CN106754757A - 高滴度双报告基因的可视化模拟病毒及其应用 - Google Patents

高滴度双报告基因的可视化模拟病毒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106754757A
CN106754757A CN201611204375.5A CN201611204375A CN106754757A CN 106754757 A CN106754757 A CN 106754757A CN 201611204375 A CN201611204375 A CN 201611204375A CN 106754757 A CN106754757 A CN 106754757A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gluc
plasmid
virus
reporter genes
egfp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611204375.5A
Other languages
English (en)
Inventor
谭文杰
邓瑶
黄保英
管洁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Original Assignee
National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention filed Critical National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority to CN201611204375.5A priority Critical patent/CN106754757A/zh
Publication of CN106754757A publication Critical patent/CN106754757A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了高滴度双报告基因的可视化模拟病毒及其应用。本发明首先构建了一个可以同时表达绿色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因的慢病毒转移质粒pCS‑gluc‑2A‑eGFP；然后利用慢病毒三质粒包装系统原理，将转移质粒pCS‑gluc‑2A‑eGFP、包装质粒pCMV HR’ΔR8.2和包膜质粒pCMV‑VSVG共转染包装细胞293FT，获得携带GFP和Gluc双报告基因的模拟病毒。该研究技术将GFP和Gluc两种报告基因优势互补，既能实现荧光显微镜下的感染细胞的体外可视化分析，又能实现对感染细胞上清进行荧光强度的实时监测和定量分析，在模拟病毒的可视化追踪和定量分析等方面有广泛的应用前景。

