CN106718179B - 一种转基因青蒿的环境安全评价方法 - Google Patents

Abstract

一种转基因青蒿的环境安全评价方法，该方法对转基因青蒿的农艺性状、抗逆性以及基因漂移进行测试，同时以野生型受体青蒿作对照，评估中设置的参数涵盖了转基因青蒿和其野生型受体差异性的各指标，为转基因青蒿的环境释放建立了模型，在说明两者实质等同性上具有重要示范意义，本发明从以上三个方面建立的评价体系操作简单，易于实现，直观性强，结果准确性高，该方法对转基因青蒿的环境安全评价提供了待测指标，为转基因青蒿品种的商业化风险评估提供了技术支撑。

Description

一种转基因青蒿的环境安全评价方法

技术领域

本发明属于转基因植物的安全评价领域，具体涉及一种转基因青蒿的环境安全评价方法。

背景技术

疟疾(malaria)是由疟原虫所致的虫媒传染病。疟疾流行于102个国家和地区，据世界卫生组织(WHO)估计，有20亿人口居住在疾病区，特别是在非洲、东南亚和中、南美洲的一些国家，恶性疟死亡率极高。非洲地区的世界卫生组织(WHO)对这种疾病的负担是最重的，估计所有死亡中有90％的人死于疟疾，而5岁以下的儿童占因疟疾死亡的78％。

目前，对疟疾最有效的治疗方法是以青蒿素为基础的联合疗法。青蒿素是从青蒿中分离出的倍半萜内脂药物，但青蒿的青蒿素含量很低，而青蒿素的人工合成则成本高，价格昂贵。

利用基因工程方法是一种很有望提高青蒿素产量的方法，近年来，青蒿素生物合成的分子调控机制研究取得了显著性进展，青蒿素的生物合成途径中的几种编码关键酶基因，包括ADS，AaWRKY1，CYP71AV1和CPR，已经从青蒿中克隆。如：在唐克轩教授实验室，通过农杆菌介导的转化，转入CYP71AV1和CPR基因，获得了转基因青蒿GYR，该品系显著增加了青蒿素的含量。在商业化之前，转基因植物应该在环境释放实验中进行环境安全评价。

然而，转基因(GM)植物的培育中，由于其潜在的生态及人类健康风险而受到关注，虽然在基因工程中只插入了一小段外源DNA序列，但是由此产生的新型的有机体可能导致杂草化或者环境生存的不耐受性，并且影响到生态环境等。因此，转基因植物的抗逆性和生存能力的问题，必须进行系统的环境安全评价。转基因植物在环境释放和商业化中仍有许多问题还没有答案。

我国农业部(MOA)在1996年实施了转基因法规，在商业化前，所有实验研究、田间试验和环境释放的相关的生物安全评价都要求由转基因生物安全委员会进行评估。

到目前为止，许多的转基因植物已经进行了田间试验，并且，有些已经商业化；然而，评估转基因青蒿在环境释放中的实验仍未见报道研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因青蒿的环境安全评价方法，从形态学差异性、抗逆性以及基因漂移三个方面建立评估参数体系，本发明从以上三个方面建立的评价体系操作简单，易于实现，直观性强，结果准确性高，为转基因青蒿品种的商业化种植及评估提供了技术支撑。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种转基因青蒿的环境安全评价方法，包括以下步骤：

1)农艺性状形态学测定

将转基因青蒿植株从温室内移栽至大田种植区域内，移植3-4个月后，测定植株的形态学参数，同时，以野生型青蒿作对照；

2)抗逆性评价

在温室中进行转基因青蒿的盐胁迫、干旱胁迫、除草剂耐受以及越冬能力评价，同时，以野生型青蒿作对照；

3)基因漂移测定

设置矩形实验场来进行基因漂移试验，其面积不低于5亩，含外源基因的转基因青蒿种植于中心点及其4-7个同心圆中，同心圆的半径从内到外以0.8-1.4m逐个增加，矩形实验场的最短边长应是同心圆最大半径的4-9倍，同心圆外种植野生型青蒿，同时，在该矩形实验场周围设置物理隔离区；

