CN106801081A - 一种从米糠中提取活性蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从米糠中提取活性蛋白的方法，1）预处理：在米糠中加入异丙醇，搅拌，加入正己烷浸提，调浆，倒入胶体磨，离心，取米糠粕真空脱溶，得脱脂米糠粕；2）酶解和提取：在米糠粕中加蒸馏水，微波提取，调pH，加入米糠粨1~2%重量份的复合酶，搅拌，灭酶，离心取上清液；3）分离纯化：超滤，凝胶层析，冷冻干燥，得活性蛋白；本发明对米糠进行脱脂、微波提取，酶解、分离纯化，提高得到提取物的活性蛋白含量，得到的活性蛋白纯度高。

Description

一种从米糠中提取活性蛋白的方法
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种从米糠中提取活性蛋白的方法。
背景技术
米糠是稻谷加工中最重要的一类副产品。米糠不仅含有丰富的脂质（16~22%）、粗蛋白（12~16%），还含有多种天然活性物质，如植酸、谷维素、γ- 氨基丁酸、脂多糖、生育酚等。目前我国米糠年产量已达到1800万吨，但利用率只有10%，大部分作为低价值饲料使用，造成了极大浪费。
米糠蛋白是一种营养价值很高的植物蛋白质，其中可溶性蛋白约占70%，必需氨基酸组成接近人体需要模式，且赖氨酸和蛋氨酸含量高于大米及其它谷物含量，可弥补谷物蛋白某些氨酸酸不足的缺陷。
现有技术如，中国发明授权专利，授权公告号CN 103351422 B，该发明公开了一种从糙米或/和米糠中提取天然生物活性蛋白的方法，包括：将糙米或/和米糠经脱脂处理得到脱脂米粉；将脱脂米粉与氯化钠水溶液混合，然后经振荡提取、第一分离收集上清液，即为总盐溶性蛋白溶液；向总盐溶性蛋白溶液加入乙醇，混合均匀，经静置、第二分离后除去沉淀部分，得到生物活性蛋白溶液；将生物活性蛋白溶液经后处理除乙醇、除盐分以及干燥后得到天然生物活性蛋白。该发明方法采用氯化钠和乙醇两种食品级原料，能够从糙米或/和米糠中提取天然生物活性蛋白，低成本，无污染。该发明方法制备的天然生物活性蛋白，可以用作制备保健食品、作为食品添加剂和应用到化妆品中，具有广阔的应用前景，但该提取方法略为简单，提取到的提取物中活性蛋白可能不太高，含有杂质。
现有技术如，中国发明授权专利，授权公告号CN 103833786 B，该发明提供一种米糠营养和活性物质的高效提取方法。该方法包括（1）全脂米糠筛分除杂；（2）酸浸泡提取植酸；（3）高速剪切辅助复配溶剂浸提米糠毛油；（4）酶法提取米糠蛋白。该发明方法可从全脂米糠中先后高效的提取出植酸、脂肪和蛋白质，实现了全脂米糠的高值化全利用，提高其附加值，避免资源浪费，但该发明提取米糠活性蛋白的纯度不高，在提取率上还具有提升空间。
发明内容
本发明针对上述技术问题提供一种从米糠中提取活性蛋白的方法，对米糠进行脱脂、酶解、分离纯化，提高得到提取物的活性蛋白含量，得到的活性蛋白纯度高，提高了米糠的利用价值，避免资源浪费。
本发明针对上述技术问题所采取的方案为：一种从米糠中提取活性蛋白的方法，方法包括以下步骤：
1）预处理：在米糠中加入异丙醇，搅拌，加入正己烷浸提，调浆，倒入胶体磨，离心，取米糠粕真空脱溶，得脱脂米糠粕；
2）酶解和提取：在米糠粕中加蒸馏水，微波提取，调pH，加入米糠粨1~2%重量份的复合酶，搅拌，灭酶，离心取上清液；
3）分离纯化：超滤，凝胶层析，冷冻干燥，得活性蛋白；本发明对米糠进行脱脂、微波提取，酶解、分离纯化，提高得到提取物的活性蛋白含量，得到的活性蛋白纯度高。
步骤2）中蒸馏水中含有0.1~0.1%的苯氧基乙醇和0.01~0.1%的对氨基苯甲酸盐。
作为优选，步骤1中的米糠与异丙醇的体积比为1：2.5~6.3，米糠与正己烷的体积比为1：2.7~6.2，通过高速剪切辅助复配溶剂浸提的方法，对米糠中的脂肪进行分离。
作为优选，步骤1中调浆后倒入胶体磨8~22min，于3200~4800r/min离心8~25min，得米糠粕和混合油，取米糠粕，真空脱溶的真空度为0.05~0.2MPa，温度为40~60℃， 脱除米糠中的脂肪和杂质。
作为优选，步骤2中加入米糠重量30~45倍的蒸馏水，微波提取的微波功率为350~450w，在45~55℃下微波提取2~3次，每次30~50min，使细胞内部的温度将迅速上升，从而使细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力，结果细胞破裂，其内的有效成分自由流出。
作为优选，步骤2中调pH至5.8~6.3，复合酶由纤维素酶2~5份、糖化酶2~5份、木瓜蛋白酶2~5份、乙醛脱氢酶0.2~0.7份、单宁酶0.6~1份、单甘脂 0.1~0.3份，搅拌酶解时间为50~80min，利用复合酶可降解多种蛋白质，提高蛋白质的提取率和纯度，复合酶的酶解效率高而且酶解时间快，效果好。
作为优选，步骤3超滤的滤膜截留分子量为8000~14000Da，超滤压力为4×104Pa，去除多肽、多糖和盐以获得高纯度的活性蛋白。
