CN106801081A - 一种从米糠中提取活性蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从米糠中提取活性蛋白的方法,1)预处理:在米糠中加入异丙醇,搅拌,加入正己烷浸提,调浆,倒入胶体磨,离心,取米糠粕真空脱溶,得脱脂米糠粕;2)酶解和提取:在米糠粕中加蒸馏水,微波提取,调pH,加入米糠粨1~2%重量份的复合酶,搅拌,灭酶,离心取上清液;3)分离纯化:超滤,凝胶层析,冷冻干燥,得活性蛋白;本发明对米糠进行脱脂、微波提取,酶解、分离纯化,提高得到提取物的活性蛋白含量,得到的活性蛋白纯度高。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域,具体涉及一种从米糠中提取活性蛋白的方法。
背景技术
米糠是稻谷加工中最重要的一类副产品。米糠不仅含有丰富的脂质(16~22%)、粗蛋白(12~16%),还含有多种天然活性物质,如植酸、谷维素、γ- 氨基丁酸、脂多糖、生育酚等。目前我国米糠年产量已达到1800万吨,但利用率只有10%,大部分作为低价值饲料使用,造成了极大浪费。
米糠蛋白是一种营养价值很高的植物蛋白质,其中可溶性蛋白约占70%,必需氨基酸组成接近人体需要模式,且赖氨酸和蛋氨酸含量高于大米及其它谷物含量,可弥补谷物蛋白某些氨酸酸不足的缺陷。
现有技术如,中国发明授权专利,授权公告号CN 103351422 B,该发明公开了一种从糙米或/和米糠中提取天然生物活性蛋白的方法,包括:将糙米或/和米糠经脱脂处理得到脱脂米粉;将脱脂米粉与氯化钠水溶液混合,然后经振荡提取、第一分离收集上清液,即为总盐溶性蛋白溶液;向总盐溶性蛋白溶液加入乙醇,混合均匀,经静置、第二分离后除去沉淀部分,得到生物活性蛋白溶液;将生物活性蛋白溶液经后处理除乙醇、除盐分以及干燥后得到天然生物活性蛋白。该发明方法采用氯化钠和乙醇两种食品级原料,能够从糙米或/和米糠中提取天然生物活性蛋白,低成本,无污染。该发明方法制备的天然生物活性蛋白,可以用作制备保健食品、作为食品添加剂和应用到化妆品中,具有广阔的应用前景,但该提取方法略为简单,提取到的提取物中活性蛋白可能不太高,含有杂质。
现有技术如,中国发明授权专利,授权公告号CN 103833786 B,该发明提供一种米糠营养和活性物质的高效提取方法。该方法包括(1)全脂米糠筛分除杂;(2)酸浸泡提取植酸;(3)高速剪切辅助复配溶剂浸提米糠毛油;(4)酶法提取米糠蛋白。该发明方法可从全脂米糠中先后高效的提取出植酸、脂肪和蛋白质,实现了全脂米糠的高值化全利用,提高其附加值,避免资源浪费,但该发明提取米糠活性蛋白的纯度不高,在提取率上还具有提升空间。
发明内容
本发明针对上述技术问题提供一种从米糠中提取活性蛋白的方法,对米糠进行脱脂、酶解、分离纯化,提高得到提取物的活性蛋白含量,得到的活性蛋白纯度高,提高了米糠的利用价值,避免资源浪费。
本发明针对上述技术问题所采取的方案为:一种从米糠中提取活性蛋白的方法,方法包括以下步骤:
1)预处理:在米糠中加入异丙醇,搅拌,加入正己烷浸提,调浆,倒入胶体磨,离心,取米糠粕真空脱溶,得脱脂米糠粕;
2)酶解和提取:在米糠粕中加蒸馏水,微波提取,调pH,加入米糠粨1~2%重量份的复合酶,搅拌,灭酶,离心取上清液;
3)分离纯化:超滤,凝胶层析,冷冻干燥,得活性蛋白;本发明对米糠进行脱脂、微波提取,酶解、分离纯化,提高得到提取物的活性蛋白含量,得到的活性蛋白纯度高。
步骤2)中蒸馏水中含有0.1~0.1%的苯氧基乙醇和0.01~0.1%的对氨基苯甲酸盐。
作为优选,步骤1中的米糠与异丙醇的体积比为1:2.5~6.3,米糠与正己烷的体积比为1:2.7~6.2,通过高速剪切辅助复配溶剂浸提的方法,对米糠中的脂肪进行分离。
作为优选,步骤1中调浆后倒入胶体磨8~22min,于3200~4800r/min离心8~25min,得米糠粕和混合油,取米糠粕,真空脱溶的真空度为0.05~0.2MPa,温度为40~60℃, 脱除米糠中的脂肪和杂质。
作为优选,步骤2中加入米糠重量30~45倍的蒸馏水,微波提取的微波功率为350~450w,在45~55℃下微波提取2~3次,每次30~50min,使细胞内部的温度将迅速上升,从而使细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力,结果细胞破裂,其内的有效成分自由流出。
作为优选,步骤2中调pH至5.8~6.3,复合酶由纤维素酶2~5份、糖化酶2~5份、木瓜蛋白酶2~5份、乙醛脱氢酶0.2~0.7份、单宁酶0.6~1份、单甘脂 0.1~0.3份,搅拌酶解时间为50~80min,利用复合酶可降解多种蛋白质,提高蛋白质的提取率和纯度,复合酶的酶解效率高而且酶解时间快,效果好。
作为优选,步骤3超滤的滤膜截留分子量为8000~14000Da,超滤压力为4×104Pa,去除多肽、多糖和盐以获得高纯度的活性蛋白。
