CN106755306A - T3dna连接酶和t4rna连接酶2在检测n6甲基腺嘌呤中的应用 - Google Patents

T3dna连接酶和t4rna连接酶2在检测n6甲基腺嘌呤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种连接酶在检测N6甲基腺嘌呤中的应用，其中所述的连接酶是T3 DNA连接酶或T4 RNA连接酶2。本发明首次发现与腺嘌呤(A)相比，N6甲基腺嘌呤(m6A)可以抑制T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2的连接活性，基于该特性，以RNA(含的A的RNA和含有m6A的RNA)为模板，建立了基于连接‑聚合酶链式反应定量测定m6A百分比含量的方法。本发明操作简单、灵敏度高、特异性好，能够用于信使RNA、长非编码RNA、核糖体RNA、转运RNA和小RNA等RNA中m6A百分比含量测定。

Description

T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2在检测N6甲基腺嘌呤中的应用
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及两种对N6甲基腺嘌呤(m6A)敏感的连接酶，以及基于该连接酶建立的连接-聚合酶链式反应定量检测RNA中m6A百分比含量的方法。
背景技术
随着抗体-高通量测序方法的发展，科学家揭示了m6A在生物体内重要的生物功能，然而m6A的作用机制还不是很清楚。为了更好的研究m6A的作用机制，建立简便、快速、灵敏、具有单碱基分辨率的特定位点m6A分析检测方法具有重要的意义。
由于m6A和腺嘌呤(A)具有相似的化学结构，精确定位m6A的位点具有挑战性。目前存在的m6A的分析方法大部分是高通量测序法，这些方法大部分只能给出m6A在RNA上的大概位置，而不能给出m6A的精确位点。特异位点裂解-同位素标记-连接辅助的薄层色谱法(SCARLET)的发现，使得特定位点的m6A的定位分析变为现实，然而此方法不仅过程复杂，耗时长，还用到了同位素，使得它的应用受到了限制。2007年，科学家发现相比A，m6A对G有一定的识别能力，如果m6A的识别序列对应的碱基为G时可以在一定程度上抑制T4 DNA连接酶的连接活性。然而此方法的灵敏度较低，它并没有被广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2提供一种在RNA上m6A百分比含量的定量分析中的新应用。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、根据含有待测位点的RNA序列设计合成左探针、右探针，其中左探针是DNA探针，其从5′端到3′端依次为检测识别区、PCR引物区，且其序列的5′端修饰磷酸基团，右探针是DNA探针，其从5′端到3′端依次为PCR引物区、检测识别区，所述左探针和右探针的检测识别区是与含有待测位点的RNA序列互补的8～40个碱基序列。
2、将步骤1左探针、右探针的检测识别区与含有待测位点的RNA序列杂交，然后加入连接酶进行连接反应。
3、以步骤2的连接产物为模板进行聚合酶链式反应，并加入SUPER Green I荧光染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线计算出待测位点A的含量。
4、在待测位点附近选择一个不含m6A的位点作为参比位点，根据含有参比位点的RNA序列按照步骤1设计合成左探针、右探针。
5、将步骤4左探针、右探针的检测识别区与含有参比位点的RNA杂交，然后通过连接酶将左探针和右探针连接起来。
6、以步骤5的连接产物为模板进行聚合酶链式反应，并加入SUPER Green I荧光染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线计算出参比位点A的含量。
7、根据步骤6计算出的参比位点A的含量减去步骤3计算出的待测位点A的含量，得到待测位点m6A的含量，待测位点m6A的含量除以待测位点A和m6A的总和，就得到m6A的百分比含量。
上述步骤1和4中，优选右探针是3′端修饰两个RNA碱基的DNA探针。
上述步骤1和4中，进一步优选左探针和右探针的检测识别区是与含有待测位点的RNA序列互补的10～20个碱基序列。
本发明首次发现T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2对m6A敏感，与A相比，m6A可以抑制T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2的连接活性，基于该特性，以RNA(含的A的RNA和含有m6A的RNA)为模板，建立了基于连接-聚合酶链式反应定量测定m6A百分比含量的方法。该方法首先确定RNA上的待测位点(待测位点是腺嘌呤，可能含有部分N6甲基腺嘌呤，当待测位点是m6A时，连接酶T3 DNA连接酶或T4 RNA连接酶2的连接活性被抑制，左探针和右探针不会被连接；当待测位点是A时，连接酶会将左探针和右探针连接起来)，用相应的标准曲线定量该待测位点A的含量，其次在该RNA的待测位点附近选择一个不含m6A的A位点作为参比位点，用相应的标准曲线定量该参比位点A的含量，然后用参比为点A的含量减去待测位点A的含量得到待测位点m6A的含量，用待测位点m6A的含量除以待测位点A和m6A的总和，即可得到该待测位点m6A的百分比含量。
