical Cancer Research An Official Journalof the American Association for Cancer Research,2002,8(12):3933-42.)。Gudmundsson等人用GWAS在欧洲人群中开展甲状腺癌遗传易感性位点探索,2012年第二次报道了rs2439302(8p12)等相关SNP位点(Gudmundsson J,Sulem P,Gudbjartsson D F,etal.Discovery of common va riants associated with low TSH levels and thyroidcancer risk.[J].Nat ure Genetics,2012,44(3):319-22.)。
因此,对NKX2-1、FOXE1、NRG1三个与甲状腺癌相关基因的多态性位点进行检测,能了解个体在甲状腺癌方面的遗传因素,评估甲状腺癌发病的相对风险,对于甲状腺癌早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义。同时还能辅助甲状腺癌的诊断,指导合理用药,帮助预测后代患病风险等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒及其应用,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒,所述试剂盒中包括DNA提取试剂盒、DNA扩增试剂盒和测序试剂盒;所述DNA提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的DP322型产品,所述DNA扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、PCR Buffe r、dNTP Mixture、扩增引物,所述扩增引物为:1)F:5'-TTGGACTGAGCCGTGCT AACAG-3',R:5'-AAAAGCACGTCTCCCACAGTCC-3',2)F:5'-AAGGGAGCTGGGATGAAAG GAG-3',R:5'-CCCCTTTTGCTCAGCACTTTTG-3',3)F:5'-TTTCTCTTGCTTGCTCGCTCC T-3',R:5'-TCTGGAGTTCCCTGAAAGCAGAG-3';所述酶采用宝生物工程有限公司的TaKaRa TaqTM酶;所述测序试剂盒采用美国ABI公司的v3.1Cycle Sequencing Kit。
作为本发明进一步的方案:所述扩增引物为基于基因NKX2-1、FOXE1和NRG1进行设计合成的。
一种甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒的应用,具体步骤为:
(1)首先,将采集回来的样本按照DNA提取试剂盒提取获得样本基因组DN A;
(2)然后,将获得样本基因组DNA使用DNA扩增试剂盒进行扩增,得到扩增后的产物,随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化,得到纯化后的产物;
(3)接着,在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应;
(4)最后,将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/EDTA纯化,纯化后上样到测序仪中,序列分析后进行分型判定。
作为本发明进一步的方案:步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。
作为本发明进一步的方案:步骤(4)中乙醇/EDTA纯化具体为从PCR仪上取下反应板,3800rpm离心1min;加2.5μl 0.125M EDTA,短离心;静置5min;加20μl预冷无水乙醇,贴封口膜,振荡混匀;3800rpm,4℃离心30mi n;离心结束后立即,倒置PCR板低速离心片刻,转速不超过800rpm;加60μl75%的预冷乙醇,贴膜,振荡混匀;3800rpm,4℃离心15min;离心结束后立即,倒置PCR板低速离心片刻,转速不超过800rpm;PCR仪变性程序处理5mi n,或避光静置30min,挥发乙醇;加10μl Hi-Di甲酰胺,贴膜,短离心;95℃变性5min;迅速置于-20℃冰箱。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明制备出一种甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒,对NKX2-1、FOXE1、NRG1三个与甲状腺癌相关基因的多态性位点进行检测,能了解个体在甲状腺癌方面的遗传因素,评估甲状腺癌发病的相对风险,对于甲状腺癌早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义;同时还能辅助甲状腺癌的诊断,指导合理用药,帮助预测后代患病风险等;本专利产品采用基因检测领域的金标准——桑格测序法进行基因分型;桑格测序法是通过控制DNA的合成来产生终止于靶序列特定位点的寡核苷酸片段;首先,合成的寡核苷酸引物同单链的DNA模板退火,设立四种不同的测序反应,每一种反应中都含有DNA聚合酶和四种正常的dNTP;除此之外,还含有少量的有3'-H取代普通脱氧核糖3'-OH的2',3'-ddNTP;若ddNT P掺入到延伸中的DNA链,由于缺少3'-OH将会阻断后续dNTP形成磷酸二酯键,DNA的进一步延伸被终止;使用四种不同的ddNTP,产生的寡核苷酸将终止于每一个A,C,G或T在模板链上占据的位置,将四种反应产生的寡核苷酸加到测序仪中,由于寡核苷酸片段的大小不同,泳动的速率就不同,测序仪的图像控制器按照寡核苷酸经过的时间顺序,便可以检测出新合成链5'到3'的序列信息。
附图说明
图1为本发明的杂合型CT测序分型结果图;
图2为本发明的杂合型CT测序分型结果图;
图3为本发明的正常纯合型GG测序分型结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
一种甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒,所述试剂盒中包括DNA提取试剂盒、DNA扩增试剂盒和测序试剂盒;所述DNA提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的DP322型产品,所述DNA扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、PCR Buffe r、dNTP Mixture、扩增引物,所述扩增引物为:1)F:5'-TTGGACTGAGCCGTGCT AACAG-3'(SEQ ID NO.1),R:5'-AAAAGCACGTCTCCCACAGTCC-3'(SEQ ID NO.2),2)F:5'-AAGGGAGCTGGGATGAAAGGAG-3'(SEQID NO.3),R:5'-CCCCTTTTGCTCA GCACTTTTG-3'(SEQ ID NO.4),3)F:5'-TTTCTCTTGCTTGCTCGCTCCT-3'(SEQ ID NO.5),R:5'-TCTGGAGTTCCCTGAAAGCAGAG-3'(SEQ ID NO.6);所述酶采用宝生物工程有限公司的TaKaRa TaqTM酶;所述测序试剂盒采用美国ABI公司的BigDyv3.1Cycle Sequencing Kit。
