CN106754443B

CN106754443B - 一种产特异性抗菌肽的酵母工程菌及其发酵应用

Info

Publication number: CN106754443B
Application number: CN201611250551.9A
Authority: CN
Inventors: 黄钦耿; 黄建忠; 梁玲; 蒋顺进; 方文棋; 吴松刚
Original assignee: Guangdong Rongda Biology Co ltd; Fujian Normal University
Current assignee: GUANGDONG RONGDA BIOLOGY Co.,Ltd.; Fujian Normal University
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2036-12-29
Also published as: CN106754443A

Abstract

本发明公开了一种产抗菌肽的酵母工程菌及其发酵应用。本发明提供一种酿酒酵母pm148(Saccharomyces cerevisiae pm148)，其保藏编号为CCTCC NO：M2016761。本发明以安全营养型的酿酒酵母为宿主，采用组成型启动子GAP为调控因子，以rDNA为整合位点，构建无外源抗性基因片段、生物安全性高的酿酒酵母工程菌株，通过强启动子多拷贝整合高效启动抗菌肽表达，无需诱导，无需纯化，发酵产物采用低温喷雾干燥工艺，直接制备富含抗菌肽成分的酵母制剂产品，该产品具备较好的抗菌性能，特别是针对大肠杆菌等革兰氏阴性菌抑菌效果显著，可直接作为饲料添加剂使用，具备较好的应用效果。

Description

一种产特异性抗菌肽的酵母工程菌及其发酵应用

技术领域

本发明涉及于生物技术和基因工程领域，具体涉及一种产抗菌肽的酵母工程菌及其发酵应用。

背景技术

抗生素的出现对人类防御和治疗细菌感染性疾病方面具有重要地位，为人类健康事业做出了巨大的贡献。但是随着抗生素的大范围应用，特别在农业和养殖业层面，抗生素的过度使用给食品安全、生态安全以及人类健康带来诸多不利影响，寻找合适的抗生素的替代物，开发在体内无有害残留、不能或不易产生耐药性、绿色环保的抗生素有效替代品的研究正成为当下的热点课题而受到广泛关注。

抗菌肽(Antimicrobial peptides)是一类广泛存在于生物体内的天然免疫的重要介质，是宿主防御系统的重要组成部分，在生物体遭受外界异物刺激或病原微生物感染时能够快速产生、具有多种生物学活性的小分子多肽。抗菌肽的来源非常广泛，而且种类繁多，功能多样，自1962年Kiss和Michl首次从铃蟾皮肤分泌物中分离出铃蟾抗菌肽以来，短短几十年中，在植物、微生物、昆虫、两栖类以及哺乳动物等中已发现和鉴定抗菌肽一千多种，其中昆虫来源的抗菌肽已经超过两百种。抗菌肽对于细菌、真菌、原虫、病毒等具有非特异性的抑制作用，能抑杀癌变细胞，而且可作为免疫效应分子来启动、调节生物体的一系列免疫反应。另外，抗菌肽杀菌机制与传统抗生素不同，多数抗菌肽通过细胞膜电荷的区别进行选择性杀伤，所以其对正常哺乳动物细胞几乎无毒性，而且由于细胞膜具有的高度保守性，故耐药的产生尤其困难甚至几乎不可能，被认为是一类天然的肽类抗生素。也正是由于抗菌肽独特的抗菌机理、高效广谱的抑菌活性以及绿色安全的特性，使其成为最具开发前景的新型抗菌药物，在饲料添加剂方面有广泛的应用前景，特别是在推行无抗养殖、保证食品健康的过程中，抗菌肽的应用研究更是备受青睐。由于天然抗菌肽的表达量低、提取过程复杂，导致难以大量获得；而化学合成的成本又高、价格昂贵，且对多数微生物宿主存在一定的毒性，这也导致抗菌肽的规模化的生产应用一直受到制约。所以，选用合适宿主，利用基因工程手段进行抗菌肽的异源表达的研究一直备受关注。而酵母由于其背景清晰、蛋白翻译及后修饰功能完善以及便于培养等特点，使得其表达体系成为抗菌肽代谢工程研究中应用最为广泛和重要的表达体系之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种产抗菌肽的酵母工程菌及其发酵应用。

