CN1067718C

CN1067718C - 一种微生物及其os－植物调理素

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Publication number: CN1067718C
Application number: CN95107909A
Authority: CN
Inventors: 王士奎; 李延云; 祁雅琴; 肖明松; 白云龙; 聂宇燕; 丁素珍; 赵焕明
Original assignee: CHINA AGRICULTURAL ENG
Current assignee: CHINA AGRICULTURAL ENG
Priority date: 1995-07-31
Filing date: 1995-07-31
Publication date: 2001-06-27
Anticipated expiration: 2015-07-31
Also published as: CN1118374A

Abstract

本发明属微生物代谢物提取的植物生长调节剂，利用脱乙酰几丁质作为B_5-6菌株的诱导物及发酵底物，获得富含不同分子量聚氨基糖和氨基寡糖素，可提高植物抗性及促进植物生长的OS植物调理素。建立了一步发酵法生产工艺流程，包括CN-5诱导培养基及CN-10发酵培养基。试验证明可提高植物营养生长20%以上，生殖生长10～30%，提高植物抗病性20～50%。

Description

一种微生物及其OS-植物调理素

本发明涉及一种微生物及其微生物代谢物的提取方法。

聚氨基糖在自然界中主要以几丁质和脱乙酰几丁质的形式存在。业已发现，一定分子量的脱乙酰几丁质(1～10万)和低聚氨基糖素即氨基寡糖素具有显著的生物学功能，主要作用在于：(1)植物细胞活化因子，在基因水平上有效地调节植物基因的关闭和开放，其刺激效应的用量是现有激素的1/10～1/100，(2)抗性诱导因子，脱乙酰几丁质属于众多植物致病性真菌的细胞壁类似物，所以一定分子量的脱乙酰几丁质可替代真菌非专一性地刺激植物分泌抗性酶(几丁质酶)，达到提高植物免疫力，增强植物对真菌病害抗病能力的目的。目前，获得不同分子量脱乙酰几丁质和氨基寡糖素的主要手段是酶解法和酸解法，其主要缺点是酶解法成本高，不适于一步法直接降解，且降解效率低；酸解法其反应条件剧烈，工艺较难控制，后处理工艺复杂，收率较低。

本发明的目的是一步法直接利用菌体降解脱乙酰几丁质形成不同分子量的聚氨基糖和寡糖素的方法，进而研制出适合于农业生产应用的新型生物制剂-OS-植物调理素，该方法采用微生物发酵工程技术，可工业化生产OS-植物调理素。

本发明的主要技术内容：

将白僵菌Beauveria spp的一菌株，通过高能电子-紫外线复合物理因子诱变处理，进行初筛和复筛，最后获得B_s-6菌株，该菌株已保存在中国专利局指定的保藏单位(中国专利局普通微生物保藏中心)其保藏登记号为CGMCC №0233。

B_s-6菌株在下述CN-5诱导培养基上继代培养，培养条件为：25～32℃，培养7～10天。保存条件为：在下述CN-1培养基上4～8℃橡皮塞封口保存。

CN-5诱导培养基组成成份(mg/L)

脱乙酰几丁质 1000～5000

蛋白胨 1000

RCl 800

NaCl 500

KH₂PO₄ 500

MgSO₄ 500

Mn5O₄·4H₂0 10

CuSO₄·5H₂O 10

ZnSO₄·7H₂O 10

FeSO₄·7H₂O 10

葡萄糖 1000～1000

琼脂 15000～25000

pH 4.0～6.0

CN-1培养基组成成份(mg/L)

土豆浸汁 1000ml

蛋白胨 1000

葡萄糖 5000～20000

C-R 1000

琼脂 20000

本发明一步降解脱乙酰几丁质生产工艺流程：

(1)按CN-5培养基的配方组成配制生长培养基斜面，将B_s-6菌株活化后接入CN-5培养基斜面，25～32℃培养7～10天，观察到斜面布满分生孢子后即可。

(2)按CN-1培养基的配方组成，配制CN-1茄瓶培养基，方法为：取1000～2000ml茄瓶，每瓶装入CN-1培养基200～500ml,1.1～1.2k9/cm²压力下高温消毒15～20分钟，冷却即成茄瓶CN-1固体培养基。在超净工作台上将B_s-6菌种均匀涂布在茄瓶CN-1固体培养基上，25～32℃培养7～14天，当孢子布满茄瓶后，室温保存。

(3)将(2)中得到的培养物2～3瓶，转入5升种子罐中，罐中含下述CN-2活化培养基3升，通气培养24小时，培养温度25～32℃，待孢子充分萌发后，进入下步操作。