作为优选,步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成,凝胶与减盐缓冲液的质量比为1:0.3:1~3,碱盐缓冲液为体积比例为1:0.8~3.6混合的0.02~0.4mol/L NaOH溶液和含有0.05~0.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液,用NaCl 进行柱效检测与丙酮进行柱效检测效果一样,凝胶层析后的洗脱液中的活性蛋白纯度高。
作为优选,步骤3中凝胶层析后在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应,收集有显色反应的洗脱液,获得高含量的活性蛋白的溶液。
与现有技术相比,本发明的有益效果:通过高速剪切辅助复配溶剂浸提的方法,对米糠中的脂肪进行分离、加入苯氧基乙醇和对氨基苯甲酸盐,再通过微波提取使细胞内部的温度将迅速上升,从而使细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力,结果细胞破裂其内的有效成分自由流出,苯氧基乙醇和对氨基苯甲酸盐具有促进细胞壁破裂的作用,从而酶解可降解多种蛋白质,提高蛋白质的提取率和纯度、分离纯化,提高得到提取物的活性蛋白含量,得到的活性蛋白纯度高。
具体实施例
以下结合实施例作进一步详细描述:
实施例1
一种从米糠中提取活性蛋白的方法,方法包括以下步骤:
1)预处理:在米糠中加入异丙醇,搅拌,加入正己烷浸提,调浆,倒入胶体磨,离心,取米糠粕真空脱溶,得脱脂米糠粕;
2)酶解和提取:在米糠粕中加蒸馏水,微波提取,调pH,加入米糠粨1~2%重量份的复合酶,搅拌,灭酶,离心取上清液;
3)分离纯化:超滤,凝胶层析,冷冻干燥,得活性蛋白;本发明对米糠进行脱脂、微波提取,酶解、分离纯化,提高得到提取物的活性蛋白含量,得到的活性蛋白纯度高。
步骤2)中蒸馏水中含有0.1~0.1%的苯氧基乙醇和0.01~0.1%的对氨基苯甲酸盐。
步骤1中的米糠与异丙醇的体积比为1:2.5~6.3,米糠与正己烷的体积比为1:2.7~6.2,通过高速剪切辅助复配溶剂浸提的方法,对米糠中的脂肪进行分离。
步骤1中调浆后倒入胶体磨8~22min,于3200~4800r/min离心8~25min,得米糠粕和混合油,取米糠粕,真空脱溶的真空度为0.05~0.2MPa,温度为40~60℃, 脱除米糠中的脂肪和杂质。
步骤2中加入米糠重量30~45倍的蒸馏水,微波提取的微波功率为350~450w,在45~55℃下微波提取2~3次,每次30~50min,使细胞内部的温度将迅速上升,从而使细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力,结果细胞破裂,其内的有效成分自由流出。
步骤2中调pH至5.8~6.3,复合酶由纤维素酶2~5份、糖化酶2~5份、木瓜蛋白酶2~5份、乙醛脱氢酶0.2~0.7份、单宁酶0.6~1份、单甘脂 0.1~0.3份,搅拌酶解时间为50~80min,利用复合酶可降解多种蛋白质,提高蛋白质的提取率和纯度,复合酶的酶解效率高而且酶解时间快,效果好。
步骤3超滤的滤膜截留分子量为8000~14000Da,超滤压力为4×104Pa,去除多肽、多糖和盐以获得高纯度的活性蛋白。
步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成,凝胶与减盐缓冲液的质量比为1:0.3:1~3,碱盐缓冲液为体积比例为1:0.8~3.6混合的0.02~0.4mol/LNaOH溶液和含有0.05~0.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液,用NaCl 进行柱效检测与丙酮进行柱效检测效果一样,凝胶层析后的洗脱液中的活性蛋白纯度高。
步骤3中凝胶层析后在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应,收集有显色反应的洗脱液,获得高含量的活性蛋白的溶液。
实施例2
一种从米糠中提取活性蛋白的方法,方法包括以下优选步骤:
1)预处理:在米糠中加入异丙醇,米糠与异丙醇的体积比优选为1:3,搅拌,加入正己烷浸提,米糠与正己烷的体积比优选为1:3,调浆,倒入胶体磨中胶磨9min,于3500r/min离心8min,得米糠粕和混合油,取米糠粕,真空脱溶的真空度优选为0.1MPa,温度优选为52℃,得脱脂米糠粕;
2)酶解和提取:加入优选的米糠重量38倍的蒸馏水,微波提取,微波功率优选为380w,在52℃下微波提取3次,每次优选40min,调pH至6.1,加入优选的米糠粨1.2%重量份的复合酶,搅拌酶解55min,酶解温度优选为42℃,沸水灭酶,离心取上清液;
3)分离纯化:超滤,滤膜截留分子量优选为12000Da,超滤压力为4×104Pa,凝胶层析,在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应,收集有显色反应的洗脱液,冷冻干燥,得活性蛋白。
步骤2)中蒸馏水中含有0.1%的苯氧基乙醇和0.01%的对氨基苯甲酸盐。
上述步骤1~3中的超滤、凝胶层析等常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术,具体操作步骤在此不作详细描述,参考国标GB/T 5009.5-2010 中凯式定氮法(N×5.95)测定上述米糠活性蛋白提取率为47.4%以上,纯度在57.8%以上。