本发明操作简单、灵敏度高、特异性好，能够用于信使RNA(mRNA)，长非编码RNA(lncRNA)，核糖体RNA(rRNA)，转运RNA(tRNA)和小RNA(microRNA)等RNA中的m6A的百分比含量测定，为m6A生物功能的研究和其在癌症中作用的研究提供了新的方法。
附图说明
图1是实施例1中基于连接-聚合酶链式反应定量检测MALAT1 2577位点m6A百分比含量的原理示意图。
图2是实施例1中不同浓度的RNA2577-A及85ng HeLa poly A+RNA的MALAT1 2577位点A的荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。
图3是实施例1中CT值随着RNA2577-A浓度变化的标准曲线图。
图4是实施例1中不同浓度RNA2488-A及85ng HeLa poly A+RNA的MALAT1 2577位点A的荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。
图5是实施例1中CT值随着RNA2488-A浓度变化的标准曲线图。
图6是实施例2中不同浓度RNA2577-A及106ng HCT116poly A+RNA的MALAT1 2577位点A荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。
图7是实施例2中CT值随着RNA2577-A浓度变化的标准曲线图。
图8是实施例2中不同浓度RNA2488-A及106ng HCT116poly A+RNA的MALAT1 2488位点A荧光强度随着循环次数变化的荧光曲线图。
图9是实施例2中CT值随着RNA2488-A浓度变化的标准曲线图。
图10是用连接酶区分A和m6A的原理示意图。
图11是相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m6A荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。
图12是基于相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物的凝胶电泳图。
图13是相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m6A荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。
图14是基于相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物的凝胶电泳图。
图15是相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m6A荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。
图16是基于相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物的凝胶电泳图。
图17是相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m6A荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。
图18是基于相同浓度的RNA2577-A和RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
T3 DNA连接酶在检测HeLa细胞中长非编码RNA(lncRNA，MALAT1)2577位点m6A含量的应用，检测原理如图1所示，具体检测方法如下：
1、根据含有MALAT1的2577位点的RNA序列(RNA2577-A)5'-CUUAAUGUUUUUGCAUUGGACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC-3'(画下划线的碱基是2577位点，在HeLa细胞中MALAT1的2577位点一部分是A，一部分为m6A)设计合成左探针(LigaseL2)和右探针(Ligase R2)，其中Ligase L2的碱基序列为5'-po4 CCAATGCAAAAA -3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)，Ligase R2的碱基序列为5'- CTTAACTCAAArGrU-3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)。
2、在200μL离心管中加入1.0μL水、1.0μL 200 nM Ligase L2水溶液和1.0μL200nM Ligase R2水溶液、1.0μL 5×的T3 DNA连接酶反应缓冲溶液(330mM Tris-HCl、50mMMgCl2、5 mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸、37.5％聚乙二醇PEG6000，pH＝7.6，25℃)、1.0μL不同浓度RNA2577-A水溶液或1.0μL 85 ng/μL HeLa的poly A+RNA水溶液(同时作空白对比实验，空白是加入1.0μL水来代替RNA2577-A)，混合均匀，作为溶液A。在200μL离心管中加入3.9μL水、1.0μL 5×的T3 DNA连接酶反应缓冲溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl2、5mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝7.6，25℃)、0.1μL 9unit/μL T3 DNA连接酶，混合均匀，作为溶液B。将溶液A放入PCR仪中，85℃加热3min，使RNA2577-A、Ligase L2和Ligase R2变性，再降温至35℃孵育10min，使Ligase L2和Ligase R2与RNA2577-A充分杂交，然后加入溶液B，35℃孵育15min进行连接反应，反应结束后立即放在冰上。