本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)pm148，已于2016年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2016761。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)pm148CCTCC NO：M2016761简称为酿酒酵母pm148。

本发明还保护一种酵母制剂产品的制备方法，包括如下步骤：培养所述酿酒酵母pm148。

本发明还保护一种酵母制剂产品的制备方法，包括如下步骤(a1)和(a2)：

(a1)将酿酒酵母pm148接种至发酵培养基中培养；

(a2)完成步骤(a1)后，取整个培养体系，进行低温喷雾干燥，得到酵母制剂产品。

所述步骤(a1)中，所述培养具体可为将酿酒酵母pm148种子液接种至发酵培养基培养。

所述酿酒酵母pm148种子液的制备方法包括如下步骤(a3)：将酿酒酵母pm148接种至YPD液体培养基培养，得到种子液。

所述步骤(a3)可在培养瓶中进行。

所述步骤(a3)中，所述培养条件具体可为30℃，250rpm振荡培养。

所述种子液ΔOD_650nm＝25-35。

所述种子液AOD_650nm＝30。

所述步骤(a3)可在发酵罐中进行。

所述步骤(a3)中，所述培养条件具体可为30℃培养。

所述种子液ΔOD_650nm＝55-65。

所述种子液ΔOD_650nm＝60。

所述步骤(a1)可在培养瓶中进行。所述步骤(a1)中，所述培养条件具体可为30℃，250rpm振荡培养72小时。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1：10。

所述步骤(a1)可在发酵罐中进行。所述步骤(a1)中，所述培养条件具体可为：培养时间72小时，通过加入50％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的葡萄糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的葡萄糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的葡萄糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加20％的氨水溶液控制发酵罐的pH在5.5-6.0，培养温度30℃。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶5。

所述步骤(a2)中，所述低温喷雾干燥具体可采用YC-2000实验室真空喷雾干燥机进行操作。

以上任一所述低温具体可为70℃。

本发明还保护以上任一所述方法制备得到的酵母制剂产品。

本发明还保护酿酒酵母pm148的应用，为如下(b1)-(b11)中的至少一种：

(b1)抑制细菌；

(b2)抑制革兰氏阳性菌；

(b3)抑制革兰氏阴性菌；

(b4)抑制大肠杆菌；

(b5)抑制金黄色葡萄球菌；

(b6)制备抑制细菌的产品；

(b7)制备抑制革兰氏阳性菌的产品；

(b8)制备抑制革兰氏阴性菌的产品；

(b9)制备抑制大肠杆菌的产品；

(b10)制备抑制金黄色葡萄球菌的产品；

(b11)制备饲料添加剂。

本发明还保护所述酵母制剂产品的应用，为如下(c1)-(c12)中的至少一种：

(c1)抑制细菌；

(c2)抑制革兰氏阳性菌；

(c3)抑制革兰氏阴性菌；

(c4)抑制大肠杆菌；

(c5)抑制金黄色葡萄球菌；

(c6)制备抑制细菌的产品；

(c7)制备抑制革兰氏阳性菌的产品；

(c8)制备抑制革兰氏阴性菌的产品；

(c9)制备抑制大肠杆菌的产品；

(c10)制备抑制金黄色葡萄球菌的产品；

(c11)作为饲料添加剂；

(c12)制备饲料添加剂。

本发明还保护一种培养酿酒酵母pm148的方法，包括如下步骤：采用发酵培养基培养所述酿酒酵母。

所述培养具体可为将酿酒酵母pm148种子液接种至发酵培养基培养。

所述培养可在培养瓶中进行。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶10。所述培养条件具体可为30℃，250rpm振荡培养72小时。

所述种子液ΔOD_650nm＝25-35。

所述种子液ΔOD_650nm＝30。

所述培养可在发酵罐中进行。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1：5。所述培养条件具体可为：培养时间72小时，通过加入50％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的葡萄糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的葡萄糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的葡萄糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加20％的氨水溶液控制发酵罐的pH在5.5-6.0，培养温度30℃。

