CN106770784B - 从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸a的方法 - Google Patents

Abstract

从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法，先进行硅胶的活化，然后进行硅胶表面改性，再在硅胶表面合成分子印迹聚合物，用分子印迹聚合物装柱，以甲醇活化得到分子印迹‑固相萃取柱，用分子印迹‑固相萃取柱检测富集中成药龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A；本发明具有操作简单、结合容量高、传质速率快和富集效率高的优点。

Description

从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法

技术领域

本发明涉及分子印迹技术领域，具体涉及从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法。

背景技术

马兜铃酸A是一类硝基菲类化合物，主要存在于马兜铃属和细辛属植物中，可导致严重的肾毒性，含有马兜铃酸类物质的药用植物和制剂先后被多国禁用。目前仍旧有些中药以及相关中成药还在使用中，对中药中的马兜铃酸的去除，有利于降低中药的毒性。

目前马兜铃酸A常用的富集方法有以下两种：溶剂法柱分离法；固相萃取法，以上马兜铃酸A的富集方法中：溶剂法柱分离法需要多次抽取、萃取、脱色等，还需要用到柱色谱进行分离。该类技术操作繁琐，富集效率低，耗时，成本高，同时提取的量也受到限制；固相萃取法的萃取材料C18、C8，虽然对马兜铃酸A的富集有一定效果，但是对强保留杂质无法有效去除。

目前，固相萃取法的萃取材料常采用分子印迹技术来合成，分子印迹技术是一种为获得在空间结构和结合位点上与特定目标分子相匹配的聚合物的技术，分子印迹技术制备的聚合物称为分子印迹聚合物，其对目标分子具有特异的识别能力和选择能力。传统的分子印迹聚合物的制备方法有本体聚合法和原位聚合法。本体聚合法得到的块状印迹聚合物经常需要粉碎、研磨、过筛后才能应用，其处理过程复杂费时，且在过筛过程中印迹聚合物损失较大，产品形状不规则，分散性较差。原位聚合法是在柱管中直接合成连续多孔的印迹聚合物，但其柱效仍旧不高，而且存在柱压较高的问题。另外，合成的印迹聚合物对模板分子包埋过深过紧，造成洗脱困难，结合容量有限，模板分子扩散阻力大，传质速率慢，不易于识别位点相结合，导致实际应用中对模板分子富集效率低。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法，具有操作简单、结合容量高、传质速率快和实际应用中对模板分子富集效率高的优点。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法，包括以下步骤：

1)制备分子印迹聚合物：

1.1)硅胶的活化：

称取硅胶，加入到质量浓度10％的稀盐酸中，其中每40mL稀盐酸中加入4-6g硅胶，于110℃加热回流24h；用超纯水抽滤洗涤至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅胶备用；

1.2)硅胶表面改性：

称取活化硅胶，加入甲苯、APTES和三乙胺组成的第一混合溶液形成混合体系，第一混合溶液每10mL中含有1g活化硅胶，第一混合溶液中甲苯、APTES和三乙胺体积比为(50-100):(2-4):1；混合体系于110℃加热回流24h，用甲醇抽滤洗涤至中性，55℃烘干24h，得到改性硅胶备用；

1.3)在硅胶表面合成分子印迹聚合物：

将伪模板分子和功能单体MAA加入锥形瓶中，然后加入改性硅胶，每毫摩尔功能单体MAA含有改性硅胶250mg，再加入氯仿，每克改性硅胶对应60mL氯仿；超声溶解，加入一枚磁力搅拌转子，密封瓶口，于45℃-65℃下恒温搅拌20h后打开瓶塞，加入交联剂EDGMA和引发剂AIBN，其中每毫摩尔功能单体MAA对应1-2mL交联剂EGDMA和0.04g AIBN；超声搅拌，通入氮气，密封瓶口，恒温搅拌聚合反应24h，取出聚合物，用甲醇洗涤，再用体积比为4:1-9:1甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分别用甲醇和水洗至中性，置于60℃过夜烘干，得到分子印迹聚合物；

2)制备分子印迹-固相萃取柱：

用步骤1)中制备的分子印迹聚合物100mg-200mg装柱，以甲醇活化得到分子印迹-固相萃取柱；

3)用分子印迹-固相萃取柱检测富集中成药龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A：

对龙胆泻肝丸进行粗提，得到浓缩物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加载于步骤2)制备的分子印迹-固相萃取柱中，用无水乙醇:水3:1-1:1淋洗30min，用体积比为4:1-9:1甲醇和冰醋酸的第三混合溶液洗脱30min，收集洗脱液并挥干得到含有马兜铃酸A的复合物，以色谱甲醇复溶后进高效液相色谱对复合物检测。

