CN106755341B - 一种牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法 - Google Patents

一种牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用HRM法进行牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法，包括以下步骤：1)选取牦牛线粒体12S rRNA基因中和黄牛12S rRNA基因的差异位点，根据选取的差异位点，设计标记引物和标记探针；2)提取待测样品的全基因组DNA；3)以步骤2)中得到的待测样品全基因组DNA为模板，加入步骤1)中所述的标记引物和标记探针进行不对称PCR扩增得到PCR扩增产物；4)用HRM法检测步骤3)中得到的PCR扩增产物的熔解温度，绘制熔解曲线，若熔解峰在55～60℃温度范围内，则待测样品为牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范围内，则待测样品为黄牛肉。

Description

一种牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法
技术领域
本发明涉及肉类品质检测领域，尤其涉及一种牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法。
背景技术
肉类掺假现已成为我国食品肉类质量安全控制面临的重要挑战之一。牦牛肉是高原特有的无污染绿色食品，因其营养价值较高，风味独特，相应价格与其它牛肉也存在较大差异，这使得市面上出现大量使用普通黄牛肉假冒牦牛肉及其制品的非法现象。
目前，对于肉制品源性成份的常规鉴别方法主要采用基于PCR的核酸水平的检测，包括DNA探针杂交、RFLP-PCR法(限制性片段长度多态性扩增)、RAPD-PCR法(随机扩增多态性PCR)等方法。但上述几种方法存在操作复杂，灵敏度低，重复性差等问题，是基于核酸水平进行肉制品源性成份快速准确鉴别的障碍。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简单、灵敏度高、重复性好的牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用HRM法进行牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法，包括以下步骤：
1)选取牦牛和黄牛线粒体12S rRNA基因中和黄牛12S rRNA基因的差异位点，根据选取的差异位点，设计标记引物和标记探针，所述标记引物包括上游引物和下游引物；
2)提取待测样品的全基因组DNA；
3)以步骤2)中得到的待测样品全基因组DNA为模板，加入步骤1)中所述的标记引物和标记探针进行不对称PCR扩增得到PCR扩增产物；
4)用HRM法检测步骤3)中得到的PCR扩增产物的熔解温度，绘制熔解曲线，若熔解峰在55～60℃温度范围内，则待测样品为牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范围内，则待测样品为黄牛肉；
所述步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。
优选的，所述差异位点的序列如SeqIDNo.1所示。
优选的，所述上游引物的序列如SeqIDNo.2所示，所述下游引物的序列如SeqIDNo.3所示。
优选的，所述标记探针的长度为19～35bp，Tm值介于59～61℃之间，所述标记探针3’末端用错配碱基封闭。
优选的，所述标记探针的序列如SeqIDNo.4所示。
优选的，所述标记探针的3'端糖环上C6被NH2封闭，阻止PCR过程探针自身的扩增。
优选的，步骤3)中所述的不对称PCR扩增的反应体系包括以下组分：以12μL体系计量，上游引物1μL，下游引物0.2μL，探针1μL，待测样品基因组DNA2μL，2×TaqMix 5μL，ddH2O1.8μL，LC Green 1μL。
优选的，所述的不对称PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，45个循环；75℃延伸5min，4℃反应终止。
优选的，步骤4)中HRM法检测溶解的过程为：将所述PCR扩增产物从35℃升温至96℃，每升温0.025℃收集一次荧光信号，反应完成后降温至35℃。
优选的，所述升温以恒定的速率进行。
本发明的有益效果：
本发明选取牦牛和黄牛线粒体12S rRNA基因中的差异位点，并根据选取的差异位点设计特异性标记引物和标记探针；对待测样品基因组DNA进行不对称PCR后，采用HRM法绘制熔解曲线，根据熔解曲线的熔解峰判断待测样品为牦牛肉或黄牛肉，若熔解峰在55～60℃温度范围内，则待测样品为牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范围内，则待测样品为黄牛肉。本发明提供的方法采用HRM法操作简单快速，只需2个小时就能完成一次检测，灵敏度高，重复性好，能同时准确的检测大量样品。
附图说明
图1为牦牛与黄牛12sRNA上89bp的差异位点序列比对结果；
图2为待测样品为牦牛肉时不对称PCR扩增产物的熔解曲线；
图3为待测样品为黄牛肉时不对称PCR扩增产物的熔解曲线；
图4为待测样品为牦牛肉和黄牛肉混合样品时不对称PCR扩增产物的熔解曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种利用HRM法进行牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法，包括以下步骤：1)选取牦牛线粒体12S rRNA基因中和黄牛12S rRNA基因的差异位点，根据选取的差异位点，设计标记引物和标记探针；2)提取待测样品的全基因组DNA；3)以步骤2)中得到的待测样品全基因组DNA为模板，加入步骤1)中所述的标记引物和标记探针进行不对称PCR扩增得到PCR扩增产物；4)用HRM法检测步骤3)中得到的PCR扩增产物的熔解温度，绘制熔解曲线，若熔解峰在55～60℃温度范围内，则待测样品为牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范围内，则待测样品为黄牛肉。
在本发明中，牦牛线粒体12S rRNA基因中和黄牛12S rRNA基因的差异位点的选取采用本领域常规的差异位点选择方法，优选的本发明所选取的差异位点序列的长度为89bp，所述差异位点的碱基序列如SeqIDNo.1所示。本发明中所述牦牛线粒体12S rRNA基因中的差异位点序列与黄牛线粒体12S rRNA对应基因的差异碱基如附图1所示，所述差异碱基位于序列的第49位，牦牛线粒体12S rRNA基因中的差异位点序列的第49位为胞嘧啶C，而黄牛线粒体12S rRNA基因中的差异位点序列的第49位为胸腺嘧啶T。