所述种子液αOD_650nm＝55-65。

所述种子液αOD_650nm＝60。

所述酿酒酵母pm148种子液的制备方法包括如下步骤：将酿酒酵母pm148接种至YPD液体培养基培养，得到种子液。

所述培养可在培养瓶中进行。所述培养条件具体可为30℃，250rpm振荡培养。

所述培养可在发酵罐中进行。所述培养条件具体可为30℃培养。

本发明还保护一种用于培养酿酒酵母pm148的试剂盒，包括发酵培养基。

所述试剂盒还包括YPD液体培养基。

本发明还保护一种用于制备酵母制剂产品的试剂盒，包括发酵培养基。

所述试剂盒还包括酿酒酵母pm148。

所述试剂盒还包括YPD液体培养基。

本发明还保护以上任一所述的试剂盒的应用，为如下(d1)-(d6)中的至少一种：

(d1)制备抑制细菌的产品；

(d2)制备抑制革兰氏阳性菌的产品；

(d3)制备抑制革兰氏阴性菌的产品；

(d4)制备抑制大肠杆菌的产品；

(d5)制备抑制金黄色葡萄球菌的产品；

(d6)制备饲料添加剂。

以上任一所述发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：蛋白胨1-3g/100mL、酵母粉0.5-1.5g/100mL、葡萄糖4-5g/100mL、NH₄H₂PO₄ 4-6g/100mL、K₂SO₄ 1-3g/100mL、MgSO₄·7H₂O 1-2g/100mL、KH₂PO₄0.5-0.7g/100mL、CaSO₄0.03-0.05g/100mL；所述溶剂为水。

所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度具体如下：蛋白胨2g/100mL、酵母粉1g/100mL、葡萄糖3g/100mL、NH₄H₂PO₄ 5g/100mL、K₂SO₄ 2g/100mL、MgSO₄·7H₂O1.5g/100mL、KH₂PO₄ 0.6g/100mL、CaSO₄ 0.04g/100mL。

所述发酵培养基的pH＝5.5。

以上任一所述YPD液体培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述YPD液体培养基中的浓度如下：葡萄糖2g/100mL、蛋白胨2g/100mL、酵母抽提物1g/100mL；所述溶剂为水。

以上任一所述饲料添加剂具体可为猪饲料添加剂。

本发明提供了一种产抗菌肽的酵母工程菌及其制备方法和发酵应用。本发明以安全营养型的酿酒酵母为宿主，采用组成型启动子GAP为调控因子，以rDNA为整合位点，构建无外源抗性基因片段、生物安全性高的酿酒酵母工程菌株，通过强启动子多拷贝整合高效启动抗菌肽表达，无需诱导，无需纯化，发酵产物采用低温喷雾干燥工艺，直接制备富含抗菌肽成分的酵母制剂产品，该产品具备较好的抗菌性能，特别是针对大肠杆菌等革兰氏阴性菌抑菌效果显著，可直接作为饲料添加剂使用，具备较好的应用效果。

附图说明

图1为高拷贝重组载体pUGrx-mor的构建过程示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中的低温为70℃。

pGAPZαA质粒：Invitrogen公司。

pUG6质粒：武汉淼灵生物科技有限公司。

pSH65质粒：武汉淼灵生物科技有限公司。

酿酒酵母1373：中国工业微生物菌种保藏中心，编号：1373。

大肠杆菌(Escherichia coli)：中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号：44103。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：ATCC，货号：25923。

YPD液体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然，121℃条件下灭菌20min。

YPD固体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，琼脂粉20g，加蒸馏水至1000mL，pH自然，121℃条件下灭菌20min。

YPG液体培养基：半乳糖18g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然，121℃条件下灭菌20min。

YPG固体培养基：半乳糖18g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，琼脂粉20g，加蒸馏水至1000mL，pH自然，121℃条件下灭菌20min。

发酵培养基：蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖45g，NH₄H₂PO₄50g，K₂5O₄20g，MgSO₄·7H₂O15g，KH₂PO₄ 6g，CaSO₄0.4g，加蒸馏水至1000mL，调节pH至5.5，121℃条件下灭菌20min。