在野生型受体青蒿种植区内，沿同心圆的8个以上方向设置不少于72个测试点，呈米字形，收获各测试点的青蒿种子，测定种子发芽率、并进行卡那霉素抗性筛选，对于抗卡那霉素的植株利用PCR方法进一步验证其是否含有插入的外源基因。

进一步，步骤1)所述的生长形态参数为株高、冠幅、茎粗、种子发芽率、叶片干重、千粒重和叶片形状。

又进一步，所述步骤1)中的生长形态参数中，对于株高、冠幅和茎粗，在植株的营养生长早期和中期分别测定；对于种子发芽率的测定过程为：取等量的转基因青蒿种子，清洗后分别播种至基质、水以及无菌培养基中，培养7-15天，按下式统计种子发芽率；

种子发芽率＝(发芽种子数/播种种子数)×100。

又，步骤1)所述农艺性状形态学参数中，千粒重的测定过程为：收集30-50株植株的种子，数出1000粒并测定种子的千粒重。

进一步，步骤2)中，盐胁迫测定中，测定了叶片的相对含水量、过氧化物酶活性、游离脯氨酸和丙二醛含量；干旱胁迫实验在添加了PEG胁迫中进行，测定干旱胁迫中青蒿叶片中的游离脯氨酸、株高和复叶数差值；除草剂耐受性中所述的除草剂为非选择性除草剂和选择性除草剂。

优选地，步骤3)中所述的矩形实验场的宽度不低于长度的1/2，在该矩形实验场周围种植玉米隔离带作为物理隔离区。

进一步，步骤3)中，一个方向由内到外设置8～14个测试点，其中，测试点1～5之间每两点间隔0.8m，测试点6～10之间每两点间隔2.4m，测试点11～14之间每两点间隔4.8米。

又优选地，步骤3)中，收获的青蒿种子来自植株的顶部、中部和下部，均匀采收。

进一步，步骤3)中，抗卡那霉素的植株被移植到穴盘壮苗后，生长15-25天后，从每株幼苗上选取3-5片叶片进行DNA的提取。

进一步，步骤3)中，导入了外源基因CYP71AV1和CPR的转基因青蒿的基因漂移距离为29.2m。

通过基因工程提高青蒿中青蒿素的含量时，使参与青蒿素生物合成的限速酶基因进行过量表达是必不可少的，在提高了青蒿素产量的转基因青蒿植物中，CYP71AV1和CPR基因进行了过量表达，然而，转基因青蒿对于环境的影响是未知的，因此，本发明从农艺性状、抗逆性以及基因漂移等几个方面，来探讨转基因青蒿GYR和野生型受体是否具有相似的生存竞争能力。

本发明中，依据个案分析原则，设置了形态学农艺性状差异性比较、耐盐性、耐旱性、耐除草剂、越冬能力，以及基因漂移方法测定，系统的评价了转基因青蒿的环境释放后带来的问题，设置的参数涵盖了转基因青蒿和其野生型受体差异性的各指标，为转基因青蒿的环境释放建立了模型，在说明两者实质等同性上具有重要意义，评估结果说明转基因青蒿和其野生型受体具有实质等同性，为其商业化生产奠定了基础。

青蒿是异花授粉植物且自交的不亲和性，使得外源基因是很容易被检测出来。因此，转基因和传统植物之间的基因漂移应该同时评估。

本发明的评估方法中，在基因漂移方法的测定中，将转基因青蒿植株作为一个花粉源栽培在圆圈中，可以有效捕捉由于风力或昆虫的携带等带来的各个方向的基因漂移，在监测基因漂移距离上有很好的示范作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明通过对转基因青蒿和其野生型受体的形态学差异性、生存竞争能力、以及基因漂移等几个方面进行了转基因植物的环境风险评估，为转基因药用植物青蒿的环境安全评价平台的建立提供了参考。

