CN106747712A

CN106747712A - 一种新型、多功能生物肥及其应用

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Publication number: CN106747712A
Application number: CN201611028122.7A
Authority: CN
Inventors: 宗睿; 李佩佩; 刘鲁民; 周茜
Original assignee: Qingdao Hexie Biotechnology Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Hexie Biotechnology Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-11-18
Also published as: CN106747712B

Abstract

本发明涉及肥料生产技术领域，具体提供了一种新型、多功能生物肥及其应用。本发明所述生物肥能有效提高土壤肥力，促进大白菜生长，其肥效显著高于相同施用量的无机肥。施用生物肥的实验组中白菜株高、球高、横径与叶型指数分别提高了16.5%‑21.1%，14.9%‑33.2%，9%‑31%，6.25%‑18.75%，增产效果显著。而且，所述生物肥还能有效提高水稻、小麦等作物的育苗质量，进而有利于提高农作物的产量；还能显著降低土壤中重金属的含量，实现污染土壤的有效修复，应用前景广阔。

Description

一种新型、多功能生物肥及其应用

技术领域

本发明涉及肥料生产技术领域，具体涉及一种新型、多功能生物肥及其应用。

背景技术

狭义的生物肥料，是通过微生物生命活动，使农作物得到特定的肥料效应的制品，也被称之为接种剂或菌肥，它本身不含营养元素，不能代替化肥。广义地生物肥料是既含有作物所需的营养元素，又含有微生物的制品，是生物、有机、无机的结合体它可以代替化肥，提供农作物生长发育所需的各类营养元素。化肥和农药的大量应用对于人类而言利弊并存，为兴利除弊，科学家提出了“生态农业”，逐步实现在农田里少使用或不使用化肥和化学杀虫剂，而使用有机生物肥料和采用微生物方法防治病虫害。

生物肥料能提高土壤肥力，这是它的主要作用，如各种固氮菌肥料，可以增加土壤中的氮素来源，解磷解钾菌肥料可以将土壤中难溶性的磷、钾溶解出来，增加土壤中磷(P)、钾(K)元素的来源。另外，生物肥料还能促进作物的生长，改善农产品的品质。各种生物肥施入土壤中，都能产生不同的生长激素，刺激作物的生长，如“5406”放线菌生物肥，不但有拮抗病原菌防病壮菌的作用，还能分泌细胞分裂素促进作物的生长。真菌类的生物肥不仅在协助作物吸收磷、锌及铜等矿质元素方面有很强的作用，还有增强作物的吸水、保水以提高作物抗旱能力的作用。由于生物肥料能制造和协助作物吸收利用多种营养元素，因此对农产品的品质有很大的改善，可以改变因施化肥产生的“瓜不香，果不甜，茶无味”的现状，使农产品各项指标达到绿色食品的标准。

目前生物肥料生产企业发展过快过多，但多数是小规模企业，作坊式生产，生物肥料产品质量参差不齐，生物肥料种类很多，但多数还是传统的固氮、解磷、解钾微生物，而且很多生物肥的效果不稳定，抗逆性较差。因此，开发新型、高效的微生物菌种一直是本领域内的研究热点和难点。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型、多功能生物肥及其在农业生产中的应用。所述生物肥能有效提高土壤肥力，促进作物生长，并且能提高农作物的育苗质量，降低土壤中重金属含量，应用前景广阔。

本发明一方面提供了一种生物肥，是通过将拜莱青霉(Penicillium bilaji)和/或黑曲霉(Aspergillus niger)进行固体发酵获得的。

所述拜莱青霉(Penicillium bilaji)的保藏编号为CCTCC NO：M2015690。

所述黑曲霉(Aspergillus niger)的保藏编号为CCTCC NO：M2015004。

本发明另一方面提供了一种生物肥的生产方法，，具体包括如下步骤：

1)扩大培养，获得拜莱青霉和/或黑曲霉的液体种子；

2)按10-20％(w/w)的比例将步骤1)获得的液体种子接种到包含秸秆粉、腐植酸、麦麸和稻壳的混合基质中；

3)控制罐温28-30℃，通气量1-3m³/h，罐压0.01-0.05Mpa，间隔6h搅拌一次，转速50-70rpm，搅拌10-15min，发酵5-6天结束，即获得本发明所述的生物肥。