所述的伪模板分子为氧氟沙星、萘普生或吲哚美辛。

所述的伪模板分子和功能单体MAA的摩尔比例为1:3-1:5。

本发明的有益效果为：在硅胶表面合成分子印迹聚合物，将分子印迹聚合物制备成分子印迹-固相萃取柱，用于中成药龙胆泻肝丸中马兜铃酸A富集，操作过程简单，采用伪模板分子代替马兜铃酸A可以降低对实验者的毒性伤害和对环境的污染，故富集过程更为安全，环保，且能够快速地达到富集和检测目标物马兜铃酸A的目的，本发明具有操作简单、结合容量高、传质速率快和富集效率高的优点。

附图说明

图1为实施例1合成分子印迹聚合物流程示意图。

图2为实施例1所得的分子印迹聚合物扫描电镜图。

图3为实施例1固相萃取前的龙胆泻肝丸浓缩物色谱图。

图4为马兜铃酸A对照品色谱图。

图5为实施例1含有马兜铃酸A的复合物的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作详细地描述。

实施例1，参照图1，从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法，包括以下步骤：

1)制备分子印迹聚合物：

1.1)硅胶的活化：

称取硅胶30g，加入到质量浓度10％的稀盐酸250mL中，于110℃加热回流24h；用超纯水抽滤洗涤至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅胶备用；

1.2)硅胶表面改性：

称取活化硅胶30g，加入50mL甲苯、2mL APTES和1mL三乙胺组成的第一混合溶液形成混合体系，混合体系于110℃加热回流24h，用甲醇抽滤洗涤至中性，55℃烘干24h，得到改性硅胶备用；

1.3)在硅胶表面合成分子印迹聚合物：

称取0.5mmol的氧氟沙星和量取2mmol功能单体MAA于锥形瓶中，然后加入改性硅胶500mg，再加入氯仿30mL，超声溶解，加入一枚磁力搅拌转子，密封瓶口，于55℃下恒温搅拌20h后打开瓶塞，加入交联剂0.672mL EDGMA和引发剂16.8mg AIBN；超声搅拌，通入氮气，密封瓶口，恒温搅拌聚合反应24h，取出聚合物，用甲醇洗涤，用体积比为4:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分别用甲醇和水洗至中性，置于60℃过夜烘干得到氧氟沙星分子印迹聚合物，如图2所示，从图中可以看出，球形硅胶表面粗糙，明显有附着物，表明氧氟沙星已经成功被聚合在改性硅胶上，分子印迹聚合物制备成功；

2)制备分子印迹-固相萃取柱：

用步骤1)中制备的氧氟沙星分子印迹聚合物200mg装柱，以甲醇活化，得到分子印迹-固相萃取柱；

3)用分子印迹-固相萃取柱检测富集中成药龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A:

对龙胆泻肝丸进行粗提，得到浓缩物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加载于步骤2)制备的分子印迹-固相萃取柱中，用无水乙醇:水1:1淋洗30min，用体积比为4:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脱30min，收集洗脱液并挥干得到含有马兜铃酸A的复合物，以色谱甲醇复溶后进高效液相色谱对复合物检测。

本实施例的有益效果：参照图3、图4和图5，对比发现，图3中马兜铃酸A的含量分为0.014％，图5中马兜铃酸A的含量分别为0.169％，由此可见，采用本实施例，即以氧氟沙星为伪模板分子在球型硅胶表面合成分子印迹聚合物作为固相萃取填料用于富龙胆泻肝丸中的微量马兜铃酸A，可使龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A含量较常规方法提高11.9倍。由上述分析结果可见，本实施例可以有效富集马兜铃酸A，并且操作过程简单。

实施例2，从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法，包括以下步骤：

1)制备分子印迹聚合物：

1.1)硅胶的活化：

称取硅胶25g，加入到质量浓度10％的稀盐酸250mL中，于110℃加热回流24h；用超纯水抽滤洗涤至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅胶备用；

1.2)硅胶表面改性：

称取活化硅胶30g，加入100mL甲苯、4mL APTES和1mL三乙胺组成的第一混合溶液形成混合体系，混合体系于110℃加热回流24h，用甲醇抽滤洗涤至中性，55℃烘干24h，得到改性硅胶备用；