本发明涵盖了转基因青蒿从实验室层次进入商业化生产的环境释放这个必经过程，并且，在进行安全性评价的过程中，遵从了转基因植物环境安全评价的原则。即进一步评价了转基因青蒿对环境的影响；又根据个案分析原则，评价了其形态学农艺性状差异性、与环境适应能力、生存竞争能力、成为杂草的可能性以及其外源基因遗传物质向其他植物发生转移的可能性及其后果。为其它转基因植物的安全性评价体系的建立，提供了有益的参考模型，旨在为转基因青蒿环境安全性评价提供依据。

附图说明

图1为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的株高评价结果。

图2为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的茎粗评价结果。

图3为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的冠幅评价结果。

图4为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的发芽率评价结果。

图5为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的叶片干重评价结果。

图6为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的种子千粒重评价结果。

图7为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的盐胁迫下叶片含水量的测定结果。

图8为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的盐胁迫下过氧化物酶含量的测定结果。

图9为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的盐胁迫下丙二醛的测定结果。

图10为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的盐胁迫下脯氨酸含量的测定结果。

图11为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的干旱胁迫下脯氨酸含量的测定结果。

图12为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的干旱胁迫下复叶数差值的测定结果。

图13为本发明实施例中转基因青蒿与野生型受体青蒿的干旱胁迫下株高差值的测定结果。

图14为本发明实施例中的基因漂移种植图。

图15为本发明实施例中的外源基因漂移点电泳图。

图16为本发明实施例中的基因漂移距离频率图。

图17为本发明实施例中的基因漂移距离图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

转基因青蒿GYR品系由上海交通大学的唐克轩教授友情提供，农杆菌介导转化的青蒿由唐教授的实验室采自重庆(Wang et al.,2012)，并且，野生型受体的青蒿野生型受体被用作对照。

转基因青蒿GYR和野生型受体种于在上海农业科学院的白鹤转基因植物环境释放试验基地，对转基因植物的环境风险评估是经中国农业部授权的。该基地位于上海的西北部青浦地区。它有亚热带季风气候，四季分明，充足的日照和雨量，适合青蒿植株的生长。该基地周围有混凝土墙，确保物理隔离。

温室部分在上海农业部的转基因作物的环境安全监督检验测试中心进行试验，并且温度维持在25℃。土壤介质包含比例为7：2：1的有机质、蛭石和珍珠岩。在这个温室中没有其它的转基因植物。整个实验室由一名保安进行监督，并在实验结束后烧毁所有的实验材料。

实施例一种转基因青蒿的环境安全评价方法，包括以下步骤：

1.准备农艺性状评估用实验场地

按照中国转基因生物安全评估法规，青蒿被种植在一个矩形实验场地中，覆盖面积约0.3公顷，其中长100m，宽30m；野生型受体玉米被种植在每个区域的周围用来隔离GYR和野生型受体；所有植物在相应区域根据常规方法进行栽培，每个区域约种2304株(行间距为1.25m)。

2.检测农艺性状

转基因青蒿GYR和野生型受体在温室生长2个月，然后移植至大田内继续生长，移植后，对死亡幼苗的数量进行计算。移植三个月后，对转基因青蒿GYR和野生型受体植株的生长和形态进行比较，记录其株高、冠幅、茎粗、发芽率、叶片干重、千粒重和叶片形状，具体如下：

2.1株高、冠幅和茎粗

对青蒿的田间试验，采用一个完全随机区组的单因素设计。在每个区域中随机抽取40株青蒿，用来确定营养生长早期和中期阶段(两个阶段间隔1个月)的株高、冠幅和茎粗。

两种青蒿在田间环境下移栽后基本上都顺利成活，移栽存活率无显著差异。转基因青蒿GYR品系移栽后的生长发育进程与其野生型受体相似，均可分为缓苗期、营养生长盛期、花芽分化与初蕾期、盛蕾与初花期、盛花期和结实期6个阶段。