Description

高滴度双报告基因的可视化模拟病毒及其应用
技术领域 本发明属于基于生物技术领域，尤其涉及高滴度双报告基因可视化模拟病毒及其应用，具体涉及高滴度的可以同时表达分泌型荧光素酶和绿色荧光蛋白两种报告基因的可视化模拟病毒的制备及其应用。
背景技术 假病毒颗粒(Pseudovirus particle)也称模拟病毒，对靶细胞只有一次感染能力，由于不能进行病毒复制而无法产生新的病毒颗粒，具有很高的安全性；此外，由于假病毒表面表达病毒包膜蛋白可以模拟病毒进入感染细胞，携带的报告基因还能实现可视化高通量快速检测的特点，在高致病性病原微生物的分子生物学研究、疫苗和药物效果评价研究中具有重要意义。
目前假病毒包装系统主要包括两大类，分别是基于鼠类白血病病毒的反转录病毒载体的假病毒包装系统与基于慢病毒载体的假病毒包装体系。基于慢病毒载体的三质粒包装系统由包装质粒、包膜质粒及转移质粒组成。其中，包装质粒表达病毒复制所需的反式激活蛋白；转移质粒中含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，可以在其中插入靶基因或报告基因；包膜质粒则可表达异源病毒包膜蛋白。将上述三种质粒共转染包装细胞，可以获得仅有一次感染能力且复制缺陷的模拟病毒或假病毒。
在传统的三质粒包装系统的基础上，通过改造慢病毒载体系统中包装质粒中的病毒复制元件可实现其安全性；通过修饰转移质粒中的报告基因可以实现模拟病毒的可视化；通过更换包膜质粒可实现不同靶标病原的模拟，如：将表达水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)作为包膜质粒可以包装产生VSVG模拟病毒、将表达高致病性流感病毒的血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)作为包膜质粒则可以包装产生高致病性流感模拟病毒、将表达中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus)的棘突蛋白(Spick Protein)S作为包膜质粒可以包装产生MERS-CoV模拟病毒。
常见的慢病毒转移质粒通常只含有一种报告基因，如绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein，GFP)、红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein，GFP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)或荧光素酶(Luciferase)等。GFP在长波紫外或蓝光波长照射下可以发出绿色荧光，由于检测时无需抗体、辅因子、酶底物等其它成分，不影响宿主细胞，可视化特点有利于识别活细胞中的蛋白表达，已成为生物学领域广泛应用的报告蛋白，但由于其激发后发射的荧光特异性不够而难以应用于活体成像示踪监测。萤光素酶是自然界中能够催化底物产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的包括萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase，Fluc)和来源于海洋桡脚类动物(Gaussia princeps)的分泌型萤光素酶(Gaussialuciferase，Gluc)。Gluc可以高效分泌至细胞外，不须裂解细胞即可实时检测，具有高灵敏度，可达到自动化高通量检测的要求，在细胞内感染检测、药物筛选、细胞标记和示踪以及动物活体成像等方面都得到了广泛的应用。
通过构建同时表达绿色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因的慢病毒转移质粒，将其与包装质粒和包膜质粒共转染包装细胞，可以获得携带双报告基因模拟病毒。该研究技术将GFP和Gluc两种报告基因优势互补，既能实现荧光显微镜下的感染细胞的体外可视化分析，又能实现对感染细胞上清进行荧光强度的实时监测和定量分析，将为模拟病毒的可视化追踪和定量分析提供有力保障。
发明内容 构建可同时表达绿色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因的慢病毒转移质粒，并在此基础上获得高滴度的双报告基因模拟病毒，为基于双报告基因的模拟病毒的可视化追踪和定量分析提供了有力保障。
附图说明
图1为表达双报告基因的转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP的结构示意图；
图2为三质粒系统包装体系的包装质粒pCMV HR’ΔR8.2；转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP以及包膜质粒pCMV-VSVG的酶切鉴定结果。其中，M为λ-EcoT14I digest核酸分子标准；1为经过Bam HI和Sal I双酶切包装质粒pCMV HR’ΔR8.2；2为经过Hind III酶切的切转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP；3为使用BamHI酶切包膜质粒pVSV-G；4为未经过酶切的包装质粒pCMV HR’ΔR8.2；5为未经过酶切的转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP；6为未经过酶切的包膜质粒pCMV-VSVG。
图3为转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP转染Huh7-CD81和Huh7细胞后的GFP蛋白表达结果。其中，图A为转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP转染Huh7-CD81细胞748h后荧光显微镜下观察到的GFP表达即结果；图B为转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP转染Huh7细胞和48h后荧光显微镜下观察到的GFP表达结果。结果显示，携带双报告基因的转移质粒可实现其在转染细胞中的可视化。
图4为转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP转染Huh7-CD81和Huh7细胞后的Gluc荧光强度分析结果。其中，图A为转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP转染Huh7-CD81细胞48h后上清检测到的Gluc荧光素酶活性检测结果；图B为转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP转染Huh7细胞48h后上清检测到的Gluc荧光素酶活性检测结果。结果显示，携带双报告基因的转移质粒可实现其在转染细胞上清中的追踪检测和定量分析。
图5为高滴度双报告基因模拟病毒包装流程图。将包装质粒pCMV HR’ΔR8.2、转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP以及包膜质粒pCMV-VSVG共转染293FT，48h后收获上清，获得双报告基因可视化模拟病毒VSVpp。
图6为双报告基因模拟病毒VSVpp的P24定量分析结果。通过标准曲线计算双报告基因可视化模拟病毒VSVpp的P24含量为300ng/ml。
图7为双报告基因可视化模拟病毒VSVpp感染A549细胞和Huh7细胞后GFP示踪分析结果。其中，图A为双报告基因模拟病毒VSVpp感染A549细胞后48h的GFP示踪分析情况，图B为双报告基因模拟病毒VSVpp感染Huh7细胞48h后的GFP示踪分析情况。模拟病毒VSVpp感染两种细胞后均能在荧光显微镜下直接观察到GFP的表达。
