CN106723077A

CN106723077A - 乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品及其制备方法

Info

Publication number: CN106723077A
Application number: CN201611077510.4A
Authority: CN
Inventors: 夏明�
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明属于食品加工技术领域，涉及一种乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品及其制备方法。包括以下步骤：A、制备酶解底物，将乳蛋白原料与水混合后进行杀菌，冷却后调节至适宜pH；B、水解，在最适的温度和pH下，加入蛋白酶开始反应，当水解度达到2‑15％时，灭酶以终止反应；C、膜分离，水解液使用截留分子量为3000‑10000Da的超滤膜作超滤处理；D、调配，取水解液或超滤后的透过液，或两者组合，加入1‑8％的水溶性膳食纤维，及适量复合甜味剂；E、杀菌，将调配液在121℃杀菌15‑20min，或UHT杀菌，亦或直接在121℃杀菌15‑20min后，得到产品。本发明可补充人体所需蛋白质，并对肠道微生态具有调节作用。

Description

乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品及其制备方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，涉及以乳蛋白为原料生产的生物活性多肽，尤其涉及一种具备肠道微生态调节功能的保健品及其制备方法。

背景技术

乳蛋白源性生物活性多肽是以乳蛋白为原料，经蛋白酶水解以后的产物，乳蛋白源性生物活性肽不仅可以提供人体所需的蛋白质营养，同时还具有多种生理调节功能，因而是多种功能性食品组成成分。

肠道微生态是人体与肠道菌群之间构成的微生态系统，这一系统中，各种微生物保持着种类和数量的动态平衡，当人体消化机能削弱、某些种类微生物受到抑制或某些种类微生物过度生长时，肠道微生态平衡就被破坏，出现腹泻、便秘、消化不良等肠道菌群失常现象。

乳源性生物活性肽中与肠道微生态关系最密切的是抗菌肽和多肽类双歧因子。抗菌肽是一类氨基酸残基数量小于100，且通常带正电荷的多肽，大部分抗菌肽的分子量在3000Da左右，抗菌肽对于肠道内机会型致病菌有抑制作用，但是肠道益生菌对抗菌肽却不敏感。多肽类双歧因子一般为含有二硫键的多肽，能够促进双歧杆菌等益生菌的生长，但是对于肠道内机会型细菌没有作用。

然而，由于人体内的消化酶系的存在，乳蛋白源性的活性肽在到达小肠末端前已经被大部分降解，丧失了其生理调节功能。即使对于胃肠道消化功能不良的人群而言，乳蛋白源性活性肽虽然可以到达小肠末端，但由于乳蛋白的水解产物中多肽的组成相当复杂，当它们被用作肠道微生物生长所需的营养物质时，既能促进益生菌的生长，也能促进肠道机会型细菌的生长，这就干扰了乳蛋白源性抗菌肽和多肽类双歧因子对肠道微生态调节功能的发挥。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，通过多种手段的结合，提供一种口感好，能够直接作用于肠道菌群并发挥肠道微生态调节功能的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品。

本发明的另一目的是提供一种乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、制备酶解底物，将乳蛋白与水混合，待乳蛋白吸水溶胀后杀菌，冷却后使用酸或碱调节至适宜pH，得到酶解底物，

B、水解，调节酶解底物的温度至酶反应的适宜温度，加入蛋白酶开始反应，使用碱液调节pH使酶反应维持在适宜pH，得到水解液，

C、膜分离，降低水解液温度至常温，调节水解液的总固形物浓度为1-5％，用超滤膜作超滤，得到透过液和残留液，透过液指在超滤中能透过超滤膜的溶液，残留液指在超滤中没有能透过超滤膜的蛋白质和多肽构成的溶液，

D、调配，取步骤B的水解液经浓缩或稀释后调节总固形物浓度2-6％，加入1-8wt％的水溶性膳食纤维，加入适量复合甜味剂调节口味，得调配液，

或者取步骤C的透过液，经浓缩或稀释后调节总固形物浓度2-6％，加入1-8wt％的水溶性膳食纤维，加入适量复合甜味剂调节口味，得调配液，

或者分别取若干步骤B和步骤C的水解液和透过液混合，经浓缩或稀释后调节总固形物浓度2-6％，加入1-8wt％的水溶性膳食纤维，加入适量复合甜味剂调节口味，得调配液，