两种青蒿在八月份九月份生长最快，在青蒿营养生长后期，株高、冠幅、茎粗均快速增长，参见图1-图3。

由图1-图3可以看出，GYR的株高显著高于野生型受体，茎粗显著低于其野生型受体。然而，这两个品种的生长趋势是一致的。

2.2发芽率

发芽率的测定过程为：将两种青蒿品种的种子先用洗涤剂洗，再用蒸馏水彻底冲洗，转基因青蒿和野生型受体青蒿各取100粒种子，播种在装有基质的托盘中(所述基质为：土壤：蛭石：珍珠岩＝7：3：1)，另取100粒种子播种在蒸馏水中，并且，还有100粒种子播种在无菌培养基中。在25℃培养7天后，用下式计算不同发芽环境下每个品种的发芽率：

种子发芽率(％)＝(发芽种子数/全部种子数)×100。

结果参见图4，可见，三种方式的发芽试验中无菌培养发芽率最低，水培和土培高于无菌发芽方式，均在85％以上。但同一种培养方式下，转基因青蒿的发芽率与其受体的发芽率相似的，无差异性。

2.3叶片干重

叶片干重的测定为：在开花阶段，随机挑选10片植物顶端的叶片，然后放在105℃烘箱中0.5h，迅速烘干水分。最后，叶片在70℃被干燥得到一个恒定的重量，并记录这一干重数，这个步骤重复3次，参见图5。

由图5可见，两种植物的叶片干重有明显的差异，GYR叶片干重远高于野生型受体，可能是由于GYR叶片较肥厚且大的原因造成的。两种类型的青蒿叶片形状均为三回栉齿状羽状分裂，并且叶片的形态学没有改变。

2.4千粒重

为了比较种子的千粒重，将30株植物的种子收集起来进行测定，因为青蒿的种子太小以至于很难收集，故使用20目的筛网进行杂质过滤，再进行冲洗，最后进行千粒重数测，参见图6。

由图6可知，两株植物间的千粒重并无明显差异。

农艺性状测试结果说明，转基因青蒿GYR和传统的野生型受体植物间在形态学(株高，冠幅，茎粗)方面没有明显的不同，可以推断插入的基因没有改变青蒿的农艺性状。

3.测试抗逆性

在在温室中进行抗逆性实验，对转基因青蒿进行盐胁迫、干旱胁迫、除草剂耐受性以及越冬能力测定，同时，以野生型受体青蒿作对照，具体如下：

3.1盐胁迫测试

设置五个胁迫组，每组6个植株，在植株5周时开始，用添加了NaCl的盐溶液进行浇灌，浓度为0，0.4，0.8，1.2和1.6％(w/w)，9天之后，用下述公式对两组胁迫中的植物叶片的相对含水量进行测量，结果参见图7：

叶片相对含水量(％)＝[(鲜重-干重)/鲜重]×100。

从图7可以看出，转基因青蒿GYR和野生型受体两种青蒿叶片的相对含水量(RWC)均比较高，范围在94％～87％内。增加盐浓度，相对含水量没有改变。用浓度0.8％(W/W)NaCl处理时，两种青蒿叶片的叶片含水量最低，然而，盐胁迫1.6％(W/W)时，GYR较野生型受体高。相对含水量的结果和叶片干重相吻合。

由此说明，盐处理使这两种青蒿均产生了一定的生理胁迫。大部分青蒿的叶片呈现出不同程度的萎蔫现象。两种叶片的含水量在盐胁迫下均无差异性。

过氧化物酶(POD)活性、游离脯氨酸和丙二醛(MDA)含量也被测定，测定结果参见图8-图10。

图8中，随着NaCl浓度的升高，两种转基因青蒿POD含量出现先上升后下降的趋势。在1.2％NaCl时，POD含量最高，并且GYR的POD含量明显低于野生型受体植物的含量(高达4600OD mg^-1.FW.min^-1)。然而，当NaCl低于0.4％时，GYR青蒿的POD含量显著高于野生型受体。