所述混合基质中秸秆粉、腐植酸、麦麸和稻壳的质量比为6-7：5-8：3-1：1。

进一步优选的，所述混合基质中秸秆粉、腐植酸、麦麸和稻壳的质量比为6:7:3:1。

所述混合基质的含水率为50-60％。

所述混合基质的pH为6.0-6.5。

本发明还提供了所述生物肥在农作物育苗中的应用。

本发明还提供了所述生物肥在土壤修复中的应用。

本发明所述生物肥能有效提高土壤肥力，促进大白菜生长，其肥效显著高于相同施用量的无机肥。施用生物肥的实验组中白菜株高、球高、横径与叶型指数分别提高了16.5％-21.1％，14.9％-33.2％，9％-31％，6.25％-18.75％，增产效果显著。而且，生物肥中的拜莱青霉VLD-11和黑曲霉CCTCC NO:M2015004共同作用，能够产生协同促进效果，比单一拜莱青霉VLD-11或黑曲霉CCTCC NO:M2015004具有更好的肥效，产生了意料不到的技术效果。此外，所述生物肥还能有效提高水稻、小麦等作物的育苗质量，进而有利于提高农作物的产量；还能显著降低土壤中重金属的含量，实现污染土壤的有效修复，应用前景广阔。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。

实施例1具有解磷功能的微生物筛选与鉴定

1、初筛

土壤样品：取自山东省莱州市彭家磷矿区的土壤；

土壤稀释液的制备：称取0.5g土壤样品溶于4.5ml无菌水中制成1：10的土壤溶液，然后从中吸取0.5ml土壤溶液置于4.5ml无菌水中，制成1：100的土壤溶液，以此方法类推，制备1：10⁶-10⁷的土壤稀释溶液。

取0.1ml土壤稀释溶液均匀涂布于难溶性无机磷固体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KC1 0.3g，MgSO₄.7H₂0 0.3g，FeSO₄.7H₂0 0.03g，MnSO₄.4H₂0 0.03g，Ca₃(PO₄)₂ 5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.5，琼脂20g，115℃灭菌30min)上，30℃培养箱中倒置培养2-3天，观察培养基上长出的菌落，其中有11个菌落周围产生了明显的颜色变化，并有透明圈产生，将其分别命名为VLD-1，VLD-2，……，VLD-11。

2、复筛

将实施例1初筛得到的11株菌分别接种到难溶性无机磷固体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KC1 0.3g，MgSO₄.7H₂0 0.3g，FeSO₄.7H₂0 0.03g，MnSO₄.4H₂00.03g，Ca₃(PO₄)₂ 5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.5，琼脂20g，115℃灭菌30min)上，30℃培养3天后，观察菌落周围透明圈的大小，结果发现透明圈最大的3株菌株分别为VLD-2，VLD-9，VLD-11。

将上述3株菌分别接种到50mL难溶性无机磷液体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl 0.3g，KC1 0.3g，MgSO₄.7H₂0 0.3g，FeSO₄.7H₂0 0.03g，MnSO₄.4H₂0 0.03g，Ca₃(PO₄)₂5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.5，115℃灭菌30min)中，30℃，200rpm，培养7天，同时以不加任何菌的液体解磷培养基作为对照组；分别检测培养液中的有效磷的含量，具体结果见表1。

2.1磷标准曲线的绘制

依次吸取5mg/l的磷标准溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、3.2、4.0ml于试管中，然后各加入钼锑抗显色剂2ml，蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，700nm波长下测定吸光度。此时各管中磷的浓度分为：0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.00mg/l。以磷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线。

2.2培养液有效磷含量测定

在无菌条件下分别取上述3株菌的培养液各5ml，8000rpm，离心5min，取上清液，稀释到合适的浓度，吸取0.5ml稀释液至试管中，加5ml蒸馏水，加2滴2,4-二硝基酚指示剂，加2ml钼锑抗显色剂，然后用蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，于700nm波长下比色，吸光度值代入标准曲线计算上清液中的有效磷含量，具体结果见表1。

表1不同菌株的解磷效果

样品	有效磷含量(mg/mL)
		空白对照组	0
VLD-2	1.254
		VLD-9	1.139
VLD-11	1.976

从表1中的数据可以看出，本发明从磷矿区土壤中筛选到的三株菌株均具有较强的解磷能力，能将培养基中的难溶磷(Ca₃(PO₄)₂)分解成可溶性的有效磷，其中VLD-11菌株的的解磷效率最高，其培养液中有效磷含量高达1.976mg/mL，取得了意料不到的效果。

3、菌株鉴定

申请人采用分子生物学的方法对筛选到的VLD-11菌株进行鉴定，测得其18s rDNA序列，并在GenBank核酸数据库中进行blast比对。结果显示，其18s rDNA序列与拜莱青霉(Penicillium bilaji)的序列相似度最高，达99％。申请人确认VLD-11菌株为拜莱青霉(Penicillium bilaji)，并将其命名为拜莱青霉VLD-11(Penicillium bilaji VLD-11)。