图8为双报告基因可视化模拟病毒VSVpp感染A549细胞与Huh7细胞后Gluc实时监测结果。模拟病毒VSVpp感染两种细胞后的上清实时监测结果表明分泌型Gluc持续高水平表达。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1：携带GFP和Gluc双报告基因的转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP的构建
1.1gluc-2A-eGFP目的基因的扩增
根据模板质粒pAAVneo-gluc-2A-eGFP序列设计引物G2GF(ATCACCGGTATGGGAGTCAAAGTTCTG)和G2GR(CGTCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCC)，上下游引物分别引入AgeI和XhoI酶切位点。将引物用无菌水稀释至10umol/L。PCR反应体系：pyrobestDNA聚合酶0.25uL，dNTP(10umol/L)4uL，10X缓冲液5uL，模板5ng，引物各2uL，无菌水补至50uL。PCR反应条件：94℃预变性15min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测大小，片段大小预期为1360bp。
1.2转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP的构建
PCR产物经DNA片段纯化试剂盒纯化后，与载体质粒pCS-CG分别经AgeI和XhoI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后，分别回收片段和载体，4℃连接过夜。连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR，PCR阳性克隆经HidIII单酶切鉴定，理论上可以得到5031bp、2901bp、584bp和553bp条带。酶切正确的克隆进行测序分析，获得表达双报告基因的转移质粒，命名为pCS-gluc-2A-eGFP，其结构示意图见图1。
1.3包装质粒、包膜质粒和转移质粒的大量制备
使用康为世纪质粒DNA超级金牌无内毒素大提试剂盒操作说明进行三种质粒的大量制备：将验证正确的菌液按照1∶1000比例转接至300ml含有氨苄抗生素的细菌培养基LB中，4℃条件下5000rpm离心15min，收集菌体；加入P1溶液12ml充分重悬，裂解菌体；加入P2溶液12ml温和混匀，室温放置3-5min进行碱裂解；加入P3溶液12ml上下混匀，室温放置5min进行中和；5000rpm离心20min，将上清转移至内毒素过滤器进行内毒素的去除；于滤过液中加入11ml异丙醇沉淀DNA；并将液体按照15ml/次的量，分三次转移至平衡好的吸附柱中，5000rpm离心5min，富集DNA；向吸附柱中加入PW溶液10ml，5000rpm离心5min进行杂蛋白的洗涤，共洗涤2遍；将吸附柱放回收集管中5000rpm离心10min，倒掉废液，将吸附柱置于室温干燥10min，去除残余的乙醇；最后，将吸附柱放置于新的收集管中，向膜中间位置加入1ml去内毒素的洗脱液EB，室温放置2～5min，5000rpm离心10min，收集质粒溶液，-20℃保存。
1.4包装质粒、包膜质粒和转移质粒的酶切鉴定
分别使用BamHI和SalI双酶切包装质粒pCMV HR’ΔR8.2，理论上可获得6000bp、2000bp、1900bp左右的片段；使用HindIII切转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP，理论上可获得5031bp、2901bp、584bp和553bp条带；使用BamHI酶切包膜质粒pVSV-G，理论上可获得6000bp和1553bp条带。将大提质粒和酶切质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图2所示，三个质粒均能在预期大小片段处有明显条带，结果与预期一致。
1.5转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP转染细胞后的可视化分析
按5×105细胞/孔将Huh7-CD81细胞Huh7细胞接种于六孔板中，次日细胞换液为2ml的Optim-DMEM无血清，将2ug大提的转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP与HD转染试剂按照1∶3质量-体积比例混匀，室温避光反应15min后慢慢滴加至Huh7-CD81细胞或Huh7细胞中；转染后4～6h换成含2％FBS的DMEM培养基继续培养，48h后观察结果。将Huh7-CD81细胞Huh7细胞在荧光倒置显微镜下观察自发绿色荧光细胞情况；将细胞培养上清1∶20稀释，取20uL加入50uLGluc分析底物，使用发光检测仪测定其相对荧光强度(Relative Luciferase Unit，RLU)。细胞体外GFP示踪结果如图3所示，Gluc实时监测结果如图4所示。结果表明，双报告转移质粒可利用GFP和Gluc双报告基因实现其转染细胞后的可视化定量分析。
实施例2：携带GFP和Gluc双报告基因的模拟病毒VSVpp的包装与生物特性分析
2.1模拟病毒VSVGpp的包装
将293FT细胞按照5X105cell/孔的量接种6孔板，24h后吸弃细胞培养液，换成1ml无血清无抗生素的Optim-MEM培养基，37℃，5％CO2孵箱培养；将包装质粒pCMV HR’ΔR8.2、包膜质粒pVSV-G和含双报告基因的转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP按照2∶2∶1质量比例3ug与9ul转染试剂HD室温避光孵育15min后，逐滴加入至293FT细胞进行共转染，转染后4～6h换成含2％FBS的DMEM培养基继续培养。转染后48-72h收上清获得表达VSV包膜G蛋白的双报告基因模拟病毒，命名为VSVpp，1000rpm离心5min，用0.45μm滤器过滤，可直接进行后续实验或-70℃保存。模拟病毒构建流程如图5所示。
2.2模拟病毒VSVpp的滴定
用BIOMERIEUX的Vironostika HIV-1抗原微量ELISA检测试剂盒进行P24测定。计算试验所需的检测孔数，每次试验设阴性对照3孔，阳性对照5孔，将标准样品倍比稀释5个稀释度。取出包被条5min内，每孔加入25ul裂解液，然后依次加入100μl待测样品及对照，用胶纸封好。37℃孵育60min。洗涤4次，每次浸泡30秒。加入100μl酶标抗体，37℃孵育60min。洗涤4次，每次浸泡30秒。加入100ul底物液，室温放置30min后加入100ul 1M硫酸终止反应，置于酶标仪测定OD450或OD450/630。利用标准样品制作标准曲线，根据上清OD值及稀释度计算p24含量。P24定量标准曲线如图6所示，测得双报告基因模拟病毒VSVpp的P24含量为300ng/ml。
2.3模拟病毒VSVpp感染细胞
按1×104细胞/孔将Huh7细胞或A549细胞接种于96孔板，同时设置对照。24h后，每孔加入50ul模拟病毒；37℃吸附3～4h，每0.5h～1h轻轻摇动3～5次。阴性对照使用无血清培养基替代VSVpp。PBS洗涤3次后换成100uL新鲜的2％FBS的DMEM培养基继续培养。
2.4模拟病毒VSVpp的示踪分析
将VSVpp感染的Huh7细胞和A549细胞在荧光倒置显微镜下观察自发绿色荧光细胞；在感染后3h、6h、9h、12h、20h、26h、32h、48h、60h、72h、84h、86h及120h等不同时间点取细胞培养上清进行1∶20稀释，然后取20uL加入50uLGluc分析底物，使用发光检测仪测定其相对荧光强度RLU。细胞体外GFP示踪结果如图7所示，模拟病毒感染Huh7细胞和A549细胞后48h即可观察到GFP蛋白的表达，感染阳性率可达80％以上。Gluc实时监测结果如图8所示，Gluc的表达水平从感染后6h开始检测到，并在感染后第5天还能检测到，灵敏度高达106RLU/20ul以上。结果表明，模拟病毒可利用GFP和Gluc双报告基因实现可视化高灵敏度定量分析。