3、取步骤2中2.0μL连接反应产物加入到8.0μL聚合酶链式反应(PCR)混合溶液中，其中PCR反应混合溶液由5.2μL灭菌水、0.2μL 2.5unit/μL JumpStartTM Taq DNA聚合酶、1.0μL 10×JumpStartTM Taq DNA聚合酶缓冲溶液(100mMTris-HCl，pH＝8.3，500mM KCl，15mM MgCl2，0.01％(w/v)明胶)、1.0μL 2.5mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)水溶液、0.2μL 10μM正向引物(5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3'，由宝生物工程(大连)有限公司提供)水溶液、0.2μL 10μM反向引物(5'-ATCACCGACTGCCCATAGAG-3'，由宝生物工程(大连)有限公司提供)水溶液、0.2μL SUPER Green I(20×)荧光染料组成，混合均匀后立刻放到Step One实时定量PCR系统中(Applied Biosystems，美国)，在94℃下加热2min，然后进行45个热循环，每个热循环94℃20s、60℃30s；同步监测荧光信号，间隔1个循环采集一次实时荧光强度信号，结果如图2所示。根据RNA2577-A的实时荧光曲线，绘制检测RNA2577-A的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)与RNA2577-A浓度对数值的线性关系曲线，结果如图3所示，并由此曲线公式计算出HeLa细胞中MALAT1的2577位点A的量。
从图2可以看出，随着RNA2577-A浓度的增加PCR反应速度逐渐加快，也就是说随着RNA2577-A浓度的增加，基于连接反应产生的PCR聚合产物越多，且不同浓度梯度之间可以相互区分，同时，从图3可以看出，CT值与RNA2577-A浓度的对数值呈现良好的线性关系，线性相关方程式为CT＝-8.65-3.07lgCRNA2577-A，相关系数R2＝0.998。据此线性相关方程可以计算出85ng HeLa poly A+RNA中MALAT1的2577位点A的量为0.721amol。
4、在MALAT1的2577位点附近选择一个不含m6A的2488A位点作为参比位点，根据含有MALAT1的2488位点的RNA序列(RNA2488-A)5'-UAGAAGAAUUUGGAAGGCCUUAAAUAUAGUAGCUUAGUUUGAAAAAUGUGAAGG-3'(画下划线的碱基是2488位点，此碱基只能为A)设计合成左探针(Ligase L1)和右探针(Ligase R1)。Ligase L1的碱基序列为5'-po4 ATATTTAAGG -3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)；Ligase R1的碱基序列为5'- AACTAAGCTArCrU-3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)。
5、在200μL离心管中加入1.0μL水、1.0μL 200nM Ligase L1水溶液和1.0μL 200nMLigase R1水溶液、1μL5×的T3 DNA连接酶反应缓冲溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl2、5mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸、37.5％聚乙二醇PEG6000，pH＝7.6，25℃)、1.0μL不同浓度RNA2488-A水溶液或1.0μL 85ng/uL HeLa的poly A+RNA水溶液(同时作空白对比实验，空白是加入1.0μL水来代替RNA2488-A)，混合均匀，作为溶液A′。在200μL离心管中加入3.9μL水、1μL 5×的T3 DNA连接酶反应缓冲溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl2、5mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝7.6，25℃)、0.1μL 9unit/μL T3 DNA连接酶，混合均匀，作为溶液B′。将溶液A′放入PCR仪中，85℃加热3min，使RNA2488-A、Ligase L1和Ligase R1变性，再降温至35℃孵育10min，使Ligase L1和Ligase R1与RNA2488-A充分杂交，然后加入溶液B′，35℃孵育15min进行连接反应，反应结束后立即放在冰上。