申请人已于2015年11月23日将上述拜莱青霉VLD-11(Penicillium bilaji VLD-11)于保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015690。

实施例2拜莱青霉VLD-11在油菜大田栽培实验中的应用

1、拜莱青霉VLD-11菌液的制备：

先将上述拜莱青霉VLD-11接种到PDA固体培养基上，30℃培养3-4天至孢子成熟，将长好的孢子用适量无菌生理盐水洗下，转接入马铃薯液体培养基中，充分混合均匀，于30℃培养4天，发酵液中孢子含量为10⁹-10¹⁰CFU/mL。

2、实验地点：青岛市崂山区枯桃村油菜种植大棚，土壤整体状况较为均匀。

3、实验过程：

选取2m×2m的方形区域作为一个实验区，共设置30个实验区，且每个实验区之间保持1米的间隔。

实验共设3个组：①空白对照组：不添加任何物质；②培养基处理组：在每个实验区中按40mL/m²的比例均匀喷洒上述灭菌的马铃薯液体培养基，然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀；③拜莱青霉VLD-11处理组：在每个实验区中按40mL/m²的比例均匀喷洒上述拜莱青霉VLD-11发酵菌液，然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀。每个组随机选择10个实验区。

1)种子处理：用5％的次氯酸钠表面灭菌油菜种子10min，用蒸馏水清洗3-4次除去次氯酸钠后在常温下放置30min自然干燥。

2)播种与收获：在每个实验区均匀播种30g油菜种子，定时浇水和管理，不施加肥料。播种45天后，收获全部油菜，并分别检测每个实验区油菜的鲜重和干重，计算每个处理组油菜的平均鲜重和平均干重，进行比较。

3)收获油菜的同时，分别采集每个实验区的土样，采用Olsen法检测土样中有效磷的含量，并进行比较。

试验结果表明：与空白对照组相比，培养基处理组油菜的平均鲜重和干重分别提高了5.56％和6.21％，有效磷含量提高了3.1％；拜莱青霉VLD-11处理组油菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了354.7％和297.8％，比培养基处理组分别提高350.9％和292.7％，有效磷含量比空白处理组提高了89.8％，比培养基处理组提高了87.1％。从而说明，使用本发明筛选到的拜莱青霉VLD-11能有效提高土壤中有效磷的含量，进而大幅度提高种植作物的产量，取得了意料不到的效果。

本发明所述拜莱青霉VLD-11可单独使用，也可与黑曲霉、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、丁酸梭菌、草酸青霉中的任意一种或两种或多种的组合混合制备解磷菌剂，能使土壤中有效磷的含量普遍提高50％-90％，效果显著。

实施例3拜莱青霉VLD-11在水稻育苗中的应用

1、实验地点：黑龙江省鹤岗市宝泉岭农场二队4号育苗大棚。

2、实验处理组设计：

空白对照组：仅采用育苗基质(购自浙江锦海育苗基质厂)；

拜莱青霉VLD-11处理组：1.2kg拜莱青霉VLD-11孢子粉(10⁹CFU/g)与1吨育苗基质掺匀；

以上两个处理组的播种、灌溉和施肥等管理相同，整个育苗期约为40天。

3、实验结果及分析

(1)水稻秧苗形态及叶绿素含量评价

从各处理组育苗盘的中央随机抽取100株秧苗，用清水冲洗干净后进行考苗，并检测第二叶的叶绿素含量。结果见表3。

表2拜莱青霉VLD-11对水稻苗株生长的影响

从表2的结果可以看出，本发明提供的拜莱青霉VLD-11能显著提高水稻的育苗质量。与空白对照组相比，拜莱青霉VLD-11处理组水稻秧苗的茎粗，根数，叶龄，1-2叶间距分别提高了25％，20.5％，31.9％，31.4％，株高，第二叶长和叶绿素含量也得到不同程度的提高，效果非常显著。

(2)水稻秧苗素质评价

百株干重和壮苗指数是秧苗素质高低的重要指标。

壮苗指数＝(茎粗×100株秧苗全株干重)/株高。

本发明所述拜莱青霉VLD-11处理组的水稻秧苗百株干重比空白对照组增加了36.32％，壮苗指数增加了56.15％，取得了意料不到的技术效果。

综上所述，本发明筛选到的拜莱青霉VLD-11不仅能有效提高土壤中有效磷的含量，还能能有效加快水稻秧苗的叶龄进程，有利于争取积温；增加茎粗，有利于茎维管束的发育，为保障水稻穗数和形成大穗提供了必要的秧苗基础；增加叶间距和叶长，提高叶片叶绿素含量，有利于促进光合作用和光合产物的积累；增加水稻根数，有助于加快秧苗移栽后的返青速度。因此，所述拜莱青霉VLD-11能显著提高水稻秧苗的素质，进而直接有利于提高水稻产量。