E、杀菌，将调配液高温杀菌，即得乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品。

在上述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品及其制备方法中，步骤C为可选步骤，但是如在步骤A中使用了酪朊酸钠或在步骤B中得到的水解液在20℃时的粘度超过100mPa·s时，则不可以使用该步骤。

在上述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法中，在步骤A中，所述的乳蛋白含量为1-16wt％，pH调节至6.0-8.0，在步骤B中，蛋白酶的添加量按1-1000U/g乳蛋白计，pH维持在7.0-8.0之间，在步骤C中，所述的超滤膜为截留分子量为5000-10000Da的超滤膜。其中U为酶活力的单位，是指在25℃下，在1min内能转化底物中1μmol的酰胺键的酶量。

在上述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法中，在步骤E中，采用UHT杀菌或在121℃下保温15-20min杀菌。

在上述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法中，在步骤E中，将调配液装入容器中，密封后在121℃杀菌15-20min；或调配液直接在121℃杀菌15-20min后，在无菌条件下灌入经高温消毒处理的西林瓶或安瓿瓶中密封；或调配液用UHT杀菌器杀菌后在无菌条件下灌入经高温消毒处理的西林瓶或安瓿瓶中密封。

在上述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法中，在步骤A中，所述的乳蛋白包括酪蛋白、酪朊酸钠和乳清蛋白中的一种或几种。

在上述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法中，在步骤B中，所述的蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶中的任意一种或几种。某些蛋白存在不能完全溶解的情况，不影响产品的生产。

在上述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法中，在步骤D中，所述的水溶性膳食纤维包括聚葡萄糖、抗性糊精、低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、聚半乳糖醛酸和羧甲基纤维素钠的任意一种或几种，所述的复合甜味剂为天然甜味剂或天然甜味剂与人工合成甜味剂的组合。

在上述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法中，当步骤A的乳蛋白本身不含有还原糖时，复合甜味剂的组成中必须包含还原糖，所述的还原糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖和麦芽糖中的一种或几种组合。

在上述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法中，在步骤C中，还包括将残留液浓缩至干得回收蛋白的步骤，回收蛋白用于下一次制备酶解底物。

在上述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法中，在步骤B中，当水解度达到2-10％时，用高温灭酶，终止反应。如果使用的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶中的一种或几种，如需终止酶反应，应将水解液的pH调节到7，并升高反应液温度灭酶；如果使用的蛋白酶不包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶的任意一种或几种，采用升高反应液温度的方法灭酶以终止反应。

水解度的定义为：

根据上述的制备方法制得的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

1、充分保留了乳蛋白的营养功能和利用了乳源性生物活性肽的功能特性，原料利用率高，适宜乳糖不耐的人群食用。

2、通过控制水解程度提高了抗菌肽和多肽类双歧因子在乳蛋白水解产物中的比例，避免了过度水解造成的功能性多肽降解的情况。

3、利用抗菌肽和多肽类双歧因子集中分布于1000-5000Da这一分子量区间的特性，通过膜分离的手段筛选掉分子量较大的蛋白质和多肽，小分子的多肽在食用后可以借助人体正常消化与吸收功能在小肠内被吸收掉，使得最终到达小肠末端的抗菌肽和多肽类双歧因子的比例大幅提高。

4、通过加入水溶性的膳食纤维以保护抗菌肽和多肽类双歧因子不被人体自身的消化酶系降解，同时水溶性膳食纤维对于双歧杆菌的生长也有一定促进作用。

5、在还原糖存在下，在中性或弱碱性条件下对产品进行高温杀菌，除了杀灭产品中的微生物之外，还可以促使美拉德反应的发生，导致包括赖氨酸残基在内的一些氨基酸残基产生化学变化，抑制抗菌肽和多肽类双歧因子在肠道内的降解。

具体实施方式

实施例1

一种乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，包括以下步骤：

浓缩乳清蛋白粉与水混合，使混合液的总固形物浓度为15％，待浓缩乳清蛋白溶解并吸水溶胀后，加热到62～65℃，保持30min，冷却后用NaOH溶液调节pH至7.0，获得酶解底物。

