CN101743830A

CN101743830A - 转基因青蒿环境释放试验的栽培管理方法

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Publication number: CN101743830A
Application number: CN200910201073A
Authority: CN
Inventors: 唐雪明; 蒋玲曦; 刘华; 赵凯; 朱宏; 谭芙蓉; 王金斌; 吴潇; 陶世如
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-12-14
Filing date: 2009-12-14
Publication date: 2010-06-23

Abstract

本发明公开了一种转基因青蒿在环境释放试验的田间设计和栽培管理方法，首先将青蒿种子种植于发苗培养基中发苗，然后将青蒿苗移栽于环境释放试验大田中，通过田间设计、合理灌溉、施肥、除草以及病虫害管理，为青蒿的生长提供合适环境条件，并采用随机区组方式种植转基因青蒿和非转基因青蒿材料，测定其基本农艺性状以及目的基因的表达情况。本发明为转基因青蒿未来的商业化生产提供了一定技术支持，并对对转基因药用植物的环境安全评价和未来转基因青蒿的大规模商业化种植具有重要意义。

Description

转基因青蒿环境释放试验的栽培管理方法

技术领域

本发明属转基因植物环境安全评价技术领域，具体涉及一种转基因植物--转基因青蒿环境释放试验的栽培管理方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(Artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中的青蒿素含量非常低(0.01％-1％)，并且青蒿素的结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。

Ling Zhang等在《Biotechnol Appl Biochem》(2009年52期第199-207页)发表了题为“Development of transgenic Artemisia annua plantswith an enhanced content of artemisinin，an effective anti-malarial drug，byhairpin-RNA-mediated gene silencing”(“发夹RNA的基因沉默使青蒿素含量上升的转基因青蒿品种的研发”)的论文，报道通过抑制青蒿素合成的竞争通路来提高青蒿素的产量。然而一种转基因植物品种要进入商业化生产必须要经过环境释放试验这一环节。通过环境释放试验，可以观察转基因植物在田间条件下的基本生长情况，目标性状的表达，从而初步评价转基因植物的环境安全性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供了一种转基因植物--转基因青蒿在环境释放试验的栽培管理方法，为转基因青蒿的商业化提供技术支持和环境安全评价。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现的：

所述转基因青蒿在环境释放试验的栽培管理方法，首先将青蒿种子种植于发苗培养基中发苗，然后将青蒿苗移栽于环境释放试验大田中，通过合理的田间设计和栽培管理措施，为青蒿的生长提供合适环境条件，并采用随机区组方式种植转基因青蒿和非转基因青蒿材料，测定其基本农艺性状以及目的基因的表达情况。

具体包括如下步骤：

(1)将转基因青蒿和非转基因青蒿种子种植于发苗培养基上发苗，发苗培养基的配方为MS培养液，另外添加30g/L的蔗糖和2.6g/L的植物凝胶。

其中，MS培养基的配方如下(mg/L)：

NH₄NO₃ 1650， KNO₃ 1900， CaCl₂·2H₂O 440，

MgSO4·7H₂O 370， KH₂PO₄ 700，微量元素：KI 0.83，

H₃BO₃ 6.2， MnSO₄·4H2O 22.3， ZnSO₄·7H2O 8.6，

Na₂MnO₄·2H₂O 0.25，CuSO₄·5H₂O 0.025，CoCl₂·6H₂O 0.025，

FeSO₄·7H₂O(27.8)+Na₂-EDTA·2H₂O(37.3)，

有机成分：肌醇100，烟酸0.5，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5，

盐酸硫胺素(维生素B1)0.5，甘氨酸2。

(2)待青蒿苗长至5cm左右移栽于环境释放试验的大田环境中。田间栽培方式参见图1，按株行距125cm×125cm规格移栽。移栽时按照125cm的行距整理出高15cm、宽25cm左右的浅垄，在浅垄上按125cm的株距错位挖好深15cm、直径约15cm的穴，然后将青蒿苗定植在上面。在种植区域四周挖掘排水沟，深沟沟宽30cm，沟深50cm。行间沟为浅沟，沟宽30cm，沟深20cm。在整个转基因青蒿种植区域周围种植非转基因玉米，以达到生物隔离的目的。

(3)移栽大田后，在15d内，勤检查，发现缺苗，及时用预留苗或同龄苗补栽，浇足定根水。移栽后15-20d，进行中耕除草，并结合施肥适当覆土；栽后35-45d，结合施肥进行培土。在整个青蒿生长期中，遇到干旱要及时浇水，同时在多雨季节，注意清沟，防渍排涝。