CN-2活化培养基组成成份(mg/L)

蛋白胨 1000～10000

葡萄糖 1000～10000

(4)将(3)中得到的培养物转300升种子罐中，其中含200升下述CN-3种子培养基，28～32℃通气培养63～72小时，通气量为0.5∶1∶1。

CN-3种子培养基组成成份(mg/L)

蛋白胨 1000～10000

KH₂PO₄ 500

NaCl 500

MgSO₄ 500

FeSO₄·7H₂O 10

CuSO₄·5H₂O 10

ZnSO₄·7H₂O 10

C-R 500～1000

泡敌 600

pH值自然

(5)将(4)中培养物转入3吨发酵罐中，其中含下述CN-10发酵培养基1.5～2吨，28～32℃间隙搅拌通气培养4～7天，通气量0.5∶1∶1，当转化率大于26％培养基相对粘度临近零时，终止发酵。

CN-10发酵培养基组成成份(mg/L)

脱乙酰几丁质 5000～10000

蛋白胨 1000～10000

KH₂PO₄ 800

NaCl 500

MgSO₄ 500

MnSO₄·4H₂O 10

ZnSO₄·7H₂O 10

CuSO₄·5H₂O 10

FeSO₄·7H₂O 10

泡敌 600

pH值 4.0～6.0

(6)OS-植物调理素的制备：取上述(5)中发酵的最终产物和0.5～1％脱乙酰几丁质在反应釜中混合，pH值3.5～6.0，在35～45℃保温，时间不小于3小时，配合辅料，即形成OS-植物调理素。其配方如下(重量百分比)：

发酵物 20～30％

0.5～1％脱乙酰几丁质 45～55％

KH₂PO₄ 2.0～2.5％

尿素 1.0～1.5％

微量元素(Mn、Zn、Cu、B) 1.5～2.5％

苯甲酸钠 0.1％

水 20～30％

图1为Bs-6菌株诱变及筛选工艺图；

图2为OS-植物调理素的生产工艺流程图。

本发明较已有技术相比具有如下优点及积极效果：

(1)本发明工艺简单，无废气、废物排出，可一步降解脱乙酰几丁质形成不同分子量聚氨基糖及氨基寡糖素。

(2)在发酵产物的基础上制备的OS-植物调理素，能使作物增产，改善农业生态环境。

例如：将OS-植物调理素稀释500倍，利用秋棚1号黄瓜作实验材料，在塑料大棚中直播，定植后，每隔10天喷施OS植物调理素，测得下列结果：(见表1、2、3)表1、2、3证明，OS-植物调理素对黄瓜营养生长有明显的促进作用，叶片数增长率为18.4％，叶面积增长率为42.4％和18.44％，侧枝数增长率为59.6％，黄瓜产量增加17.2％，霜霉病发病率降低42.8％，病情指数下降24.5％。

表1 OS-植物调理素对黄瓜营养生长的影响

SD-1、2:OS植物调理素

CK：对照

增长值：各项目起始观测数值与终止观测数值之差。

表2 OS植物调理素对黄瓜生殖生长的影响

表3 OS植物调理素对黄瓜病虫害的影响

以下详细叙述本发明的实施例：

(1)按CN-5培养基的配方组成配制生长培养基斜面，将B_s-6菌株活化后接入CN-5培养基斜面，25℃培养7天，观察到斜面布满分生孢子后即可。

(2)按CN-1培养基的配方组成，配制CN-1茄瓶培养基，方法为：取1500ml茄瓶，每瓶装入CN-1培养基250ml，1.2kg/cm²压力下高温消毒15分钟，冷却即成茄瓶CN-1固体培养基。在超净工作台上将B_s-6菌种均匀涂布在茄瓶CN-1固体培养基上，25℃培养7天，当孢子布满茄瓶后，室温保存。

(3)将(2)中得到的培养物2瓶，转入5升种子罐中，罐中含下述CN-2活化培养基3升，通气培养24小时，培养温度25℃，待孢子充分萌发后，进入下步操作。

(4)将(3)中得到的培养物转300升种子罐中，其中含200升CN-3种子培养基，28℃通气培养68小时，通气量为0.5∶1∶1 。

(5)将(4)中培养物转入3吨发酵罐中，其中含CN-10发酵培养基1.8吨，28℃间隙搅拌通气培养5天，通气量0.5∶1∶1，当转化率大于26％培养基相对粘度临近零时，终止发酵。