调节酶解底物的温度至50℃，按照20U/g底物的量加入中性蛋白酶开始反应，反应中使用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH，使其pH保持在7.0，当水解度达到6％时，升高反应液温度至99℃以终止反应，得到水解液。

降低水解液温度至常温，加水调节水解液的总固形物浓度为5％，使用截留分子量为5000Da的超滤膜作切向流超滤，收集透过液，当残留液总固形物浓度上升为10％时，终止超滤操作。

取透过液，经蒸发浓缩，使其总固形物浓度达到6％，加入6％的低聚果糖，再加入1％的葡萄糖和4％的蔗糖，得调配液。

将调配液在121℃杀菌15min，在无菌条件下灌入西林瓶中，密封后，即得乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品。

所得的产品为甜味的液体，总固形物浓度约17％，其中多肽含量约6％，成年人每天服用40mL，可以显著起到改善肠道微生态的作用。

实施例2

将低粘度酪朊酸钠与热水混合，混合液中酪朊酸钠的浓度为4％，搅拌使酪朊酸钠充分吸水溶胀成为胶状溶液，迅速加热到75～90℃，保温15～16s，冷却后用乳酸溶液调节pH至6.0，获得酶解底物。

调节酶解底物的温度至65℃，按照10U/g底物的量加入木瓜蛋白酶开始反应，反应中使用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH，使其pH保持在6.0，当水解度达到5％时，进一步调高pH至7.0以上，加热反应液至沸腾，得到水解液。

趁热向反应液中加入5％的低聚木糖，1％的聚葡萄糖，1％的果糖，0.05％的甜蜜素和0.01％的安赛蜜，得调配液。

趁热将调配液分装到玻璃瓶中，旋上铁盖密封，在121℃杀菌20min，即得乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品。

所得产品为甜味的液体，总固形物浓度约11％，其中多肽含量约4％，成年人每天食用60mL，可以显著起到改善肠道微生态的作用，糖尿病人也可以适量食用，

实施例3

将干酪素与浓缩乳清蛋白粉按照3:7(W/W)的比例混合，而后加入10倍质量的热水，搅拌使蛋白吸水溶胀，混合液的总固形物浓度为15％，待蛋白质吸水溶胀后，加热到62-65℃，保持30min，冷却后用NaOH溶液调节pH至8.0，获得酶解底物。

调节酶解底物的温度至55℃，按照40U/g底物的量加入复合酶(胰蛋白酶：碱性蛋白酶的酶活比为1:1)开始反应，反应中使用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH，使其pH保持在8.0，当水解度达到5％时，升高反应液温度至95℃以终止反应，得到水解液。

降低水解液温度至常温，加水调节水解液的总固形物浓度为3％，使用截留分子量为10000Da的超滤膜作切向流超滤，收集透过液，当残留液总固形物浓度上升为8％时，终止超滤操作。

取透过液，经蒸发浓缩，使其固形物浓度达到3％，加入4％的抗性糊精，再加入4％的复配甜味剂(葡萄糖：木糖醇的质量比1:1)，得调配液。

调配液装入蒸煮袋中，密封后在121℃杀菌15min，即得乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品。

所得产品为口味微甜的饮料，总固形物浓度约11％，成年人每天食用200mL，可以起到补充蛋白质营养和改善肠道微生态的作用。

实施例4

A、制备酶解底物，将酪蛋白、酪朊酸钠和乳清蛋白按重量比1:1:1称重复配后与水混合得到混合液，使混合液中固形物含量为1％，待乳蛋白吸水溶胀后用巴斯德杀菌，杀菌后冷却，使用酸或碱调节至适宜pH6.5，得到酶解底物，

B、水解，调节酶解底物的温度至酶反应的适宜温度50-65℃，加入由相等重量的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶组成的复合酶开始反应，其中复合酶的添加量按1U/g乳蛋白计，乳蛋白由上述酪蛋白、酪朊酸钠和乳清蛋白组成，使用NaOH溶液调节pH在7.0-8.0之间，得到水解液，

C、膜分离，降低水解液温度至常温，这里所述的常温是指室温，通常为10-35℃，调节水解液的总固形物浓度为1-5％，也即如水解液的总固形物小于1％，则使用加热浓缩的方法使总固形物浓度为1-5％，如水解液的总固形物大于5％，则使用往水解液中添加水稀释使总固形物浓度为1-5％，