实施例4拜莱青霉VLD-11在土壤修复中的应用

采集青岛市崂山区仰口景区山地土壤10kg。所釆土壤在干燥通风处自然风干，研磨过2mm孔径筛，混匀，污染Pb的添加浓度为2g/kg，以Pb(NO3)2溶液的形式加入土壤后混匀，置通风处自然风干，老化60天后过2mm孔径筛，并充分混匀，土壤中Pb²⁺含量为2.04g/kg。

分别称取过8目的风干土壤200g于500mL三角瓶中，处理组1只添加10g羟基磷灰石(100目)；处理组2只添加2g拜莱青霉VLD-11孢子粉(10⁹CFU/g)；处理组3同时添加10g羟基磷灰石(100目)和2g拜莱青霉VLD-11孢子粉(10⁹CFU/g)。将羟基磷灰石、拜莱青霉VLD-11孢子粉与土壤充分混匀，用去离子水调节土壤含水量至20％～25％，于室温培养，同时设置空白对照组，各处理设置三个重复。培养30天后，取样烘干，分别用二乙三胺五乙酸(DTPA)溶液浸提游离态重金属铅，振荡过滤，测定滤液中游离铅的浓度，计算游离铅的去除率，具体结果见表1。

表1羟基磷灰石和/或拜莱青霉对土壤中游离铅的去除效果

实验组	添加	游离铅浓度	游离铅去除率
				空白对照组	——	2.04g/kg	0
处理组1	10g羟基磷灰石	1.637g/kg	19.75％
				处理组2	2g拜莱青霉VLD-11	1.412g/kg	30.78％
处理组3	10g羟基磷灰石+2g拜莱青霉VLD-11	0.191g/kg	90.64％

从表1的结果可以看出，单独添加5％羟基磷灰石的处理组1土壤中游离铅的去除率仅为19.75％，而单独添加1％本发明提供的拜莱青霉VLD-11孢子粉的处理组2土壤中游离铅的去除率能达到30.78％，效果非常显著；同时添加羟基磷灰石和拜莱青霉VLD-11的处理组3土壤中游离铅的去除率高达90.64％，说明拜莱青霉VLD-11能与羟磷灰石协同作用，有效促进游离铅的固定，降低土壤中游离铅的含量，在一定程度上的恢复铅污染土壤。

除了铅污染土壤之外，对于其他重金属污染土壤，如锌污染、铜污染、镉污染、汞污染等，本发明提供的拜莱青霉VLD-11均具有一定的修复效果，对游离态重金属的去除率能达到30％以上，拜莱青霉VLD-11与羟磷灰石协同作用，对游离态重金属的去除率能达到85％以上，效果显著，应用前景广阔。

实施例5利用拜莱青霉VLD-11生产生物肥

将拜莱青霉VLD-11菌株扩大培养获得液体种子：从斜面上取2-3环拜莱青霉菌株的孢子，接种到200mL灭菌的液体种子培养基中，置于28-30℃，转速180rpm的摇床上培养40-48小时，做液体种子，其中孢子数约为10⁹CFU/mL。

按20％(w/w)的比例将上述液体种子接入包含秸秆粉、腐植酸、麦麸和稻壳废弃物的混合基质中。所述混合基质的制备方法：按质量比为6-7：5-8：3-1：1分别称取秸秆粉、腐植酸、麦麸和稻壳，混合均匀，调节含水率50-60％，装入50L不锈钢固体发酵罐中，调节pH至6.0-6.5，经121℃，30min灭菌后，冷却至30℃。控制罐温28-30℃，通气量1-3m³/h，罐压0.01-0.05Mpa，间隔6h搅拌一次，转速50-70rpm，搅拌10-15min，发酵6天结束。经活菌计数，生产出的生物肥中拜莱青霉孢子总数≥10¹⁰CFU/g，获得生物肥1号。

实施例6利用黑曲霉生产生物肥

采用实施例5所述扩大培养方法，分别获得黑曲霉CCTCC NO:M2015004的液体种子，其中孢子数均为10⁹CFU/mL。

按20％(w/w)的比例将上述液体种子接入包含秸秆粉、腐植酸、麦麸和稻壳废弃物的混合基质中。所述混合基质的制备方法同实施例5。控制罐温28-30℃，通气量1-3m³/h，罐压0.01-0.05Mpa，间隔6h搅拌一次，转速50-70rpm，搅拌10-15min，发酵6天结束。经活菌计数，生产出的生物肥中黑曲霉孢子总数≥10¹⁰CFU/g，获得生物肥2号。