1.3)在硅胶表面合成分子印迹聚合物：

称取0.4mmol的氧氟沙星和量取2mmol功能单体MAA于锥形瓶中，然后加入改性硅胶500mg，再加入氯仿30mL，超声溶解，加入一枚磁力搅拌转子，密封瓶口，于45℃下恒温搅拌20h后打开瓶塞，加入交联剂0.672mL EDGMA和引发剂16.8mg AIBN；超声搅拌，通入氮气，密封瓶口，恒温搅拌聚合反应24h，取出聚合物，用甲醇洗涤，用体积比为7:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分别用甲醇和水洗至中性，置于60℃过夜烘干得到氧氟沙星分子印迹聚合物；

2)制备分子印迹-固相萃取柱：

用步骤1)中制备的氧氟沙星分子印迹聚合物100mg装柱，以甲醇活化，得到分子印迹-固相萃取柱；

3)用分子印迹-固相萃取柱检测富集中成药龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A:

对龙胆泻肝丸进行粗提，得到浓缩物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加载于步骤2)制备的分子印迹-固相萃取柱中，用无水乙醇:水3:1淋洗30min，用体积比为7:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脱30min，收集洗脱液并挥干得到含有马兜铃酸A的复合物，以色谱甲醇复溶后进高效液相色谱对复合物检测。

本实施例的有益效果：印迹聚合物电镜图与实施例1中的电镜图很类似，但复合物通过检测后，发现对马兜铃酸A的富集倍数较实施例1较低，由此可见，采用本实施例，即以氧氟沙星为伪模板分子合成分子印迹聚合物作为固相萃取填料可用于富龙胆泻肝丸中的微量马兜铃酸A，但富集效果不及实施例1。

实施例3，从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法，包括以下步骤：

1)制备分子印迹聚合物：

1.1)硅胶的活化：

称取硅胶40g，加入到质量浓度10％的稀盐酸250mL中，于110℃加热回流24h；用超纯水抽滤洗涤至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅胶备用；

1.2)硅胶表面改性：

称取活化硅胶30g，加入50mL甲苯、3mL APTES和1mL三乙胺组成的第一混合溶液形成混合体系，混合体系于110℃加热回流24h，用甲醇抽滤洗涤至中性，55℃烘干24h，得到改性硅胶备用；

1.3)在硅胶表面合成分子印迹聚合物：

称取0.6mmol的氧氟沙星和量取2mmol功能单体MAA于锥形瓶中，然后加入改性硅胶500mg，再加入氯仿30mL，超声溶解，加入一枚磁力搅拌转子，密封瓶口，于65℃下恒温搅拌20h后打开瓶塞，加入交联剂0.672mL EDGMA和引发剂16.8mg AIBN；超声搅拌，通入氮气，密封瓶口，恒温搅拌聚合反应24h，取出聚合物，用甲醇洗涤，用体积比为9:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分别用甲醇和水洗至中性，置于60℃过夜烘干得到氧氟沙星分子印迹聚合物；

2)制备分子印迹-固相萃取柱：

用步骤1)中制备的氧氟沙星分子印迹聚合物200mg装柱，以甲醇活化，得到分子印迹-固相萃取柱；

3)用分子印迹-固相萃取柱检测富集中成药龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A:

对龙胆泻肝丸进行粗提，得到浓缩物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加载于步骤2)制备的分子印迹-固相萃取柱中，用无水乙醇:水1:3淋洗30min，用体积比为9:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脱30min，收集洗脱液并挥干得到含有马兜铃酸A的复合物，以色谱甲醇复溶后进高效液相色谱对复合物检测。

本实施例的有益效果：印迹聚合物电镜图与实施例1中的电镜图很类似，但复合物通过检测后，发现对马兜铃酸A的富集倍数较实施例1低，由此可见，采用本实施例，即以氧氟沙星为伪模板分子合成分子印迹聚合物作为固相萃取填料可用于富龙胆泻肝丸中的微量马兜铃酸A，但富集效果不及实施例1。

实施例4，从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法，包括以下步骤：

1)制备分子印迹聚合物：

1.1)硅胶的活化：

称取硅胶30g，加入到质量浓度10％的稀盐酸250mL中，于110℃加热回流24h；用超纯水抽滤洗涤至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅胶备用；