YC-2000实验室真空喷雾干燥机：上海雅程仪器有限公司。

杜长大仔猪：江苏辉煌猪业养猪有限公司。

基础日粮：玉米55％，豆粕粉20％，麸皮12％，米糠3％，猪浓缩料10％，河南九鼎农牧发展有限公司。

10％硫酸粘菌素预混剂：广东容大生物股份有限公司。

以下实施例中的琼脂孔穴扩散法检测待测产品的抑菌活性参照文献：李秀兰，戴祝英，张双全.抗菌肽琼脂糖孔穴扩散法与比浊法测活比较及其相关性[J].南京师大学报(自然科学版)，1998(2)：81-83.。具体为取待测产品1g和9mL无菌水充分混匀，分别选用革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)与革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)检测抑菌活性，测量待测产品的抑菌圈直径(含孔径)，计算孔径比(抑菌圈直径与孔直径的比值)，孔径为固定值8mm。

实施例1、特异性抗菌肽及其编码基因的获得

经过对多种物种中的多种抗菌肽序列进行分析优化，得到一种抗菌肽基因，将其命名为mor基因，mor基因的碱基序列如序列表的序列1所示，mor基因编码的抗菌肽命名为mor抗菌肽，其氨基酸序列如序列表的序列2所示。

实施例2、多拷贝重组载体pUGrx-mor的构建

一、重组载体pGAPZαA-mor的构建

1、人工合成序列表的序列1所示的DNA分子。

2、以步骤1得到的DNA分子为模板，采用引物F1和引物R1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5′-CGGAATTCCGTTGCCATTGGTTCCAGTTCCAC-3′；

R1：5′-GCTCTAGAGCTCTACCCAAGTCAACGTCAACACC-3′；

F1中，下划线标注的部分为EcoR I酶切位点和保护性碱基；

R1中，下划线标注的部分为Xba I酶切位点和保护性碱基。

3、用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切pGAPZαA质粒，回收约3100bp的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组载体pGAPZαA-mor。根据测序结果，对重组载体pGAPZαA-mor进行结构描述如下：将pGAPZαA质粒的EcoR I和Xba I酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列1的自5′端第1-129位核苷酸所示的DNA分子。

二、重组载体pUG-mor的构建

1、以步骤一得到的重组载体pGAPZαA-mor为模板，采用引物F2和引物R2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F2：5′-GGACTAGTCCTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTC-3′；

R2：5′-GGACTAGTCCCTCACTTAATCTTCTGTACTCTG-3′；

F2和R2中，下划线标注的部分为Spe I酶切位点和保护性碱基。

2、用限制性内切酶Spe I酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶Spe I酶切pUG6质粒，回收约4000bp的载体骨架并采用CIAP去磷酸化。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组载体pUG-mor。根据测序结果，对重组载体pUG-mor进行结构描述如下：将pUG6质粒的Spe I酶切位点之间插入了序列表的序列3的自5′端第1-1283位核苷酸所示的DNA分子。

序列表的序列3由4个功能区段组成，序列3第1-476位核苷酸为GAP启动子的编码区段，第486-752位核苷酸为α信号肽的编码区段，第761-889位核苷酸为mor基因区段，第1037-1283位核苷酸为AOX1基因转录终止子序列。

三、重组载体pUGr-mor的构建

1、提取酿酒酵母1373的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物F3和引物R3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F3：5′-AACTGCAGAACTCCACAGTGTGTTGTATTG-3′；

R3：5′-AACTGCAGGTGCTATGGTATGGTGACGGAG-3′；

F3和R3中，下划线标注的部分为Pst I酶切位点和保护性碱基。

3、用限制性内切酶Pst I酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶Pst I酶切步骤二得到的重组载体pUG-mor，回收约5300bp的载体骨架并采用CIAP去磷酸化。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组载体pUGr-mor。根据测序结果，对重组载体pUGr-mor进行结构描述如下：将重组载体pUG-mor的Pst I酶切位点之间插入了序列表的序列4的自5′端第1-2249位核苷酸所示的DNA分子。