从图9可以看出，两种转基因青蒿的MDA含量出现先逐渐上升的趋势，然而没有明显的差异，其中1.6％的NaCl胁迫时MDA含量是无胁迫的2.5倍，两种青蒿叶片的MDA含量差异极显著(P＜0.001)。这可能与模式过氧化程度不一样相关。

脯氨酸能够提高植物的吸水能力，这是植物在逆境下的一种自我调节机制，但是，当盐浓度超过其自身调节范围，其植物体内的平衡也将打破，从而导致植物萎蔫。

由图10可见，两种转基因青蒿的脯氨酸含量出现先上升后下降的趋势。两种青蒿在没有盐胁迫时，虽然GYR的脯氨酸含量高于野生型受体，但差异并不显著。盐胁迫存在时，观察到的结果相反。在0.4-1.6％Nacl时，GYR脯氨酸的含量低于野生型受体，并且，当NaCl增加到1.6％时明显不同。

3.2干旱胁迫测试

因PEG6000的分子量大，从而很难被完好无损的根系吸收，因此是干旱胁迫试验中常用的胁迫剂，本实施例测定了在PEG模拟干旱胁迫下叶片脯氨酸的含量。

选取5周龄的植物来评估干旱胁迫影响，PEG6000添加到营养液中诱导干旱胁迫，每个青蒿品种的6株植物被浓度分别为0g/L、50g/L、100g/L、150g/L和300g/L的PEG6000进行胁迫，对干旱胁迫植物的游离脯氨酸含量、植物株高和复叶数差值行了测量，参见图11-图13。

由图11可以看出，在无PEG胁迫时，GYR的脯氨酸含量高于野生型受体，差异不显著。在PEG胁迫5天后，随着PEG浓度的增加，青蒿叶片中的脯氨酸含量只有少许增加。15天后，脯氨酸整体水平升高，高浓度的PEG胁迫，脯氨酸含量升高显著。其中，PEG浓度为300g/L时，GYR的脯氨酸含量高于野生型受体，但并不显著(P>0.05)，且是200g/L野生型受体的2.7倍。15-25天期间，脯氨酸含量变化不明显。25d时，在300g/L PEG胁迫下，GYR叶片的脯氨酸含量达到532.598μg/g(W/FW)，是未受胁迫时的7.97倍。在野生型受体植物中，高达8.51倍。整个实验时期，两种叶片的脯氨酸含量差异均不显著。

高浓度PEG(300g/L)处理25d后，可以明显看到植株底部的叶片出现叶片发黄、卷缩、枝干萎缩的现象，甚至底部枯死。但是低中浓度PEG(100和200g/L)处理后，并未显著影响青蒿的生长，说明青蒿是一种较为耐旱的植物。

图12-图13显示，没有胁迫时，两种青蒿植物表现出了相似的株高差值和复叶数差值，并都能够保持自己的平衡。随着PEG浓度的增加，株高差值表现出不同，生物量与复叶也不同。然而，在胁迫耐受性中转基因青蒿GYR没有表现出比野生型受体更强的生长势，并且没有显著差异。当PEG浓度增加到300g/L时，株高和复叶增量下降。

3.3除草剂耐性

两种除草剂购买于先正达公司(上海，中国)，非选择性除草剂百草枯和选择性芽前除草剂金都尔，用在青蒿的幼叶时期(真叶数≥15)。将百草枯喷到5周龄的植物上，金都尔被喷洒到播种3天后的GYR和野生型受体上。

在喷洒百草枯两小时内，所有的转基因植株和对照植物都被杀死。金都尔是选择性的芽前除草剂，并且在种子萌发前喷洒。两种青蒿都没有发芽，然而，没有喷洒金都尔的对照组青蒿发芽，并且幼苗长势很好。不管是否喷洒金都尔，转基因和对照植物的表现是相似的，这表明，对于两种常见的除草剂，转基因组和对照组的耐受性是相同的。