步骤2中复合酶由优选的纤维素酶4份、糖化酶3.5份、木瓜蛋白酶4份、乙醛脱氢酶0.6份、单宁酶0.7份、单甘脂 0.18份,利用复合酶可降解多种蛋白质,提高蛋白质的提取率和纯度,复合酶的酶解效率高而且酶解时间快,效果好。
步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成,凝胶与减盐缓冲液的质量比优选为1:0.3:2,碱盐缓冲液为体积比例为1:3混合的0.4mol/L NaOH溶液和含有0.2mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液,用NaCl 进行柱效检测与丙酮进行柱效检测效果一样,凝胶层析后的洗脱液中的活性蛋白纯度高,凝胶与减盐缓冲液的质量比不仅限于1:0.3:1~3,还应包括1:0.3:1、1:0.3:1.1、1:0.3:1.2、1:0.3:1.3……1:0.3:2.99、1:0.3:3。
步骤1中的米糠与异丙醇的体积比不仅限于1:2.5~6.3,还应包括1:2.5、1:2.51、1:2.52、1:2.53……1:6.29、1:6.3,米糠与正己烷的体积比不仅限于1:2.7~6.2,还应包括1:2.7、1:2.71、1:2.72、1.2.73……1:6.19、1:6.2。
以上实施方式仅用于说明本发明,而并非对本发明的限制,本领域的普通技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,还可以做出各种变化和变型。因此,所有等同的技术方案也属于本发明的范畴,本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
Claims (8)
1.一种从米糠中提取活性蛋白的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:
1)预处理:在米糠中加入异丙醇,搅拌,加入正己烷浸提,调浆,倒入胶体磨,离心,取米糠粕真空脱溶,得脱脂米糠粕;
2)酶解和提取:在米糠粕中加蒸馏水,微波提取,调pH,加入米糠粨1~2%重量份的复合酶,搅拌,灭酶,离心取上清液;
3)分离纯化:超滤,凝胶层析,冷冻干燥,得活性蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法,其特征在于:所述步骤1中的米糠与异丙醇的体积比为1:2.5~6.3,米糠与正己烷的体积比为1:2.7~6.2;
所述步骤2)中蒸馏水中含有0.1~0.1%的苯氧基乙醇和0.01~0.1%的对氨基苯甲酸盐。
3.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法,其特征在于:所述步骤1中调浆后倒入胶体磨8~22min,于3200~4800r/min离心8~25min,得米糠粕和混合油,取米糠粕,真空脱溶的真空度为0.05~0.2MPa,温度为40~60℃。
4.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法,其特征在于:所述步骤2中加入米糠重量30~45倍的蒸馏水,微波提取的微波功率为350~450w,在45~55℃下微波提取2~3次,每次30~50min。
5.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法,其特征在于:所述步骤2中调pH至5.8~6.3,所述复合酶由纤维素酶2~5份、糖化酶2~5份、木瓜蛋白酶2~5份、乙醛脱氢酶0.2~0.7份、单宁酶0.6~1份、单甘脂 0.1~0.3份,搅拌酶解时间为50~80min。
6.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法,其特征在于:所述步骤3超滤的滤膜截留分子量为8000~14000Da,超滤压力为4×104Pa。
7.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法,其特征在于:所述步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成,凝胶与减盐缓冲液的质量比为1:0.3:1~3,所述碱盐缓冲液为体积比例为1:0.8~3.6混合的0.02~0.4mol/L NaOH溶液和含有0.05~0.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液。
8.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法,其特征在于:所述步骤3中凝胶层析后在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应,收集有显色反应的洗脱液。
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