取上述部分调整好浓度的水解液，用截留分子量为7000Da的超滤膜作超滤，得到透过液和残留液，残留液浓缩或烘干，得到回收蛋白，透过液与剩余的水解液混合得到预调配液，

D、调配，取步骤C的预调配液经浓缩或稀释后调节总固形物浓度2-6％，加入1-8wt％的水溶性膳食纤维，加入适量果糖、麦芽糖和/或阿巴斯甜调节口味，得调配液，

E、杀菌，将调配液用UHT在135℃高温杀菌10-30S，杀菌后直接灌入到包装容器中，密封，即得乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品。在该步骤中，也可将调配液在121℃下保温15-20min杀菌。

实施例5

取实施例4中的回收蛋白，与酪蛋白按重量比1:2混合形成复配乳蛋白，取若干复配乳蛋白与水混合，控制乳蛋白含量为16wt％，待乳蛋白吸水溶胀后用巴斯德杀菌，杀菌后冷却，使用酸或碱调节至适宜pH6.0-8.0之间，得到酶解底物，这里所述的酸可以是盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液或柠檬酸溶液等，碱可以是NaOH溶液、KOH溶液等。

将酶解底物升温至62℃，加入1U/g复配的蛋白酶，蛋白酶包括重量比1:2:2的中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，用NaOH溶液调节pH至7.0-7.5，检测当水解度达到2-10％时，用95℃高温灭酶，终止反应，得水解液。

冷却水解液至室温，检测水解液的总固形物含量，并调节水解液的总固形物浓度为1-5％，调节方法同实施例4，用截留分子量为5000-6000Da的超滤膜作超滤，得到透过液和残留液，残留液的处理同实施例4。

取透过液，经浓缩或稀释后调节总固形物浓度4％，加入2wt％的水溶性膳食纤维，加入适量复合甜味剂调节口味，得调配液，调配液高温消毒后灌装得到乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品。

其中，水溶性膳食纤维包括聚葡萄糖、抗性糊精、低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、聚半乳糖醛酸和羧甲基纤维素钠的任意一种或几种，可以单独添加到透过液中，也可以复配后添加到透过液中，复合甜味剂包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖和麦芽糖中的一种或几种组合，添加量按调配液的0.1-5％wt计，按甜味酌情添加。

应用例

一、乳清蛋白水解肽对双歧杆菌和乳酸菌生长的影响

将一定量分离乳清蛋白(WPI)粉溶于水配制成浓度为5％的溶液作为生化反应底物，将底物装入生化反应器中，使用超级恒温水浴往反应器夹层中通入98-99℃循环水并开通搅拌桨搅拌，当反应器温度升高到98℃后保持15min，随后往反应器夹层中通入45℃的恒温循环水，使底物降温到45℃。用0.1mol/L NaOH调pH至8.0，依照乳清蛋白粉加入量的5％(W/W)的比例加入云南庞博生物工程有限公司生产的碱性蛋白酶，并开始反应计时。

使用pH探头在线测定反应液的pH，在反应过程中随时滴加0.1mol/L NaOH以维持pH稳定，并控制温度误差不超过1℃，pH误差不超过0.1。反应40min后，调高循环水浴温度，使夹层反应器中反应液的温度迅速上升到90℃以上，维持15min以钝化酶，随后将反应液冷却。将冷却后的反应液于70℃下旋转蒸发至有大量固体析出，而后冷冻干燥得乳清蛋白水解多肽。

将大豆去皮并干燥后粉碎得大豆干粉，以5.3％大豆干粉，4％的高果玉米糖浆和0.5％的乳清蛋白水解多肽作为(以总固形物计)发酵底物，将发酵底物装入发酵罐中用0.1MPa的高压蒸汽灭菌15min，随后冷却至38℃，按照0.03％的接种量(以菌种干粉/发酵底物中总固形物)加入丹尼斯克生产的YO-MIXTM Vegetal乳酸菌系，按照0.15％的接种量(以菌种干粉/发酵底物中总固形物)加入丹尼斯克公司提供的乳双歧杆菌，在38℃厌氧发酵6h，在线监测pH，发酵完成后，使用GB/T 4789.35-2010的方法，检测最终产品中的乳酸菌和双歧杆菌数量。对照组的培养基中不加入乳清蛋白水解多肽，其余操作同上。