3.4越冬能力观察

在冬季，将转基因青蒿和野生型受体青蒿种子播种在室外(最低温度-8℃)，进行越冬性实验观察，比较下一代幼苗的生存率和在冬季生存的竞争力。

尽管GYR的越冬能力稍弱于野生型受体植物，但可以在上海的初冬环境下顺利越冬(2℃-5℃)。这可以说明插入的基因对青蒿的越冬能力没有影响。

4.测试基因漂移

在长80m，宽50m的矩形实验场内进行基因漂移实验，转基因青蒿种植于中心点及其5个同心圆中，同心圆的半径从内到外以1.2m逐个增加，其余面积用来种植青蒿野生型受体植株，当青蒿被种植后，将玉米种植在实验场区的周围作为物理隔离区，参见图14。

在野生型受体青蒿种植区内，沿同心圆的8个方向设置98个测试点，呈米字形，一个方向上设置8～14个测试点，其中，测试点1～5之间每两点间隔0.8m，测试点6～10之间每两点间隔2.4m，测试点11～14之间每两点间隔4.8米，参见表1。

采用独立样本t检验用SPSS 16.0和GraphPadPrism v5.0软件对所有数据进行比较分析。

测试种子发芽率：收获各测试点的青蒿种子，青蒿种子收获自植物的顶部，中部和更低的地方，将每个点上收获的种子混合并带到实验室进行后续分析。

从试验地点随机抽取100粒种子，在培养皿中萌发。重复3次，10天后，用SPSS16.0进行数据分析，参见表2。

从表2中可以看出，发芽率比较均匀，且相对较高，可能是新采收种子营养充分，具有较高的发芽率，整个实验的平均发芽率为82.7％。

测试卡那霉素抗性：对于每个试验点，将发芽后的种子随机选取100棵放入带有卡那霉素的1/2MS(Murashige和Skoog)培养基中，进行苗期抗性筛选鉴定试验。在对卡那霉素抗性浓度由25-150mg/L筛选后，发现100mg/L的浓度对青蒿具有较好的选择性，故选用100mg/L作为筛选浓度，将发芽的100棵青蒿幼苗放入1/2MS固体培养基上3d后，幼苗出现不同程度的变黄，6d后，叶子边缘开始出现枯死，10d时最终整株腐烂，可以断定枯死的幼苗为野生型受体幼苗。统计每个试验点100棵中未枯死幼苗数量(统计结果见表3)，得到卡那霉素抗性筛选后成活率。

通过PCR进行分子鉴定：存活的抗卡那霉素的植株被移植到穴盘壮苗，生长20天后，从每株幼苗上选取3-5片叶片进行DNA提取，进行PCR扩增反应，获得扩增产物条带580bp，即为转基因青蒿，参见图15和表4。

当花粉源的距离增加时，在转基因青蒿中的外源基因漂移频率迅速下降，基因漂移距离急剧下降，转基因青蒿GYR品系的基因漂移频率随距离的增加呈线性下降，参见图16-17。

由图16可以看出，在6.8m处基因漂移频率最大，为2.5％，下风口(西方)只有在距离花粉源24.4m处(C-10)能够检测出，但到达29.2m处时则任何一个方向均不能检测到基因漂移。

图17中，测试点C-11的基因漂移是最高的，比频率最低的测试点G-3高7倍，这和秋季上海青浦地区经常刮东北风有关。

由于在距离24.4m的点可以检测到转基因青蒿，29.2m处则不能检测到，因此，可以推出转基因青蒿GYR品系最远漂移距离为24.4m。

通过本发明，可以得知，随着转基因花粉源的距离增加，空气中花粉的密度逐渐降低，同时，野生型受体花粉源的存在大大稀释了转基因花粉源，这也可能导致基因漂移频率快速下降。此外，一些物理因素也可以影响基因漂移频率，包括花粉的运动，风向，风速和纵向分散系数。