1.2)硅胶表面改性：

称取活化硅胶30g，加入50mL甲苯、2mL APTES和1mL三乙胺组成的第一混合溶液形成混合体系，混合体系于110℃加热回流24h，用甲醇抽滤洗涤至中性，55℃烘干24h，得到改性硅胶备用；

1.3)在硅胶表面合成分子印迹聚合物：

称取0.5mmol的吲哚美辛和量取2mmol功能单体MAA于锥形瓶中，然后加入改性硅胶500mg，再加入氯仿30mL，超声溶解，加入一枚磁力搅拌转子，密封瓶口，于65℃下恒温搅拌20h后打开瓶塞，加入交联剂0.672mL EDGMA和引发剂16.8mg AIBN；超声搅拌，通入氮气，密封瓶口，恒温搅拌聚合反应24h，取出聚合物，用甲醇洗涤，用体积比为9:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分别用甲醇和水洗至中性，置于60℃过夜烘干得到吲哚美辛分子印迹聚合物；

2)制备分子印迹-固相萃取柱：

用步骤1)中制备的吲哚美辛分子印迹聚合物100mg装柱，以甲醇活化，得到分子印迹-固相萃取柱；

3)用分子印迹-固相萃取柱检测富集中成药龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A:

对龙胆泻肝丸进行粗提，得到浓缩物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加载于步骤2)制备的分子印迹-固相萃取柱中，用无水乙醇:水1:1淋洗30min，用体积比为4:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脱30min，收集洗脱液并挥干得到含有马兜铃酸A的复合物，以色谱甲醇复溶后进高效液相色谱对复合物检测。

本实施例的有益效果：印迹聚合物电镜图与实施例1中的电镜图很类似，但复合物通过检测后，发现对马兜铃酸A的富集倍数较实施例1低，由此可见，采用本实施例，即以吲哚美辛为伪模板分子合成分子印迹聚合物作为固相萃取填料可用于富龙胆泻肝丸中的微量马兜铃酸A，但富集效果不如实施例1。

实施例5，从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法，包括以下步骤：

1)制备分子印迹聚合物：

1.1)硅胶的活化：

称取硅胶30g，加入到质量浓度10％的稀盐酸250mL中，于110℃加热回流24h；用超纯水抽滤洗涤至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅胶备用；

1.2)硅胶表面改性：

称取活化硅胶30g，加入50mL甲苯、2mL APTES和1mL三乙胺组成的第一混合溶液形成混合体系，混合体系于110℃加热回流24h，用甲醇抽滤洗涤至中性，55℃烘干24h，得到改性硅胶备用；

1.3)在硅胶表面合成分子印迹聚合物：

称取0.5mmol的萘普生和量取2mmol功能单体MAA于锥形瓶中，然后加入改性硅胶500mg，再加入氯仿30mL，超声溶解，加入一枚磁力搅拌转子，密封瓶口，于55℃下恒温搅拌20h后打开瓶塞，加入交联剂0.672mL EDGMA和引发剂16.8mg AIBN；超声搅拌，通入氮气，密封瓶口，恒温搅拌聚合反应24h，取出聚合物，用甲醇洗涤，用体积比为9:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分别用甲醇和水洗至中性，置于60℃过夜烘干得到萘普生分子印迹聚合物；

2)制备分子印迹-固相萃取柱：

用步骤1)中制备的萘普生分子印迹聚合物150mg装柱，以甲醇活化，得到分子印迹-固相萃取柱；

3)用分子印迹-固相萃取柱检测富集中成药龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A:

对龙胆泻肝丸进行粗提，得到浓缩物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加载于步骤2)制备的分子印迹-固相萃取柱中，用无水乙醇:水1:1淋洗30min，用体积比为4:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脱30min，收集洗脱液并挥干得到含有马兜铃酸A的复合物，以色谱甲醇复溶后进高效液相色谱对复合物检测。

本实施例的有益效果：电镜图与实施例1中的电镜图类似，但复合物通过液相检测后，发现对马兜铃酸A的富集倍数较实施例1低，由此可见，采用本实施例，即以萘普生为伪模板分子在球型硅胶表面合成分子印迹聚合物作为固相萃取填料可用于富龙胆泻肝丸中的微量马兜铃酸A，但富集效果不如实施例1。

Claims (2)

1.从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法，其特征在于,包括以下步骤：

1)制备分子印迹聚合物：

1.1)硅胶的活化：

称取硅胶，加入到质量浓度10％的稀盐酸中，其中每40mL稀盐酸中加入4-6g硅胶，于110℃加热回流24h；用超纯水抽滤洗涤至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅胶备用；