6、取步骤5中2.0μL连接反应产物加入到8.0μL PCR反应混合溶液中进行PCR反应，其中PCR反应混合溶液与步骤3中相同，混合均匀后立刻放到Step One实时定量PCR系统中(Applied Biosystems，美国)，在94℃下加热2min，然后进行45个热循环，每个热循环94℃20s、60℃30s；同步监测荧光信号，间隔1个循环采集一次实时荧光强度信号，结果如图4所示。根据RNA2488-A的实时荧光曲线，绘制检测RNA2488-A的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)与RNA2488-A浓度对数值的线性关系曲线，结果如图5所示，并由此曲线公式计算出HeLa细胞中MALAT1的2488位点A的量。
从图4中可以看出，随着RNA2488-A浓度的增加PCR反应速度逐渐加快，也就是说随着RNA2488-A浓度的增加，基于连接反应产生的PCR聚合产物越多，且不同浓度梯度之间可以相互区分，同时，从图5中可以看出，CT值与RNA2488-A的浓度的对数值呈现良好的线性关系，线性相关方程式为CT＝-6.95-3.22lgCRNA2488-A，相关系数R2＝0.997。据此线性相关方程可以计算出85ng HeLa poly A+RNA中MALAT1的2488位点含A的量为3.79amol。
7、根据步骤6计算出的HeLa poly A+RNA中MALAT1的2488位点A的含量(3.79amol)减去步骤3计算出的HeLa poly A+RNA中MALAT1的2577位点A的含量(0.721amol)，得到2577位点m6A的含量为3.07amol，2577位点m6A的含量除以2577位点A和m6A的总和，得到HeLapoly A+RNA中MALAT1的m6A的百分比含量为80.9％。
实施例2
T3 DNA连接酶在检测HCT116细胞中长非编码RNA(lncRNA，MALAT1)2577位点m6A含量的应用，具体检测方法如下：
利用实施例1中针对RNA2577-A设计的探针Ligase L2和Ligase R2检测HCT116细胞中长非编码RNA(lncRNA，MALAT1)2577位点A含量，检测方法是用106ng/μL HCT116的polyA+RNA替代HeLa的poly A+RNA，其他实验步骤与实施例1相同，并分别测量其实时荧光曲线，检测结果如图6所示。根据RNA2577-A的实时荧光曲线，绘制检测RNA2577-A的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)与RNA2577-A浓度对数值的线性关系曲线，结果如图7所示，并由此曲线公式计算出HCT116细胞中MALAT1的2577位点腺嘌呤(A)的量。
从图6中可以看出，随着RNA2577-A浓度的增加PCR反应速度逐渐加快，也就是说随着RNA2577-A浓度的增加，基于连接反应产生的PCR聚合产物越多，且不同浓度梯度之间可以相互区分，同时，从图7中可以看出，CT值与RNA2577-A的浓度的对数值呈现良好的线性关系，线性相关方程式为CT＝-9.22-3.07lgCRNA2577-A，相关系数R2＝0.998。据此线性相关方程可以计算出106ng/μL HCT116poly A+RNA中MALAT1的2577位点含A的量为0.605amol。
利用实施例1中针对RNA2488-A设计的探针Ligase L1和Ligase R1检测HCT116细胞中长非编码RNA(lncRNA，MALAT1)2488位点A含量，检测方法是用106ng/μL HCT116的polyA+RNA替代HeLa的poly A+RNA，其他实验步骤与实施例1相同，并分别测量其实时荧光曲线，结果如图8所示。根据RNA2488-A的实时荧光曲线，绘制检测RNA2488-A的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)与RNA2488-A浓度对数值的线性关系曲线，结果如图9所示，并由此曲线公式计算出HCT116细胞中MALAT1的2488位点A的量。
从图8中可以看出，随着RNA2488-A浓度的增加PCR反应速度逐渐加快，也就是说随着RNA2488-A浓度的增加，基于连接反应产生的PCR聚合产物越多，且不同浓度梯度之间可以相互区分，同时，从图9中可以看出，CT值与RNA2488-A的浓度的对数值呈现良好的线性关系，线性相关方程式为CT＝-7.42-3.13lgCRNA2488-A，相关系数R2＝0.997。据此线性相关方程可以计算出106ng HCT116poly A+RNA中MALAT1的2488位点含A的量为1.59amol。
根据计算出的2488位点A的含量(1.59 amol)减去计算出的2577位点A的含量(0.605amol)，得到2577位点m6A的含量为0.985amol，2577位点m6A的含量除以2577位点A和m6A的总和，得到HCT116细胞中MALAT1的2577位点m6A的百分比含量为61.9％。
为了证明T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2能用于检测特定位点m6A的含量，发明人进行了大量的实验室研究试验，试验原理如图10所示，具体试验情况如下：
1、3'端修饰两个RNA碱基的DNA探针作为右探针时，用T3 DNA连接酶区分m6A和A