Claims (3)

1.本发明公开了高滴度双报告基因的可视化模拟病毒及其应用。其特征在于：利用慢病毒三质粒包装系统的技术获得同时表达绿色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因的模拟病毒。
2.按照权利要求1所述的高滴度双报告基因的可视化模拟病毒的制备方法，其特征在于，包括以下方法：
(1)扩增双报告基因gluc-2A-eGFP；
(2)AgeI和XhoI双酶切转移质粒pCS-CG和gluc-2A-eGFP；
(3)将步骤(2)获得的pCS-CG和gluc-2A-eGFP进行连接，得到表达双报告基因的转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP；
(4)将包装质粒pCMV HR’ΔR8.2、转移质粒pCS-gluc-2A-eGFP和包膜质粒pCMV-VSVG共转染293FT细胞，48h后收获上清，获得高滴度双报告基因的可视化模拟病毒。
3.按照权利要求1和2所述的高滴度双报告基因模拟病毒在高致病性病原微生物可视化追踪和定量分析等方面的应用。
CN201611204375.5A 2016-12-23 2016-12-23 高滴度双报告基因的可视化模拟病毒及其应用 Pending CN106754757A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611204375.5A CN106754757A (zh) 2016-12-23 2016-12-23 高滴度双报告基因的可视化模拟病毒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611204375.5A CN106754757A (zh) 2016-12-23 2016-12-23 高滴度双报告基因的可视化模拟病毒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106754757A true CN106754757A (zh) 2017-05-31

Family

ID=58900038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611204375.5A Pending CN106754757A (zh) 2016-12-23 2016-12-23 高滴度双报告基因的可视化模拟病毒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106754757A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235120A (zh) * 2018-11-29 2020-06-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种构建荧光素酶高表达稳定细胞系的方法及细胞系
CN111593073A (zh) * 2020-03-18 2020-08-28 苏州奥特铭医药科技有限公司 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235120A (zh) * 2018-11-29 2020-06-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种构建荧光素酶高表达稳定细胞系的方法及细胞系
CN111593073A (zh) * 2020-03-18 2020-08-28 苏州奥特铭医药科技有限公司 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dolskiy et al. Cell cultures for virology: usability, advantages, and prospects
CN106884017B (zh) 用于包装柯萨奇病毒b5假病毒的重组表达质粒、假病毒、试剂盒和方法
JP2019509020A (ja) 感染性因子を使用する微生物の迅速検出のための方法およびシステム
CN107805628A (zh) 一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4的细胞系及其构建方法
CN106636472B (zh) 检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法
Mao et al. Review detection of Newcastle disease virus
JPH09506776A (ja) Ｒｎａウイルス検出用指示細胞系及びそれを使用した方法
CN106754757A (zh) 高滴度双报告基因的可视化模拟病毒及其应用
US11873524B2 (en) Methods and systems for the rapid detection of Salmonella using infectious agents
CN108588276B (zh) D型流感病毒荧光定量pcr引物对及试剂盒
WO2021170035A1 (zh) Rna病毒核酸检测参照标准品及其用途
US20210062239A1 (en) Devices and Methods for Detecting Microorganisms Using Recombinant Reproduction-Deficient Indicator Bacteriophage
US12013390B2 (en) EBIV nucleic acid composition and application thereof
CN109142734B (zh) 禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒
CN104313179A (zh) 一种扎伊尔型埃博拉病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN107058630A (zh) 一种牛副流感3型病毒3种基因型多重rt‑pcr检测方法
CN113322268A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白及其构建的胶体金免疫层析试纸
CN112159866A (zh) 一种基于流感病毒载体的hiv-1核酸检测质控品的制备方法
Chang et al. Preparation of Pseudo-typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity
CN105256069B (zh) 鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的成套试剂及应用
CN103451159B (zh) 一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途
Peng et al. An Overview of Influenza A Virus Detection Methods: From State-of-the-Art of Laboratories to Point-of-Care Strategies
CN117230258B (zh) 一种提高灵敏度的培养扩增联合pcr的eb病毒检测方法
Rai et al. Construction and characterization of a full-length, replication-competent and infectious enhanced green fluorescence protein-tagged HIV-1 subtype C molecular clone
Hernandez Investigating Hemagglutinin in Influenza A using pseudoviruses

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170531