实施例7利用拜莱青霉和黑曲霉混合发酵生产生物肥

按10％(w/w)的比例将实施例5获得的拜莱青霉液体种子接入包含秸秆肥、腐植酸、麦麸和稻壳废弃物的混合基质中，同时按10％(w/w)的比例将实施例6获得的黑曲霉液体种子也接入上述混合基质中。所述混合基质的制备方法同实施例5。控制罐温28-30℃，通气量1-3m³/h，罐压0.01-0.05Mpa，间隔6h搅拌一次，转速50-70rpm，搅拌10-15min，发酵6天结束。经活菌计数，生产出的生物肥中拜莱青霉和黑曲霉的孢子总数≥10¹⁰CFU/g，获得生物肥3号。

实施例7生物肥在农作物种植中的应用

在青岛市城阳区惜福镇蔬菜种植区选取土质肥沃、地力均匀的地块，栽植大白菜苗，分别于1个月、两个月时施用本发明所述生物肥1号、2号和3号，施肥量15克/米²，同时，以施用等量无机肥作为对照组，3个月时对实验组和对照组的白菜进行测评，结果如表2所示。

表2生物肥对白菜生长性能的影响

处理	施肥	株高(cm)	球高(cm)	横径(cm)	叶型指数
						对照组	无机肥	32.2	20.2	14.5	1.6
实验组1	生物肥1号	37.9	24.1	16.2	1.8
						实验组2	生物肥2号	37.5	23.2	15.8	1.7
实验组3	生物肥3号	39.8	26.9	19.0	1.9

从表中的数据可以看出，与对照组相比，施用生物肥的实验组中白菜株高、球高、横径与叶型指数分别提高了16.5％-21.1％，14.9％-33.2％，9％-31％，6.25％-18.75％，增产效果显著。从而说明，本发明生产的包含拜莱青霉VLD-11和/或黑曲霉CCTCC NO:M2015004的生物肥1-3号能有效改善土壤肥力，促进大白菜生长，其肥效显著高于相同施用量的无机肥。

而且，三个实验组中，施用生物肥3号的实验组3的白菜各个指标明显高于施用相同用量生物肥1号和2号的实验组1和实验组2，进一步说明了生物肥中的拜莱青霉VLD-11和黑曲霉CCTCC NO:M2015004共同作用，能够产生协同促进效果，比单一拜莱青霉VLD-11或黑曲霉CCTCC NO:M2015004具有更好的肥效，产生了意料不到的技术效果。

本发明通过拜莱青霉VLD-11和/或黑曲霉CCTCC NO:M2015004固体发酵获得的生物肥，除了能大幅提高土壤肥力，促进作物生长之外，还能有效提高水稻、小麦等作物的育苗质量，进而有利于提高农作物的产量；还能显著降低土壤中重金属的含量，实现污染土壤的有效修复，应用前景广阔。

Claims

1.一种生物肥，其特征在于，所述的生物肥是通过将拜莱青霉（Penicillium bilaji）和/或黑曲霉（Aspergillus niger）进行固体发酵获得的。

2.如权利要求1所述的生物肥，其特征在于，所述的拜莱青霉的保藏编号为CCTCC NO：M2015690。

3.如权利要求1所述的生物肥，其特征在于，所述的黑曲霉的保藏编号为CCTCC NO：M2015004。

4.一种生物肥的生产方法，其特征在于，所述的生产方法包括如下步骤：

1）扩大培养，获得拜莱青霉和/或黑曲霉的液体种子；

2）按10-20%（w/w）的比例将步骤1）获得的液体种子接种到包含秸秆粉、腐植酸、麦麸和稻壳的混合基质中；

3）控制罐温28-30℃，通气量1-3m³/h，罐压0.01-0.05Mpa，间隔6h搅拌一次，转速50-70rpm，搅拌10-15min，发酵5-6天结束，即获得本发明所述的生物肥。

5.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤2）所述的混合基质中秸秆粉、腐植酸、麦麸和稻壳的质量比为6-7：5-8：3-1：1。

6.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于，步骤2）所述的混合基质中秸秆粉、腐植酸、麦麸和稻壳的质量比为6:7:3:1。

7.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤2）所述的所述混合基质的含水率为50-60%。

8.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤2）所述的混合基质的pH为6.0-6.5。

9.权利要求1所述的生物肥在农作物育苗中的应用。

10.权利要求1所述的生物肥在土壤修复中的应用。