(1)根据含有MALAT1的2577位点的RNA序列5'-CUUAAUGUUUUUGCAUUGGACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC-3'(RNA2577-A，画下划线的碱基是2577位点)和5'-CUUAAUGUUUUUGCAUUGGm6ACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC-3'(RNA2577-m6A，画下划线的碱基是2577位点)设计合成左探针(Ligase L2)和右探针(Ligase R2)。Ligase L2的碱基序列为5'-po4 CCAATGCAAAAA -3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)；Ligase R2的序列为5'-C CTTAACTCAAArGrU-3'(画下划线的部分为检测识别区、斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程(大连)有限公司提供)。
(2)在200μL离心管中加入1.0μL水、1.0μL 200nM Ligase L2水溶液和1.0μL200nM Ligase R2水溶液、1.0μL 5×的T3 DNA连接酶反应缓冲溶液(330mM Tris-HCl、50mMMgCl2、5mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，37.5％聚乙二醇PEG6000，pH＝7.6，25℃)、1.0μL 200pM RNA2577-A水溶液或1.0μL 200pM RNA2577-m6A水溶液(同时作空白对比实验，空白是加入水来代替RNA2577-A水溶液或RNA2577-m6A水溶液)，混合均匀，作为溶液A。在200μL离心管中加入3.9μL水、1.0μL 5×的T3 DNA连接酶反应缓冲溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl2、5mM二硫苏糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝7.6，25℃)、0.1μL 9unit/μLT3 DNA连接酶，混合均匀，作为溶液B。将溶液A放入PCR仪中，85℃加热3min，使RNA2577-A或RNA2577-m6A与Ligase L2、Ligase R2变性，再降温至35℃孵育10min，使Ligase L2和Ligase R2与RNA2577-A或RNA2577-m6A充分杂交，再向溶液A中加入溶液B，35℃孵育15min进行连接反应，反应结束后立即放在冰上。
(3)取步骤(2)中2.0μL连接反应产物加入到8.0μL聚合酶链式反应(PCR)混合溶液中进行PCR反应，其中PCR反应混合溶液由5.2μL灭菌水、0.2μL 2.5unit/μL JumpStartTMTaq DNA聚合酶、1.0μL 10×JumpStartTM Taq DNA聚合酶缓冲溶液(100mM Tris-HCl，pH＝8.3，500mM KCl，15mM MgCl2，0.01％(w/v)明胶)、1.0μL 2.5mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)水溶液、0.2μL 10μM正向引物(5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3'，由宝生物工程(大连)有限公司提供)水溶液、0.2μL 10μM反向引物(5'-ATCACCGACTGCCCATAGAG-3'，由宝生物工程(大连)有限公司提供)水溶液、0.2μL SUPER Green I(20×)荧光染料组成，混合均匀后立刻放到Step One实时定量PCR系统中(Applied Biosystems，美国)，94℃下加热2min，然后进行45个热循环，每个热循环94℃20s、60℃30s；同步监测荧光信号，间隔1个循环采集一次实时荧光强度信号，结果如图11所示。当RNA2577-A的荧光信号达到4万左右时，停止PCR扩增，把PCR的产物进行凝胶电泳分析，结果如图12所示。
从图11中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m6A的浓度相同时，RNA2577-A和RNA2577-m6A的CT相差5.0个循环数，也就说明了基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物要比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少。从图12中可以看出，基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少，假设基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物的量为100％，基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物的量大约为2.56％。这证明T3 DNA连接酶对m6A敏感，m6A可以基本完全抑制T3 DNA连接酶连接以RNA为模板的3'端修饰两个RNA碱基的DNA探针。
2、DNA探针作为右探针时，用T3 DNA连接酶区分m6A和A
将上述试验1中的Ligase R2替换为Ligase R2-D(碱基序列为5'- CTTAACTCAAAGT-3')，200pM RNA2577-A水溶液替换为20nMRNA2577-A水溶液；200pM RNA2577-m6A水溶液替换为20nM RNA2577-m6A水溶液。用T3 DNA连接酶区分RNA2577-A和RNA2577-m6A，实时荧光强度信号结果如图13所示，把PCR聚合产物进行凝胶电泳分析，结果如图14所示。