作为优选，步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成，凝胶与减盐缓冲液的质量比为1：0.3：1~3，碱盐缓冲液为体积比例为1：0.8~3.6混合的0.02~0.4mol/L NaOH溶液和含有0.05~0.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液，用NaCl 进行柱效检测与丙酮进行柱效检测效果一样，凝胶层析后的洗脱液中的活性蛋白纯度高。
作为优选，步骤3中凝胶层析后在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应，收集有显色反应的洗脱液，获得高含量的活性蛋白的溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果：通过高速剪切辅助复配溶剂浸提的方法，对米糠中的脂肪进行分离、加入苯氧基乙醇和对氨基苯甲酸盐，再通过微波提取使细胞内部的温度将迅速上升，从而使细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力，结果细胞破裂其内的有效成分自由流出，苯氧基乙醇和对氨基苯甲酸盐具有促进细胞壁破裂的作用，从而酶解可降解多种蛋白质，提高蛋白质的提取率和纯度、分离纯化，提高得到提取物的活性蛋白含量，得到的活性蛋白纯度高。
具体实施例
以下结合实施例作进一步详细描述：
实施例1
一种从米糠中提取活性蛋白的方法，方法包括以下步骤：
1）预处理：在米糠中加入异丙醇，搅拌，加入正己烷浸提，调浆，倒入胶体磨，离心，取米糠粕真空脱溶，得脱脂米糠粕；
2）酶解和提取：在米糠粕中加蒸馏水，微波提取，调pH，加入米糠粨1~2%重量份的复合酶，搅拌，灭酶，离心取上清液；
3）分离纯化：超滤，凝胶层析，冷冻干燥，得活性蛋白；本发明对米糠进行脱脂、微波提取，酶解、分离纯化，提高得到提取物的活性蛋白含量，得到的活性蛋白纯度高。
步骤2）中蒸馏水中含有0.1~0.1%的苯氧基乙醇和0.01~0.1%的对氨基苯甲酸盐。
步骤1中的米糠与异丙醇的体积比为1：2.5~6.3，米糠与正己烷的体积比为1：2.7~6.2，通过高速剪切辅助复配溶剂浸提的方法，对米糠中的脂肪进行分离。
步骤1中调浆后倒入胶体磨8~22min，于3200~4800r/min离心8~25min，得米糠粕和混合油，取米糠粕，真空脱溶的真空度为0.05~0.2MPa，温度为40~60℃， 脱除米糠中的脂肪和杂质。
步骤2中加入米糠重量30~45倍的蒸馏水，微波提取的微波功率为350~450w，在45~55℃下微波提取2~3次，每次30~50min，使细胞内部的温度将迅速上升，从而使细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力，结果细胞破裂，其内的有效成分自由流出。
步骤2中调pH至5.8~6.3，复合酶由纤维素酶2~5份、糖化酶2~5份、木瓜蛋白酶2~5份、乙醛脱氢酶0.2~0.7份、单宁酶0.6~1份、单甘脂 0.1~0.3份，搅拌酶解时间为50~80min，利用复合酶可降解多种蛋白质，提高蛋白质的提取率和纯度，复合酶的酶解效率高而且酶解时间快，效果好。
步骤3超滤的滤膜截留分子量为8000~14000Da，超滤压力为4×104Pa，去除多肽、多糖和盐以获得高纯度的活性蛋白。
步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成，凝胶与减盐缓冲液的质量比为1：0.3：1~3，碱盐缓冲液为体积比例为1：0.8~3.6混合的0.02~0.4mol/LNaOH溶液和含有0.05~0.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液，用NaCl 进行柱效检测与丙酮进行柱效检测效果一样，凝胶层析后的洗脱液中的活性蛋白纯度高。
步骤3中凝胶层析后在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应，收集有显色反应的洗脱液，获得高含量的活性蛋白的溶液。
实施例2
一种从米糠中提取活性蛋白的方法，方法包括以下优选步骤：
1）预处理：在米糠中加入异丙醇，米糠与异丙醇的体积比优选为1：3，搅拌，加入正己烷浸提，米糠与正己烷的体积比优选为1：3，调浆，倒入胶体磨中胶磨9min，于3500r/min离心8min，得米糠粕和混合油，取米糠粕，真空脱溶的真空度优选为0.1MPa，温度优选为52℃，得脱脂米糠粕；
2）酶解和提取：加入优选的米糠重量38倍的蒸馏水，微波提取，微波功率优选为380w，在52℃下微波提取3次，每次优选40min，调pH至6.1，加入优选的米糠粨1.2%重量份的复合酶，搅拌酶解55min，酶解温度优选为42℃，沸水灭酶，离心取上清液；