(6)OS-植物调理素的制备：取上述(5)中发酵的最终产物和0.5％脱乙酰几丁质在反应釜中混合，pH值6.0，45℃保温3小时，配合辅料，即形成OS-植物调理素。其详细配方如下(重量百分比)：

发酵物 25％

0.5～1％脱乙酰几丁质 50％

KH₂PO₄ 2.0％

尿素 1.4％

微量元素(Mn、Zn、Cu、B) 1.5％

苯甲酸钠 0.1％

水 20％

Claims

1、一种微生物菌株，其特征它是白僵菌(Beauveria spp)B_5-6菌株，其保藏登记号为CGMCC No 0233。

2、按权利要求1所述的微生物菌株，其特征在于将B_5-6菌株在下述CN-5诱导培养基上继代培养；

CN-5诱导培养基组成成份(mg/L)

脱乙酰几丁质 1000-5000

蛋白胨 1000

KCl 800

NaCl 500

KH₂PO₄ 500

MgSO₄ 500

MnSO₄·4H₂O 10

CuSO₄·5H₂O 10

ZnSO₄·7H₂O 10

FeSO₄·4H₂O 10

葡萄糖 1000-10000

琼脂 15000-25000

pH 4.0-6.0

3、按权利要求1所述的微生物菌株，其特征在于该菌株在下述CN-1培养基上，于4-8℃橡皮塞封口保存；

CN-1培养基组成成份(mg/L)

土豆浸汁 1000ml

蛋白胨 1000

葡萄糖 5000-20000

C-R 1000

琼脂 20000

4、一种微生物菌株代谢OS-植物调理素的生产方法，其一步降解脱乙酰几丁质生产工艺流程是：

(1)按CN-5培养基的配方组成配制生长培养基斜面，将B_5-6菌株活化后接入CN-5培养基斜面，25-32℃恒温培养7-10天，观察到斜面布满分生孢子后即可；

(2)按CN-1培养基的配方组成，配制CN-1茄瓶培养基，方法为：取1000-2000ml茄瓶，每瓶装入CN-1培养基200-500ml,1.1-1.2kg/cm²压力下高温消毒15-20分钟，冷却成茄瓶CN-1固体培养基，在超净工作台上B_5-6菌株均匀涂布在茄瓶CN-1固体培养基上，25-32℃恒温培养7-14天，当孢子布满茄瓶后，室温保存；

(3)将(2)中得到的培养物2-3瓶，转入5升种子罐中，罐中含CN-2活化培养基3升，通气培养24小时，培养温度25-32℃，待孢子充分萌发后，进入下步操作；

(4)将(3)中得到的培养物转300升种子罐中，其中含200升CN-3种子培养基，28-32℃恒温通气培养63-72小时，通气量为0.5∶1∶1；

(5)将(4)中培养物转入3吨发酵罐中，其中含CN-10发酵培养基1.5-2吨，28-32℃恒温间隙搅拌通气培养4-7天，通气量0.5∶1∶1，当转化率大于26％培养基相对粘度临近零时，终止发酵；其特征在于下述的CN-2活化培养基组成成份(mg/L)为：

蛋白胨 1000-10000

葡萄糖 1000-10000

下述的CN-3种子培养基组成成份为(mg/L)

蛋白胨 1000-10000

KH₂PO₄ 500

NaCl 500

MgSO₄ 500

FeSO₄·7H₂O 10

CuSO₄·5H₂O 10

ZnSO₄·7H₂O 10

C-R 500-1000

泡敌 600

pH值自然

下述的CN-1O发酵培养基组成成份为(mg/L)：

脱乙酰几丁质 5000-10000

蛋白胨 1000-10000

KH₂PO₄ 800

NaCl 500

MgSO₄ 500

MnSO₄·4H₂O 10

ZnSO₄·7H₂O 10

CuSO₄·7H₂O 10

FeSO₄·7H₂O 10

泡敌 600

pH值 4.0-6.0

(6)OS-植物调理素的制备：取上述(5)中发酵的最终产物和0.5-1％脱乙酰几丁质在反应釜中混合，pH值3.5-6.0，在35-45℃保温，时间不小于3小时，配合辅料，即形成OS-植物调理素。

5、一种OS植物调理素，其特征在于由下列配方组成：

权利要求4步骤(5)所述的发酵物 20-30％

0.5-1％脱乙酰几丁质 45-55％

KH₂PO₄ 2.0-2.5％

尿素 1.0-1.5％

微量元素(Mn、Zn、Cu、B) 1.5-2.5％

苯甲酸钠 0.1％

水 20-30％

上述各成分含量之和等于100％。