本发明在获得上述差异位点序列后，根据所述差异位点序列设计引物，在本发明中引物的设计优选的利用引物设计软件或在线网站设计程序进行，所述引物长度优选的为15～25bp，所述引物PCR产物的片段大小优选的在60～110bp以内；本发明在设计得到所述的引物后，优选的通过Primer Premier 5.0检查引物质量，所述引物序列在PCR扩增过程中不能有严重错配、引物二聚体和发夹结构。在本发明中所述的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列优选如SeqIDNo.2所示，所述下游引物的序列优选如SeqIDNo.3所示。
本发明优选的根据上述差异位点，设计标记探针，所述标记探针的长度优选的为19～35bp，对应差异位点序列的差异碱基优选的位于标记探针中心，所述标记探针的Tm值优选的为59～61℃，所述标记探针的3’末端优选的用两个错配碱基进行封闭。在本发明中所述标记探针的序列如SeqIDNo.4所示；优选的，所述标记探针的3'端糖环上C6被NH2封闭，阻止PCR过程探针自身的扩增。在本发明中，所述的引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。
在本发明中，所述待测样品为待检测的牦牛肉或黄牛肉，所述待测样品的全基因组DNA的提取方法采用本领域常规的全基因组DNA的提取方法即可，无其他特殊要求。具体的在本发明中，用于提取全基因组DNA的待测样品的质量优选的为150mg～250mg，更优选的为180～220mg，最优选的为200mg。
本发明在获得待测样品全基因组DNA后，以待测样品全基因组DNA为模板，加入上述的标记引物和标记探针进行不对称PCR扩增得到PCR扩增产物。所述不对称PCR扩增的反应体系的体积优选为10～15μL，更优选的为12μL；所述反应体系以12μL体积计量，优选的包括以下成分：上游引物1μL，下游引物0.2μL，探针1μL，待测样品全基因组DNA2μL，2×TaqMix5μL，ddH2O 1.8μL，LC Green 1μL。
本发明中所述不对称PCR扩增的扩增程序优选的为包括以下步骤：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，45个循环；75℃延伸5min，4℃反应终止。
本发明在得到不对称PCR扩增产物后，用HRM法检测扩增产物的熔解温度。在本发明中，所述HRM法检测熔解温度优选的利用溶解度曲线分析仪进行，所述熔解温度的检测优选为：将PCR扩增产物优选的从35℃升温至96℃，每升温0.025℃收集一次荧光信号，反应完成后降温至35℃；在本发明中，所述的升温以恒定的速率进行。
检测后，本发明根据检测结果绘制熔解曲线，根据熔解温度曲线判断待测样品的牦牛肉或黄牛肉，若熔解峰在55～60℃温度范围内，则待测样品为牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范围内，则待测样品为黄牛肉。溶解曲线横坐标为温度(单位：℃)，纵坐标为荧光值(单位：-d/dT)。
在本发明中，对于溶解度曲线的分析优选的利用Light Scanner 96仪器的结果分析，所述分析的步骤采用本领域常规的溶解度曲线分析操作即可，其他特殊要求。具体的在本发明中所述溶解度曲线分析包括以下步骤：选择要分析的数据，对曲线进行规一化，调节Shift Level，最后选择计算数据后即可查看溶解度曲线报告。如果选用非标记封闭探针法时选用“非标记封闭探针”程序进行分析，选择扫描，根据各引物的实际情况进行标准化处理。
本发明在获得溶解度曲线后，根据熔解温度曲线判断待测样品的牦牛肉或黄牛肉，若熔解曲线成明显的双熔解峰则待测样品为牦牛肉，若熔解曲线成明显的单一熔解峰则待测样品为黄牛肉。
下面结合实施例对本发明提供的一种牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以牦牛线粒体12S rRNA基因中下述89bp序列为差异位点设计引物和探针；差异位点序列如下：
Figure BDA0001167349060000051
标记引物序列如下：
上游引物:5’-TACCGCCATCTTCAGCAAACC-3’
下游引物:5’-TTCATAGGTTACACCTTGACCTAAC-3’
标记探针序列如下
T:5’-GTATCATGATTGTGCTTACTTTTTTTCC-3’
来源于甘南牦牛的待测样品17份，取每份待测样品200mg，提取待测样品的全基因组DNA，以样品全基因组DNA为模板，进行不对称PCR扩增：扩增体系如下：上游引物1μL，下游引物0.2μL，探针1μL，待测样品基因组DNA 2μL，2×TaqMix 5μL，ddH2O 1.8μL，LC Green 1μL。扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，45个循环；75℃延伸5min，4℃反应终止。
用HRM法检测扩增产物的熔解温度，绘制熔解曲线，所述熔解曲线如图2所示，根据图2所示，熔解峰在55～60℃温度范围内，由此判断待测样品为牦牛肉样品。
实施例2
来源于平凉红牛的待测样品23份，取每份待测样品200mg，提取待测样品的全基因组DNA，其余方法步骤与实施例1相同。
所述待测样品的PCR扩增产物的溶解度曲线如图3所示，根据图3所示，熔解峰在65～70℃温度范围内，由此判断待测样品为黄牛肉样品。
实施例3
来源于玉树牦牛和河西肉牛的混合待测样品21份，取每份待测样品200mg，提取待测样品的全基因组DNA，其余方法步骤与实施例1相同。
所述待测样品的PCR扩增产物的溶解度曲线如图4所示，根据图4所示，在55～60温度范围内，和65～70温度范围内均有熔解峰，由此判断待测样品为牦牛肉与黄牛肉的混合样品。
由以上实施例可知，本发明所述的方法采用HRM法操作简单快速，只需2个小时就能完成一次检测，灵敏度高，重复性好，能同时准确的检测大量样品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure BDA0001167349060000071
Figure BDA0001167349060000081
SEQUENCE LISTING
<110> 兰州凯博药业股份有限公司
<120> 一种牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 89
<212> DNA
<213> Yak Bos grunniens
<400> 1
taccgccatc ttcagcaaac cctaaaaagg aaaaaaagta agcacaatca tgatacataa 60
aaacgttagg tcaaggtgta acctatgaa 89
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taccgccatc ttcagcaaac c 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcataggtt acaccttgac ctaac 25
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtatcatgat tgtgcttact ttttttcc 28