所述扩增引物为基于基因NKX2-1、FOXE1和NRG1进行设计合成的;其中,检测的目标SNP位点包括rs944289、rs965513和rs2439302,这3个位点分别位于基因NKX2-1、FOXE1和NRG1。
一种甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒的应用,具体步骤为:
(1)首先,将采集回来的样本按照DNA提取试剂盒提取获得样本基因组DN A;
(2)然后,将获得样本基因组DNA使用DNA扩增试剂盒进行扩增,得到扩增后的产物,随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化,得到纯化后的产物;
(3)接着,在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应;
(4)最后,将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/EDTA纯化,纯化后上样到测序仪中,序列分析后进行分型判定。
其中:
步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。
步骤(2)中使用DNA扩增试剂盒进行扩增,扩增的反应体系为:
TaKaRa Taq TM(5U/μl)1U
10×PCR Buffer(Mg2+)5μl
dNTP Mixture(2.5mM each)4μl
正向引物(10pmol/μl)0.5μl
反向引物(10pmol/μl)0.5μl
模板1μl
双蒸水up to 50μl,
扩增程序为:
Stage1:Pre degeneration
Repeat:1time
95℃3minutes
Stage 2:PCR reaction
Repeat:30cycles
95℃5second
55℃30second
72℃1minutes
Stage 3:Final extension
72℃5minutes。
步骤(2)中电泳检测和纯化,其中电泳检测具体步骤为:制备1%的琼脂糖凝胶:称一定量的琼脂糖粉加入对应体积的10×TAE加热熔解琼脂糖,待其完全熔解后加入10000×Gold ViewⅠ。待胶凝固后,取5μl的PCR产物加入Loadi ng Buffer混合后,点到胶孔内,120V定压,跑15min左右。在TGreen Trans illuminator内观察扩增产物的片段大小、单一性及扩增浓度;
其中纯化体系为:
PCR扩增后的反应液5μl
SAP/CIP(1U/μl)1μl
ExoⅠ(5U/μl)1μl
ddH2O 3μl,
其中纯化反应程序为:
37℃30minutes
75℃15minutes。
步骤(3)中的桑格测序反应,反应体系为:
BigDye混合液1μl
测序引物(3.2pmol/μl)1μl
模板(纯化产物)1μl
ddH2O 2μl,
反应程序为:
Stage1:1time
95℃2minutes
Stage 2:25cycles
95℃10second
50℃5second
60℃4minutes。
步骤(4)中乙醇/EDTA纯化具体为从PCR仪上取下反应板,3800rpm离心1min;加2.5μl 0.125M EDTA,短离心;静置5min;加20μl预冷无水乙醇,贴封口膜,振荡混匀;3800rpm,4℃离心30min;离心结束后立即,倒置PCR板低速离心片刻,转速不超过800rpm;加60μl 75%的预冷乙醇,贴膜,振荡混匀;3800rpm,4℃离心15min;离心结束后立即,倒置PCR板低速离心片刻,转速不超过800rpm;PCR仪变性程序处理5min,或避光静置30min,挥发乙醇;加10μlHi-Di甲酰胺,贴膜,短离心;95℃变性5min;迅速置于-20℃冰箱。
结果检测判定:
分型判定标准如下,见表1。
表1
其中rs944289的杂合型GT、rs965513的杂合型CT和rs2439302的正常纯合型GG,测序分型结果图,见图1-3.
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括DNA提取试剂盒、DNA扩增试剂盒和测序试剂盒;所述DNA提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的DP322型产品,所述DNA扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、PCR Buffer、dNTP Mixtu re、扩增引物,所述扩增引物为:1)F:5'-TTGGACTGAGCCGTGCTAACAG-3',R:5'-AAAAGCACGTCTCCCACAGTCC-3',2)F:5'-AAGGGAGCTGGGATGAAAGGAG-3',R:5'-CCCCTTTTGCTCAGCACTTTTG-3',3)F:5'-TTTCTCTTGCTTGCTCGCTCCT-3',R:5'-TCTGGAGTTCCCTGAAAGCAGAG-3';所述酶采用宝生物工程有限公司的TaKaRa TaqTM酶;所述测序试剂盒采用美国ABI公司的Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit。
2.根据权利要求1所述的甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒,其特征在于,所述扩增引物为基于基因NKX2-1、FOXE1和NRG1进行设计合成的。
3.一种如权利要求1-2任一所述的甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒的应用,其特征在于,具体步骤为:
(1)首先,将采集回来的样本按照DNA提取试剂盒提取获得样本基因组DNA;
(2)然后,将获得样本基因组DNA使用DNA扩增试剂盒进行扩增,得到扩增后的产物,随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化,得到纯化后的产物;
(3)接着,在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应;
(4)最后,将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/EDTA纯化,纯化后上样到测序仪中,序列分析后进行分型判定。
4.根据权利要求3所述的甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒的应用,其特征在于,步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。
5.根据权利要求3所述的甲状腺癌易感基因检测分型试剂盒的应用,其特征在于,步骤(4)中乙醇/EDTA纯化具体为从PCR仪上取下反应板,3800rpm离心1min;加2.5μl 0.125MEDTA,短离心;静置5min;加20μl预冷无水乙醇,贴封口膜,振荡混匀;3800rpm,4℃离心30min;离心结束后立即,倒置PCR板低速离心片刻,转速不超过800rpm;加60μl 75%的预冷乙醇,贴膜,振荡混匀;3800rpm,4℃离心15min;离心结束后立即,倒置PCR板低速离心片刻,转速不超过800rpm;PCR仪变性程序处理5min,或避光静置30min,挥发乙醇;加10μl Hi-Di甲酰胺,贴膜,短离心;95℃变性5min;迅速置于-20℃冰箱。
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