同时，在不同的方向，基因漂移的频率是不同的，转基因青蒿可以被栽培在下风口或者使用隔离区隔离，以限制基因漂移。

此外，可以通过调整转基因和野生型受体植物的开花期，使这两种植物不同时开花，大大减少发生基因漂移的可能性，对于转基因青蒿的大规模商业化种植，需要使用物理和生物的隔离来防止花粉的传播。

Claims (6)

1.一种转基因青蒿的环境安全评价方法，包括以下步骤：

1)农艺性状形态学测定

将转基因青蒿植株从温室内移栽至大田种植区域内，移植3-4个月后，测定植株的形态学参数，同时，以野生型青蒿作对照；所述形态学参数为株高、冠幅、茎粗、种子发芽率、叶片干重、千粒重和叶片形状；

其中，所述步骤1)中，生长形态学参数中，对于株高、冠幅和茎粗，在植株的营养生长早期和中期分别测定；对于种子发芽率的测定过程为：取等量的转基因青蒿种子，清洗后分别播种至基质、水以及无菌培养基中，培养7-15天，按下式统计种子发芽率；

种子发芽率＝(发芽种子数/播种种子数)×100；

2)抗逆性评价

在温室中进行转基因青蒿的盐胁迫、干旱胁迫、除草剂耐受性以及越冬能力评价，同时，以野生型青蒿作对照；其中，盐胁迫能力评价中，测定了叶片的相对含水量、过氧化物酶活性、游离脯氨酸和丙二醛含量；干旱胁迫实验时利用PEG模拟干旱状态，并测定干旱胁迫中青蒿叶片中的游离脯氨酸、株高和复叶数差值；除草剂耐受性中所述的除草剂为非选择性除草剂和选择性除草剂；

3)基因漂移测定

设置矩形实验场来进行基因漂移试验，其面积不低于5亩，含外源基因的转基因青蒿种植于中心点及其4-7个同心圆中，同心圆的半径从内到外以0.8-1.4m逐个增加，矩形实验场的最短边长应是同心圆最大半径的4-9倍，同心圆外种植野生型青蒿，同时，在该矩形实验场周围设置物理隔离区；

在野生型受体青蒿种植区内，沿同心圆的8个以上方向设置不少于72个测试点，呈米字形，所述测试点的设置方式为：每个方向由内到外设置8～14个测试点，其中，测试点1～5之间每两点间隔0.8m，测试点6～10之间每两点间隔2.4m，测试点11～14之间每两点间隔4.8米；收获各测试点的青蒿种子，测定种子发芽率、并进行卡那霉素抗性筛选，对于抗卡那霉素的植株利用PCR方法进一步验证其是否含有插入的外源基因。

2.如权利要求1所述的转基因青蒿的环境安全评价方法，其特征在于，步骤1)所述农艺性状形态学参数中，千粒重的测定过程为：收集30-50株植株的种子，数出1000粒并测定种子的千粒重。

3.如权利要求1所述的转基因青蒿的环境安全评价方法，其特征在于，步骤3)中所述的矩形实验场的宽度不低于长度的1/2，在该矩形实验场周围种植玉米隔离带作为物理隔离区。

4.如权利要求1所述的转基因青蒿的环境安全评价方法，其特征在于，步骤3)中，收获的青蒿种子来自植株的顶部、中部和下部，均匀采收。

5.如权利要求1所述的转基因青蒿的环境安全评价方法，其特征在于，步骤3)中，抗卡那霉素的植株被移植到穴盘壮苗后，生长15-25天后，从每株幼苗上选取3-5片叶片进行DNA的提取。

6.如权利要求1所述的转基因青蒿的环境安全评价方法，其特征在于，步骤3)中，导入了外源基因CYP71AV1和CPR的转基因青蒿的基因漂移距离为29.2m。

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