四、多拷贝重组载体pUGrx-mor的构建

1、用限制性内切酶Not I酶切步骤三得到的重组载体pUGr-mor，得到酶切产物。

2、将步骤1得到酶切产物用T4DNA连接酶进行自连，得到去除重组载体pUGr-mor氨苄青霉素抗性基因片段的新质粒，命名为重组载体pUGrx-mor。

重组载体pUGrx-mor的构建示意图如图1所示。

实施例3、酿酒酵母工程菌pm148的获得

一、酿酒酵母工程菌pm148的构建

1、将实施例2得到的重组载体pUGrx-mor转化酿酒酵母，得到重组菌。

2、将步骤1得到的重组菌进行G418抗筛选，获得若干株能够在含G418浓度为1000μg/mL的YPD培养基平板生长的多拷贝整合的阳性重组菌。

3、将pSH65质粒分别转化步骤2得到的各个菌株，得到重组菌。

4、将步骤3得到的各个重组菌在含有半乳糖的YPG液体培养基中诱导培养表达Cre酶，识别loxP位点，得到切除抗性基因KanMX的重组菌。

5、完成步骤4后，将各个重组菌传代10次以上丢失pSH65质粒，最终获得抗菌肽基因多拷贝整合，且不含任何抗性基因的若干株酿酒酵母工程菌株。

从若干株酿酒酵母工程菌株中随机取10个菌株，依次命名为SC01-SC10。

将SC01-SC10中抗菌素产量最高的酿酒酵母工程菌株SC06命名为酿酒酵母工程菌pm148。

二、酿酒酵母工程菌pm148的遗传稳定性

将步骤二得到的酿酒酵母工程菌pm148进行传代培养以考察其遗传稳定性，每24h传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵，将发酵液进行低温喷雾干燥，得到低温喷雾干燥测定酵母制剂产品，采用琼脂孔穴扩散法检测其对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌活性，结果显示酿酒酵母工程菌pm148传代过程中酵母制剂产品抑菌活性均无明显变化，具有良好的遗传稳定性。

三、酿酒酵母工程菌pm148的保藏

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)pm148，已于2016年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2016761。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)pm148 CCTCC NO：M2016761简称为酿酒酵母pm148。

实施例4、酿酒酵母pm148的发酵应用

一、酿酒酵母pm148的摇瓶发酵

1、将酿酒酵母pm148接种至30mLYPD液体培养基中，4层纱布封口，30℃，250rpm振荡培养至菌液ΔOD_650nm＝30，得到种子液。

2、将3mL步骤1得到的种子液转接至30mL发酵培养基中，4层纱布封口，30℃，250rpm振荡培养72小时。

3、完成步骤2后，收集整个发酵体系，进行低温喷雾干燥(YC-2000实验室真空喷雾干燥机)，干燥的成品即为酵母制剂产品。

4、采用酿酒酵母1373替代酿酒酵母pm148，按照步骤1-3进行操作，得到对照酵母制剂产品。

5、采用实施例3得到的酿酒酵母工程菌株SC01-SC10(不包括SC06)替代酿酒酵母pm148，按照步骤1-3进行操作，得到酵母制剂产品SC01-SC10(不包括SC06)。

6、采用琼脂孔穴扩散法检测步骤3获得的酵母制剂产品、步骤4获得的对照酵母制剂产品和步骤5得到的酵母制剂产品SC01-SC10(不包括SC06)的抑菌活性。

步骤3获得的酵母制剂产品对大肠杆菌(Escherichia coli)测得的抑菌圈直径为27.5mm，孔径比为3.4375；对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)测得的抑菌圈直径为12.0mm，孔径比为1.5。

步骤4获得的对照酵母制剂产品对大肠杆菌(Escherichia coli)测得的抑菌圈直径为8.0mm，孔径比为1，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)测得的抑菌圈直径为8mm，孔径比为1。

步骤5得到的酵母制剂产品SC01对大肠杆菌(Escherichia coli)测得的抑菌圈直径为20.0mm，孔径比为2.5；对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)测得的抑菌圈直径为10.0mm，孔径比为1.25。酵母制剂产品SC02-酵母制剂产品SC10(不包括SC06)的抗菌活性与酵母制剂产品SC01无显著差异。