从图13中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m6A的浓度相同时，RNA2577-A和RNA2577-m6A的CT相差3.6个循环数，也就说明了基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物要比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少。从图14中可以看出，基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少，假设基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物的量为100％，基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物的量大约为24.5％。这证明当右探针完全为DNA时，T3 DNA连接酶对m6A具有一定的敏感，m6A可以大部分抑制T3 DNA连接酶连接以RNA为模板的DNA探针。
3、3'端修饰两个RNA碱基的DNA探针作为右探针时，用T4 RNA连接酶2区分m6A和A
将上述试验1中的T3 DNA连接酶替换为T4 RNA连接酶2，5×的T3 DNA连接酶缓冲溶液替换为5×的T4 RNA连接酶2缓冲溶液(250mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5mM二硫苏糖醇、2mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝75，25℃)，连接反应条件为37℃孵育30min，200pM RNA2577-A水溶液替换为20nM RNA2577-A水溶液；200pM RNA2577-m6A水溶液替换为20nM RNA2577-m6A水溶液。其他步骤与试验1相同，实时荧光强度信号结果如图15所示，把PCR聚合产物进行凝胶电泳分析，结果如图16所示。
从图15中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m6A的浓度相同时，RNA2577-A和RNA2577-m6A的CT相差2.4个循环数，也就说明了基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物要比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少。从图16中可以看出，基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少，假设基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物的量为100％，基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物的量大约为30.5％。这证明当右探针为Ligase R2时，T4 RNA连接酶2对m6A具有一定的敏感，m6A可以大部分抑制T4 RNA连接酶2连接以RNA为模板的3'修饰两个RNA碱基的DNA探针。
4、DNA探针作为右探针时，用T4 RNA连接酶2区分m6A和A
将上述试验3中的Ligase R2替换为Ligase R2-D(碱基序列为5'- CTTAACTCAAAGT-3')，用T4 RNA连接酶2区分RNA2577-A和RNA2577-m6A，实时荧光强度信号结果如图17所示，把PCR聚合产物进行凝胶电泳分析，结果如图18所示。
从图17中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m6A的浓度相同时，RNA2577-A和RNA2577-m6A的CT相差2.3个循环数，也就说明了基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物要比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少。从图18中可以看出，基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物比基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物少，假设基于RNA2577-A产生的PCR聚合产物的量为100％，基于RNA2577-m6A产生的PCR聚合产物的量大约为32.1％。这证明当右探针为Ligase R2-D时，T4 RNA连接酶2对m6A具有一定的敏感，m6A可以大部分抑制T4 RNA连接酶2连接以RNA为模板的DNA探针。
核 苷 酸 或 氨 基 酸 序 列 表
[0001]
序 列 表
<110> 陕西师范大学
<120> T3 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2在检测N6甲基腺嘌呤中的应用
<160> 12
<210> 1
<211> 69
<212> RNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<223> RNA 2577-A序列
<400> 1
CUUAAUGUUUUUGCAUUGGACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC 69
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<223> 根据待测RNA 2577-A序列设计的探针Ligase L2，以用作连接反应构建DNA模板
<400> 2
CCAATGCAAAAACTCTATGGGCAGTCGGTGAT 32
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<223> 根据待测RNA 2577-A序列设计的探针Ligase R2，以用作连接反应构建DNA模板
<400> 3
CCATCTCATCCCTGCGTGTCCTTAACTCAAArGrU 33
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<223> FP，作为聚合酶链式反应（PCR）扩增反应正向引物
<400> 4
CCATCTCATCCCTGCGTGTC 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<223> RP，作为聚合酶链式反应（PCR）扩增反应反向引物
<400> 5
ATCACCGACTGCCCATAGAG 20
<210> 6
<211> 54
<212> RNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<223>RNA 2488-A序列
<400> 6
UAGAAGAAUUUGGAAGGCCUUAAAUAUAGUAGCUUAGUUUGAAAAAUGUGAAGG 54
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<223> 根据待测RNA 2488-A序列设计的探针Ligase L1，以用作连接反应构建DNA模板
<400> 7
ATATTTAAGGCTCTATGGGCAGTCGGTGAT 30
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<223> 根据待测RNA 2488-A序列设计的探针Ligase R1，以用作连接反应构建DNA模板
<400> 8
CCATCTCATCCCTGCGTGTCAACTAAGCTArCrU 32
<210> 9
<211> 69
<212> RNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<223> RNA 2577-m6A序列
<400> 9
CUUAAUGUUUUUGCAUUGGm6ACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC 69
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<223> 根据待测RNA 2577-A序列设计的探针Ligase R2-D，以用作连接反应构建DNA模板
<400> 10
CCATCTCATCCCTGCGTGTCCTTAACTCAAAGT 33

Claims (4)

1.连接酶在检测N6甲基腺嘌呤中的应用，所述的连接酶是T3DNA连接酶或T4RNA连接酶2。
2.根据权利要求1所述的连接酶在检测N6甲基腺嘌呤中的应用，其特征在于：
(1)根据含有待测位点的RNA序列设计合成左探针、右探针，其中左探针是DNA探针，其从5′端到3′端依次为检测识别区、PCR引物区，且其序列的5′端修饰磷酸基团，右探针是DNA探针，其从5′端到3′端依次为PCR引物区、检测识别区，所述左探针和右探针的检测识别区是与含有待测位点的RNA序列互补的8～40个碱基序列；
(2)将步骤(1)左探针、右探针的检测识别区与含有待测位点的RNA序列杂交，然后加入连接酶进行连接反应；
(3)以步骤(2)的连接产物为模板进行聚合酶链式反应，并加入SUPER GreenI荧光染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线计算出待测位点腺嘌呤的含量；
(4)在待测位点附近选择一个不含N6甲基腺嘌呤的腺嘌呤位点作为参比位点，根据含有参比位点的RNA序列按照步骤(1)设计合成左探针、右探针；
(5)将步骤(4)左探针、右探针的检测识别区与含有参比位点的RNA杂交，然后通过连接酶将左探针和右探针连接起来；
(6)以步骤(5)的连接产物为模板进行聚合酶链式反应，并加入SUPER GreenI荧光染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线计算出参比位点腺嘌呤的含量；
(7)根据步骤(6)计算出的参比位点腺嘌呤的含量减去步骤(3)计算出的待测位点腺嘌呤的含量，得到待测位点N6甲基腺嘌呤的含量，待测位点N6甲基腺嘌呤的含量除以待测位点腺嘌呤和N6甲基腺嘌呤的总和，就得到N6甲基腺嘌呤的百分比含量。
3.根据权利要求2所述的连接酶在检测N6甲基腺嘌呤中的应用，其特征在于：在步骤(1)和(4)中，所述的右探针是3′端修饰两个RNA碱基的DNA探针。
4.根据权利要求2所述的连接酶在检测N6甲基腺嘌呤中的应用，其特征在于：在步骤(1)和(4)中，所述左探针和右探针的检测识别区是与含有待测位点的RNA序列互补的10～20个碱基序列。
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