加入乳清蛋白水解多肽后的发酵底物，乳酸菌发酵产酸的速率明显上升，最终所能达到的pH也比不添加乳清蛋白水解多肽的对照组更低。

将乳清蛋白的水解肽，加入到发酵底物中，使用乳酸菌和双歧杆菌进行混合发酵，培养6h后乳酸菌的量为未添加乳清蛋白水解肽的对照组的4倍，双歧杆菌的量为未添加乳清蛋白水解肽的对照组的1.46倍，说明为乳清蛋白水解肽对于乳酸菌和双歧杆菌的生长有明显的促进作用，并可以提高发酵过程中酸的产量。见表1。

表1 6h后发酵液中的乳酸菌和双歧杆菌数量

二、乳酪蛋白水解多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的影响

在酶反应器中，以质量比32:1000的比例加入酪蛋白和水作为反应底物，并用超级恒温水浴往酶反应器夹层中通入恒温循环水，使底物的温度达到44℃，随后滴加1mol/L的NaOH溶液，调节反应底物的pH达11左右，开通磁力搅拌，使酪蛋白的溶解，随后用1mol/L的磷酸，将反应底物的pH调至7.4。按照酶底比2.5％的比例加入混合酶制剂，混合酶制剂由胰蛋白酶和中性蛋白酶以质量比1：1的比例复配而成，开始酶解反应。反应过程中用pH计监控pH值的变化，并随时滴加0.1mol/L的NaOH使pH的变动范围为7.4±0.1。反应进行60min后，将反应物从酶反应器中移出，并迅速加热至沸腾，保持沸腾状态5min灭酶。灭酶后的反应液，即为乳酪蛋白水解多肽溶液，将该溶液装入冰箱内备用。经测定，此溶液中乳酪蛋白的水解度约为15％。

取装有8mL PYG培养基(蛋白胨1％、牛肉浸膏0.3％、NaCl 0.5％)的大试管40支，分为四组，每组10支，分别标记为大肠杆菌实验组、大肠杆菌对照组、金黄色葡萄球菌实验组、金黄色葡萄球菌对照组。在各实验组中加入1mL乳酪蛋白水解多肽溶液，各对照组加入生理盐水1mL，用紫外线杀菌20min，随后在大肠杆菌实验组和大肠杆菌对照组大试管中各加入大肠杆菌的菌悬液1mL，菌悬液中大肠杆菌量为10⁶-10⁷CFU/mL，在金黄色葡萄球菌实验组和金黄色葡萄球菌对照组大试管中各加入金黄色葡萄球菌的菌悬液1mL，菌悬液中金黄色葡萄球菌的量为10⁶-10⁷CFU/mL。将上述试管用无菌橡胶塞密封后移入空气浴摇床，在37℃下培养8h，而用分光光度计在560nm下的测吸光度并计算抑制率。

结果表明，乳酪蛋白经胰蛋白酶和中性蛋白酶组成的混合酶水解，当水解度达到15％时，产生的酪蛋白水解多肽，加入到PYG培养基中，可以抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的增殖，37℃下培养8h后抑制率分别为31％和76％。

三、乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品对肠道乳酸菌和双歧杆菌的影响

SPF级C57小鼠30只，5周龄，雄性，体重18±2g，购自浙江中医药大学实验动物中心，按照下表2的流程进行饲养和灌胃操作。

表2

A：纯净水灌胃，一天两次，每次0.4mL

B：双歧杆菌三联活菌胶囊加水稀释至10⁵CFU/mL，作为小鼠的饮用水，早晚各更换一次。

C：6％乳清蛋白、6％的低聚果糖、1％的葡萄糖和4％的蔗糖配制成溶液，一天2次，每次0.4mL

D:实施例2中制备的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品，一天两次，每次0.4mL

E:头孢曲松钠400mg/mL,一天2次，每次0.4mL

适应性灌胃时间设定为7天，各组均灌胃纯净水，主要目的是防止小鼠因运输、不适应环境、灌胃紧张等造成的肠功能紊乱对实验结果造成干扰。适应期结束后称重并分组，随机分为5组，每组6只，随后开始第一阶段(7天)喂养。第一阶段喂养结束后，称重并收集粪便进行检测，每只小鼠收集约0.5g粪便。待粪便收集完成后，使用头孢曲松钠灌胃2天造成肠道菌群失调模型，随后进行为期3天的第二阶段喂养，第二阶段喂养结束后，称重并收集粪便进行检测，每只小鼠收集约0.5g粪便。待粪便收集完成后，拉颈处死并解剖，测定盲肠指数。