结果表明，步骤3获得的酵母制剂产品具备较好的抑制大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的能力，特别是对于革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)，其抑菌能力较革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)明显要好，体现了较为特异性的抑制部分革兰氏阴性菌的潜力，而且不含有任何外源抗性基因，具有更好的生物安全性。

二、酿酒酵母pm148的工业化发酵(采用30L全自动发酵罐，全程溶氧(DO)35-45％)

1、将酿酒酵母pm148接种至15L YPD液体培养基中，培养温度30℃，培养至菌液AOD_650nm＝60，得到种子液。

2、将3000mL步骤1得到的种子液转接至15L发酵培养基中，培养时间为72小时，通过加入50％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的葡萄糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的葡萄糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的葡萄糖浓度达到1.0g/100mL)，通过流加20％的氨水溶液控制发酵罐的pH在5.5-6.0，培养温度30℃。

3、步骤2发酵结束后，取整个发酵体系，低温喷雾干燥，干燥的成品即为酵母制剂产品。

4、采用琼脂孔穴扩散法检测步骤3得到的酵母制剂产品的抑菌活性。

步骤3获得的酵母制剂产品对大肠杆菌(Escherichia coli)测得的抑菌圈直径为32.0mm，孔径比为4；对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)测得的抑菌圈直径为16.0mm，孔径比为2，体现了非常好的抑菌效果。

实施例5、酵母制剂产品的热稳定性

1、将实施例4步骤二得到的酵母制剂产品分别进行如下分组处理：

对照组：不进行任何处理；

实验组A：10min沸水浴处理；

实验组B：20min沸水浴处理；

实验组C：30min沸水浴处理。

2、采用琼脂孔穴扩散法检测步骤1各组酵母制剂产品的抑菌活性。

结果表明，沸水浴处理对酿酒酵母pm148制备的酵母制剂产品对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的敏感性影响不大，抑菌圈直径与未处理的对照产品无明显差别，表明酿酒酵母pm148制备的酵母制剂产品具有非常好的耐高温性能，体现了较好的热稳定性。

实施例6、酵母制剂产品的应用效果实验

将150头杜长大健康断奶仔猪(10.5-11.5kg)随机分为4组(基础日粮对照组、实验对照组、实验组甲、实验组乙和实验组丙)，每组10只(公母各半)，每组设置三个重复。各组仔猪饲喂的饲料如下：

基础日粮对照组：基础日粮；

实验对照组：在基础日粮中加入质量分数为0.1％的10％硫酸粘菌素预混剂；

实验组甲：在基础日粮中加入质量分数0.025％的实施例4步骤二得到的酿酒酵母pm148制备的酵母制剂产品。

实验组乙：在基础日粮中加入质量分数0.05％的实施例4步骤二得到的酿酒酵母pm148制备的酵母制剂产品。

实验组丙：在基础日粮中加入质量分数0.1％的实施例4步骤二得到的酿酒酵母pm148制备的酵母制剂产品。

各组采取相同的饲养条件，饲养于同一栋猪舍内，由专人饲养。各组仔猪自由采食、饮水，采用相同常规饲养管理方法和常规免疫程序进行疾病预防。

实验期为24天。实验期间每天早上10点、下午5点观察，并记录各组仔猪喘气、咳嗽情况和腹泻情况，以及死亡数。计算呼吸道疾病发生率、腹泻率和成活率。

结果见表1。

表1各组统计结果

结果显示：0.025％添加量的酵母制剂产品对预防断奶仔猪呼吸道疾病综合症和腹泻的效果与目前市面常用的硫酸黏菌素相似，0.05-0.1％添加量的酵母制剂产品可显著降低断奶仔猪呼吸道疾病和腹泻的发病率，对提高仔猪抵抗力有显著效果，与0.1％添加量的10％硫酸黏菌素相比效果更好，因此，在实践中可以作为一类抗生素替代品进行推广应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建师范大学

广东容大生物股份有限公司

<120> 一种产特异性抗菌肽的酵母工程菌及其发酵应用

<160> 4

<210> 1

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ttgccattgg ttccagttcc acacgttgtt gttcacttca tgagaagacc aagaagagct 60

gaccacactg aaactttctt caacgacatg gctgctttgt tggaaggtgt tgacgttgac 120

ttgggtaga 129

<210> 2

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Leu Pro Leu Val Pro Val Pro His Val Val Val His Phe Met Arg Arg