1.2)硅胶表面改性：

称取活化硅胶，加入甲苯、APTES和三乙胺组成的第一混合溶液形成混合体系，第一混合溶液每10mL中含有1g活化硅胶，第一混合溶液中甲苯、APTES和三乙胺体积比为(50-100):(2-4):1；混合体系于110℃加热回流24h，用甲醇抽滤洗涤至中性，55℃烘干24h，得到改性硅胶备用；

1.3)在硅胶表面合成分子印迹聚合物：

将伪模板分子和功能单体MAA加入锥形瓶中，然后加入改性硅胶，每毫摩尔功能单体MAA含有改性硅胶250mg，再加入氯仿，每克改性硅胶对应60mL氯仿；超声溶解，加入一枚磁力搅拌转子，密封瓶口，于45℃-65℃下恒温搅拌20h后打开瓶塞，加入交联剂EDGMA和引发剂AIBN，其中每毫摩尔功能单体MAA对应1-2mL交联剂EGDMA和0.04g AIBN；超声搅拌，通入氮气，密封瓶口，恒温搅拌聚合反应24h，取出聚合物，用甲醇洗涤，再用体积比为4:1-9:1甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分别用甲醇和水洗至中性，置于60℃过夜烘干得到分子印迹聚合物；

2)制备分子印迹-固相萃取柱：

用步骤1)中制备的分子印迹聚合物100mg-200mg装柱，以甲醇活化得到分子印迹-固相萃取柱；

3)分子印迹-固相萃取柱检测富集中成药龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A：

对龙胆泻肝丸进行粗提，得到浓缩物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加载于步骤2)制备的分子印迹-固相萃取柱中，用无水乙醇:水3:1-1:1淋洗30min，用体积比为4:1-9:1甲醇和冰醋酸的第三混合溶液洗脱30min，收集洗脱液并挥干得到含有马兜铃酸A的复合物，以色谱甲醇复溶后进高效液相色谱对复合物检测；

所述的伪模板分子为氧氟沙星、萘普生和吲哚美辛；

所述的伪模板分子和功能单体MAA的摩尔比例为1:3-1:5。

2.根据权利要求1所述的从中成药龙胆泻肝丸中富集与检测微量马兜铃酸A的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)制备分子印迹聚合物：

1.1)硅胶的活化：

称取硅胶30g，加入到质量浓度10％的稀盐酸250mL中，于110℃加热回流24h；用超纯水抽滤洗涤至中性后，55℃烘干24h，得到活化硅胶备用；

1.2)硅胶表面改性：

称取活化硅胶30g，加入50mL甲苯、2mL APTES和1mL三乙胺组成的第一混合溶液形成混合体系，混合体系于110℃加热回流24h，用甲醇抽滤洗涤至中性，55℃烘干24h，得到改性硅胶备用；

1.3)在硅胶表面合成分子印迹聚合物：

称取0.5mmol的氧氟沙星和量取2mmol功能单体MAA于锥形瓶中，然后加入改性硅胶500mg，再加入氯仿30mL，超声溶解，加入一枚磁力搅拌转子，密封瓶口，于55℃下恒温搅拌20h后打开瓶塞，加入交联剂0.672mL EDGMA和引发剂16.8mg AIBN；超声搅拌，通入氮气，密封瓶口，恒温搅拌聚合反应24h，取出聚合物，用甲醇洗涤，用体积比为4:1的甲醇和冰醋酸的第二混合溶液于索氏提取器中抽提48h，分别用甲醇和水洗至中性，置于60℃过夜烘干得到氧氟沙星分子印迹聚合物；

2)制备分子印迹-固相萃取柱：

用步骤1)中制备的氧氟沙星分子印迹聚合物200mg装柱，以甲醇活化，得到分子印迹-固相萃取柱；

3)用分子印迹-固相萃取柱检测富集中成药龙胆泻肝丸中的马兜铃酸A:

对龙胆泻肝丸进行粗提，得到浓缩物，然后用甲醇溶解，以0.45μm微孔滤膜过滤，得到甲醇提取液；取甲醇提取液加载于步骤2)制备的分子印迹-固相萃取柱中，用无水乙醇:水1:1淋洗30min，用体积比为4:1甲醇冰醋酸第三混合液洗脱30min，收集洗脱液并挥干得到含有马兜铃酸A的复合物，以色谱甲醇复溶后进高效液相色谱对复合物检测。