将粪便样本小心切开，尽可能从中心挖取0.2g，装入无菌试管中，加入无菌生理盐水4.8mL，涡旋振荡使之匀质化，再按比例稀释后依照GB/T 4789.35-2010的方法进行双歧杆菌和乳酸菌计数。

表3 第一阶段喂养结束后的情况

经过7天的第一阶段喂养后，喂饲乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的干预组小鼠的体重平均增长率为10.82％，明显高于空白组8.27％，说明该保健品具有改善小鼠营养状况并促进生长的功能，但是干预组小鼠的平均体重增长率要低于喂饲乳清蛋白及碳水化合物的对照组2，这是由于经过高温处理后的多肽，不容易被小鼠自身的消化酶系降解，故不如未处理的乳清蛋白那么容易吸收。经过7天的第一阶段喂养后，干预组小鼠粪便中的双歧杆菌数量明显高于空白组和各对照组，达到5.0×10⁹CFU/g，说明乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品有促进肠道双歧杆菌增殖的作用。此外，干预组粪便中的乳酸菌数量达到对照组2的2.6倍，说明乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品比乳清蛋白与碳水化合物的简单组合，更有利于乳酸菌的增殖。

表4 第二阶段喂养后各组粪便双歧杆菌数量

组别	空白组	模型组	对照组1	对照组2	干预组
						双歧杆菌数量CFU/g	2.0×10²	未检出	3.7×10⁴	3.6×10⁷	1.4×10⁹

使用亚致死剂量的头孢曲松钠造成小鼠重度肠功能紊乱，造模成功三天后，喂饲乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的干预组，双歧杆菌数量恢复到10⁹CFU/g以上，而同期对照组1的双歧杆菌数量仅为3.7×10⁴，说明乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品与双歧杆菌三联活菌的组合使用，对于肠道微生态的恢复作用，要优于单纯使用双歧杆菌三联活菌制剂。

从第二阶段喂养后盲肠指数的情况看，使用头孢曲松钠造成小鼠肠功能紊乱后，喂饲双歧杆菌三联活菌或双歧杆菌三联活菌与乳蛋白的组合，均有利于盲肠指数的下降，但是在饮用水中加入双歧杆菌三联活菌并使用乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品灌胃，其效果要优于单纯使用双歧杆菌三联活菌或乳蛋白与碳水化合物的组合。

四、乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品对脾虚腹泻小鼠的恢复作用

在生化反应器中将干酪素与热水依照3:100(W/W)的比例混合，通过搅拌使蛋白吸水溶胀，而后用0.1mol/L的HCl溶液调节pH至6.0，往生化反应器夹层中通入恒温循环水，使反应器温度保持在55℃，而后按照干酪素：木瓜蛋白酶100:1(W/W)的比例加入木瓜蛋白酶开始反应。用pH计监控反应过程中的pH变化，并滴加0.1mol/L的NaOH溶液使反应液pH维持在6.0±0.1。3h后加入1mol/L的NaOH溶液，使pH升高到7.0以上，并升高循环水温，使生化反应器温度达到95℃以上，维持该温度半小时灭酶以终止反应。待反应液冷却后用纱布过滤除去不溶物，而后将反应液装入切向流超滤系统中，用密理博公司生产的截留分子量为10000Da的超滤膜作超滤处理，收集透过液，并不断向残留液中补充纯净水，待透过液在280nm下的紫外吸收与纯净水的紫外吸收之差小于0.01时，终止超滤操作，将透过液在75℃下真空浓缩至有少量沉淀析出，而后进行冷冻干燥，得到中低分子量酪蛋白水解多肽。