3）分离纯化：超滤，滤膜截留分子量优选为12000Da，超滤压力为4×104Pa，凝胶层析，在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应，收集有显色反应的洗脱液，冷冻干燥，得活性蛋白。
步骤2）中蒸馏水中含有0.1%的苯氧基乙醇和0.01%的对氨基苯甲酸盐。
上述步骤1~3中的超滤、凝胶层析等常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，具体操作步骤在此不作详细描述，参考国标GB/T 5009.5-2010 中凯式定氮法（N×5.95）测定上述米糠活性蛋白提取率为47.4%以上，纯度在57.8%以上。
步骤2中复合酶由优选的纤维素酶4份、糖化酶3.5份、木瓜蛋白酶4份、乙醛脱氢酶0.6份、单宁酶0.7份、单甘脂 0.18份，利用复合酶可降解多种蛋白质，提高蛋白质的提取率和纯度，复合酶的酶解效率高而且酶解时间快，效果好。
步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成，凝胶与减盐缓冲液的质量比优选为1：0.3：2，碱盐缓冲液为体积比例为1：3混合的0.4mol/L NaOH溶液和含有0.2mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液，用NaCl 进行柱效检测与丙酮进行柱效检测效果一样，凝胶层析后的洗脱液中的活性蛋白纯度高，凝胶与减盐缓冲液的质量比不仅限于1：0.3：1~3，还应包括1：0.3：1、1：0.3：1.1、1：0.3：1.2、1：0.3：1.3……1：0.3：2.99、1：0.3：3。
步骤1中的米糠与异丙醇的体积比不仅限于1：2.5~6.3，还应包括1：2.5、1：2.51、1：2.52、1：2.53……1：6.29、1：6.3，米糠与正己烷的体积比不仅限于1：2.7~6.2，还应包括1：2.7、1：2.71、1：2.72、1.2.73……1：6.19、1：6.2。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (8)

1.一种从米糠中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1）预处理：在米糠中加入异丙醇，搅拌，加入正己烷浸提，调浆，倒入胶体磨，离心，取米糠粕真空脱溶，得脱脂米糠粕；
2）酶解和提取：在米糠粕中加蒸馏水，微波提取，调pH，加入米糠粨1~2%重量份的复合酶，搅拌，灭酶，离心取上清液；
3）分离纯化：超滤，凝胶层析，冷冻干燥，得活性蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1中的米糠与异丙醇的体积比为1：2.5~6.3，米糠与正己烷的体积比为1：2.7~6.2；
所述步骤2）中蒸馏水中含有0.1~0.1%的苯氧基乙醇和0.01~0.1%的对氨基苯甲酸盐。
3.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1中调浆后倒入胶体磨8~22min，于3200~4800r/min离心8~25min，得米糠粕和混合油，取米糠粕，真空脱溶的真空度为0.05~0.2MPa，温度为40~60℃。
4.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述步骤2中加入米糠重量30~45倍的蒸馏水，微波提取的微波功率为350~450w，在45~55℃下微波提取2~3次，每次30~50min。
5.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述步骤2中调pH至5.8~6.3，所述复合酶由纤维素酶2~5份、糖化酶2~5份、木瓜蛋白酶2~5份、乙醛脱氢酶0.2~0.7份、单宁酶0.6~1份、单甘脂 0.1~0.3份，搅拌酶解时间为50~80min。
6.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述步骤3超滤的滤膜截留分子量为8000~14000Da，超滤压力为4×104Pa。
7.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成，凝胶与减盐缓冲液的质量比为1：0.3：1~3，所述碱盐缓冲液为体积比例为1：0.8~3.6混合的0.02~0.4mol/L NaOH溶液和含有0.05~0.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液。
8.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法，其特征在于：所述步骤3中凝胶层析后在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应，收集有显色反应的洗脱液。
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