1 5 10 15

Pro Arg Arg Ala Asp His Thr Glu Thr Phe Phe Asn Asp Met Ala Ala

20 25 30

Leu Leu Glu Gly Val Asp Val Asp Leu Gly Arg

35 40

<210> 3

<211> 1283

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

ttttgtagaa atgtcttggt gtcctcgtcc aatcaggtag ccatctctga aatatctggc 60

tccgttgcaa ctccgaacga cctgctggca acgtaaaatt ctccggggta aaacttaaat 120

gtggagtaat ggaaccagaa acgtctcttc ccttctctct ccttccaccg cccgttaccg 180

tccctaggaa attttactct gctggagagc ttcttctacg gcccccttgc agcaatgctc 240

ttcccagcat tacgttgcgg gtaaaacgga ggtcgtgtac ccgacctagc agcccaggga 300

tggaaaagtc ccggccgtcg ctggcaataa tagcgggcgg acgcatgtca tgagattatt 360

ggaaaccacc agaatcgaat ataaaaggcg aacacctttc ccaattttgg tttctcctga 420

cccaaagact ttaaatttaa tttatttgtc cctatttcaa tcaattgaac aactatttcg 480

aaacgatgag atttccttca atttttactg ctgttttatt cgcagcatcc tccgcattag 540

ctgctccagt caacactaca acagaagatg aaacggcaca aattccggct gaagctgtca 600

tcggttactc agatttagaa ggggatttcg atgttgctgt tttgccattt tccaacagca 660

caaataacgg gttattgttt ataaatacta ctattgccag cattgctgct aaagaagaag 720

gggtatctct cgagaaaaga gaggctgaag ctgaattccg ttgccattgg ttccagttcc 780

acacgttgtt gttcacttca tgagaagacc aagaagagct gaccacactg aaactttctt 840

caacgacatg gctgctttgt tggaaggtgt tgacgttgac ttgggtagag ctctagaaca 900

aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac catcatcatc atcatcattg 960

agttttagcc ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg ggcacttacg agaagaccgg 1020

tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt tgcctgagag atgcaggctt 1080