将厚朴15g、枳实12g装入砂锅，加水1000mL，煎至约500mL,去滓后加入大黄12g，再煎至约250mL，去滓后加入芒硝9g，再煎约5min，得大承气汤。

SPF级昆明种小鼠20只，雄性，5周龄，随机分为两组，分别为模型组和干预组，每组10只，适应性喂养4周，每天灌胃2次，每次0.5mL生理盐水。适应性喂养结束后，两组均灌胃大承气汤，每次0.5mL，每天2次。待发现小鼠出现腹泻症状后，间隔1h再灌胃一次大承气汤，视为造模成功。造模成功后的模型组小鼠，每天灌胃2次，每次0.5mL生理盐水。干预组小鼠，每天灌胃2次，每次0.5mL浓度为16％的中低分子量酪蛋白水解多肽溶液。当小鼠能稳定排出干便后，视为已经恢复，记录恢复的时间。

表5 小鼠腹泻恢复时间

对于使用大承气汤制造的脾虚腹泻小鼠而言，腹泻症状消失时间缩短，在造模成功第三天时，灌胃中低分子量酪蛋白水解多肽溶液的小鼠，已均为干便，而同期模型组仍有30％为稀便，表明中低分子量酪蛋白水解多肽溶液有利于促进腹泻的恢复。

综上所述，以乳清蛋白为原料的水解肽，体外实验能促进双歧杆菌和乳酸菌的生长，培养6h后比未添加组菌落数多40％。以乳酪蛋白为原料的水解肽，体外实验可抑制大肠杆菌，金黄色葡萄球菌生长，抑制率分别为31％和76％。动物实验表明，使用实施例1中的产品对C57小鼠喂养一周后，小鼠粪便中双歧杆菌数量明显高于未喂养的组别，乳酸菌的菌落计数增加了2.6倍。对于使用头孢曲松钠建立的肠功能紊乱模型而言，建模三天后双歧杆菌数量恢复到5.0×10⁹个/克(粪便中)。解剖后盲肠指数比非干预组降低。对于使用大承气汤制造的脾虚腹泻小鼠而言，腹泻症状消失时间缩短，表明促进了腹泻恢复。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims

1.一种乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

C、膜分离，降低水解液温度至常温，调节水解液的总固形物浓度为1-5％，用超滤膜作超滤，得到透过液和残留液，

2.根据权利要求1所述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，其特征在于，在步骤A中，所述的乳蛋白含量为1-16wt％，pH调节至6.0-8.0，在步骤B中，蛋白酶的添加量按1-1000U/g乳蛋白计，pH维持在7.0-8.0之间，在步骤C中，所述的超滤膜为截留分子量为5000-10000Da的超滤膜。

3.根据权利要求1所述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，其特征在于，在步骤E中，采用UHT杀菌或在121℃下保温15-20min杀菌。

4.根据权利要求3所述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，其特征在于，在步骤E中，将调配液装入容器中，密封后在121℃杀菌15-20min；或调配液直接在121℃杀菌15-20min后，在无菌条件下灌入经高温消毒处理的西林瓶或安瓿瓶中密封；或调配液用UHT杀菌器杀菌后在无菌条件下灌入经高温消毒处理的西林瓶或安瓿瓶中密封。

5.根据权利要求1所述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，其特征在于，在步骤A中，所述的乳蛋白包括酪蛋白、酪朊酸钠和乳清蛋白中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述的蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶中的任意一种或几种。

7.根据权利要求1所述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，其特征在于，在步骤D中，所述的水溶性膳食纤维包括聚葡萄糖、抗性糊精、低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、聚半乳糖醛酸和羧甲基纤维素钠的任意一种或几种，所述的复合甜味剂为天然甜味剂或天然甜味剂与人工合成甜味剂的组合。

8.根据权利要求1所述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，其特征在于，当步骤A的乳蛋白本身不含有还原糖时，复合甜味剂的组成中必须包含还原糖，所述的还原糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖和麦芽糖中的一种或几种组合。

9.根据权利要求1所述的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品的制备方法，其特征在于，在步骤B中，当水解度达到2-10％时，用高温灭酶，终止反应，在步骤C中，还包括将残留液浓缩至干得回收蛋白的步骤，回收蛋白用于下一次制备酶解底物。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的制备方法制得的乳蛋白源性肠道微生态调节肽保健品。