Claims (6)

1.一种利用HRM法进行牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法，包括以下步骤：
1)根据牦牛线粒体12S rRNA基因和黄牛12S rRNA基因的差异位点，设计标记引物和标记探针，所述标记引物包括上游引物和下游引物；
2)提取待测样品的全基因组DNA；
3)以所述步骤2)得到的待测样品全基因组DNA为模板，与所述步骤1)得到标记引物和标记探针进行不对称PCR扩增，得到PCR扩增产物；
4)用HRM法检测所述步骤3)得到的PCR扩增产物的熔解温度，绘制熔解曲线，若熔解峰在55～60℃温度范围内，则待测样品为牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范围内，则待测样品为黄牛肉；
所述步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定；
所述差异位点的序列如SeqIDNo.1所示；
所述上游引物的序列如SeqIDNo.2所示，所述下游引物的序列如SeqIDNo.3所示；
所述标记探针3'末端用错配碱基封闭；
所述标记探针的序列如SeqIDNo.4所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记探针的3'端糖环上C6被NH2封闭，阻止PCR过程探针自身的扩增。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的不对称PCR扩增的反应体系以12μL体系计量，包括以下组分：上游引物1μL，下游引物0.2μL，标记探针1μL，待测样品全基因组DNA2μL，2×TaqMix 5μL，ddH2O1.8μL，LC Green 1μL。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的不对称PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，45个循环；75℃延伸5min，4℃反应终止。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中HRM法检测溶解的过程为：将所述PCR扩增产物从35℃升温至96℃，每升温0.025℃收集一次荧光信号，反应完成后降温至35℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述升温以恒定的速率0.1℃/s进行。
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