catttttgat acttttttat ttgtaaccta tatagtatag gatttttttt gtcattttgt 1140

ttcttctcgt acgagcttgc tcctgatcag cctatctcgc agctgatgaa tatcttgtgg 1200

taggggtttg ggaaaatcat tcgagtttga tgtttttctt ggtatttccc actcctcttc 1260

agagtacaga agattaagtg aga 1283

<210> 4

<211> 2249

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

aactccacag tgtgttgtat tgaaacggtt ttaattgtcc tataacaaaa gcacagaaat 60

ctctcaccgt ttggaatagc aagaaagaaa cttacaagcc tagcaagacc gcgcacttaa 120

gcgcaggccc ggctggactc tccatctctt gtcttcttgc ccagtaaaag ctctcatgct 180

cttgccaaaa caaaaaaatc cattttcaaa attattaaat ttctttaatg atccttccgc 240

aggttcacct acggaaacct tgttacgact tttagttcct ctaaatgacc aagtttgtcc 300

aaattctccg ctctgagatg gagttgcccc cttctctaag cagatcctga ggcctcacta 360

agccattcaa tcggtactag cgacgggcgg tgtgtacaaa gggcagggac gtaatcaacg 420

caagctgatg acttgcgctt actaggaatt cctcgttgaa gagcaataat tacaatgctc 480

tatccccagc acgacggagt ttcacaagat taccaagacc tctcggccaa ggttagactc 540

gctggctccg tcagtgtagc gcgcgtgcgg cccagaacgt ctaagggcat cacagacctg 600

ttattgcctc aaacttccat cggcttgaaa ccgatagtcc ctctaagaag tggataacca 660

gcaaatgcta gcaccactat ttagtaggtt aaggtctcgt tcgttatcgc aattaagcag 720

acaaatcact ccaccaacta agaacggcca tgcaccacca cccacaaaat caagaaagtg 780

ctctcaatct gtcaatcctt attgtgtctg gacctggtga gtttccccgt gttgagtcaa 840

attaagccgc aggctccact cctggtggtg cccttccgtc aattccttta agtttcagcc 900

ttgcgaccat actcccccca gaacccaaag actttgattt ctcgtaaggt gccgagtggg 960

tcattaaaaa aacaccaccc gatccctagt cggcatagtt tatggttaag actacgacgg 1020

tatctgatca tcttggtacc cctaactttc gttcttgatt aatgaaaacg tccttggcaa 1080

atgctttcgc agtagttagt cttcaataaa tccaagaatt tcacctctga caattgaata 1140

ctgatgcccc cgaccgtccc tattaatcat tacgatggtc ctagaaacca acaaaataga 1200

accaaacgtc ctattctatt attccatgct aatatattcg agcaatacgc ctgctttgaa 1260

cactctaatt ttttcaaagt aaaagtcctg gttcgccaag agccacaagg actcaaggtt 1320

agccagaagg aaaggccccg ttggaaatcc agtacacgaa aaaatcggac cggccaaccg 1380

ggcccaaagt tcaactacga gctttttaac tgcaacaact ttaatatacg ctattggagc 1440

tggaattacc gcggctgctg gcaccagact tgccctccaa ttgttcctcg ttaaggtatt 1500

tacattgtac tcattccaat tacaagaccc gaatgggccc tgtatcgtta tttattgtca 1560

ctacctccct gaattaggat tgggtaattt gcgcgcctgc tgccttcctt ggatgtggta 1620

gccgtttctc aggctccctc tccggaatcg aacccttatt ccccgttacc cgttgaaacc 1680

atggtaggcc actatcctac catcgaaagt tgatagggca gaaatttgaa tgaaccatcg 1740

ccagcacaag gccatgcgat tcgaaaagtt attatgaatc atcaaagagt ccgaagacat 1800

tgatttttta tctaataaat acatctcttc caaagggtcg agattttaag catgtattag 1860

ctctagaatt accacagtta taccatgtag taaaggaact atcaaataaa cgataactga 1920

tttaatgagc cattcgcagt ttcactgtat aaattgctta tacttagaca tgcatggctt 1980

aatctttgag acaagcatat gactactggc aggatcaacc agataactat cttaaaagaa 2040

gaagcaacaa gcagtaaaaa agaaagaaac cgaaatctct tttttttttt cccacctatt 2100

ccctcttgct agaagatact tattgagttt ggaaacagct gaaattccag aaaaattgct 2160

ttttcaggtc tctctgctgc cggaaatgct ctctgttcaa aaagctttta cactcttgac 2220

cagcgcactc cgtcaccata ccatagcac 2249

Claims

1.一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）pm148，其特征在于：其保藏编号为CCTCC NO:M 2016761。

2.一种如权利要求1所述的酿酒酵母的制剂产品的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述的酿酒酵母。

3.一种如权利要求1所述的酿酒酵母的制剂产品的制备方法，包括如下步骤（a1）和（a2）：

（a1）将权利要求1所述的酿酒酵母接种至发酵培养基中培养；

（a2）完成步骤（a1）后，取整个培养体系，低温喷雾干燥得到酵母制剂产品；

所述发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：蛋白胨1-3g/100mL 、酵母粉0.5-1.5g/100mL、葡萄糖4-5g/100mL、NH₄H₂PO₄4-6g/100mL、K₂SO₄1-3g/100mL、MgSO₄·7H₂O 1-2g/100mL、KH₂PO₄0.5-0.7g/100mL、CaSO₄0.03-0.05g/100mL；所述溶剂为水。

4.权利要求2或3所述的方法制备得到的酵母制剂产品。

5.权利要求1所述的酿酒酵母在制备抑制金黄色葡萄球菌的产品或制备抑制大肠杆菌的产品中的应用。

6.权利要求4所述的酵母制剂产品在制备抑制大肠杆菌的产品或制备抑制金黄色葡萄球菌的产品中的应用。

7.一种培养权利要求1所述酿酒酵母的方法，包括如下步骤：采用权利要求3中所述的发酵培养基培养所述酿酒酵母。