(4)在青蒿的不同生长时期，进行不同的施肥管理。青蒿专用复混肥的主要营养成分N、P₂O₅、K₂O按照1.0∶0.7∶1.2的比例混配。在移栽后7-9d，每667m²用专用复混肥5kg淋施。移栽后15-20d，每667m²施专用复混肥17.5kg左右后进行覆土。移栽后35-40d，每667m²穴施30kg专用复混肥并培厚土覆盖。在植株进入二级分枝后，叶面喷施微肥和植物生长调节剂。芸苔素(45mL/667m²)和硼肥加含量≥98.0％的磷酸二氢钾(100g/667m²)交替使用。以上微肥或植物生长调节剂对水45g-50g，充分搅动溶解后用手动喷雾器全株均匀喷雾。注意在喷雾时行走速度适中，使叶片正反面都能多沾肥液。

(5)在青蒿栽培过程中，对常见的病虫危害进行防治工作。危害比较严重的有茎腐病，黄萎病，白粉病，蚜虫，小地老虎，黄蚁等。在高温多雨的气候时，实行垄式栽培，理好排水沟防治茎腐病的发生。喷洒杀虫剂，防治虫害。

(6)在随机区组排列的转基因青蒿和非转基因青蒿材料中随机选取30株材料，以15天为时间间隔，连续5次，测定其基本农艺性状(株高，冠幅，茎粗)，分析青蒿的生长发育各阶段状态和生长趋势。株高和冠幅用刻度为0.1cm的卷尺测量，保留小数点后两位。冠幅的测量以青蒿主茎为轴心，采用十字交叉法测量两次，取其平均值。茎粗的测量工具为常规游标卡尺(0.001cm)。

(7)在随机区组排列的转基因青蒿和非转基因青蒿材料中随机选取30株材料，以15天为时间间隔，连续5次，测定其目的基因表达量的大小，观察在环境释放条件下，转基因青蒿目的性状的表达情况。

本发明相对于现有技术取得了以下的技术效果：

①本发明采用了发苗培养基培养和田间培养相结合的方式，成功移栽转基因青蒿和非转基因青蒿，使青蒿的成活率得到了提高。

②本发明设计了转基因青蒿和非转基因青蒿之间的种植距离和种植方式，并采用了物理，生物隔离措施隔离转基因材料，以便能独立观察转基因青蒿和非转基因青蒿的生长发育情况。

③本发明中青蒿专用复混肥的主要营养成分N、P₂O₅、K₂O按照1.0∶0.7∶1.2的比例混配，结合多种抗病，抗虫的田间栽培，保证转基因青蒿和非转基因青蒿在相同环境下正常生长。转基因青蒿和非转基因青蒿的基本农艺性状株高，茎粗，冠幅的长势相似。用Real-time RT-PCR的方法验证，在环境释放条件下，转基因青蒿品系目的基因出现上调或下调表达。

附图说明

图1为转基因青蒿和非转基因青蒿的田间栽培示意图，其中：转基因植株一共需1152棵，株行距1.25m，株间距1.25m；非转基因植株共需256棵，株行间距均为1.25m；普通玉米若干；四周沟及中部均为深沟，沟宽30cm，深50cm；行间沟均为浅沟，沟宽30cm，深20cm。

图2为转基因青蒿SQS和非转基因青蒿FSN-2005的基本农艺性状的生长趋势图，其中A为株高，B为茎粗，C为冠幅。

图3为转基因青蒿ANF和非转基因青蒿FSN-2005的基本农艺性状的生长趋势图，其中A为株高，B为茎粗，C为冠幅。

图4为转基因青蒿和非转基因青蒿在不同时间点目的基因相对表达量示意图，其中A为转基因青蒿SQS，B为转基因青蒿ANF。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进一步阐述。

说明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

转基因青蒿SQS品种环境释放试验

转基因青蒿SQS是通过RNAi干扰抑制青蒿素合成途径的竞争通路的关键酶基因的表达，从而达到青蒿素含量上升的转基因青蒿品系。转基因青蒿SQS和其受体材料(来源于重庆酉阳的青蒿品种FSN-2005)的种子种植于发苗培养基上发苗，发苗培养基的配方为MS培养液，另外添加30g/L的蔗糖和2.6g/L的植物凝胶。待青蒿苗长至5cm左右移栽于环境释放试验的大田环境中。按株行距125cm×125cm规格移栽，移栽时按照125cm的行距整理高15cm、宽25cm左右的浅垄，在浅垄上按125cm的株距错位挖好深15cm、直径约15cm的穴，然后将青蒿苗定植在上面。在种植区域四周挖掘排水沟，深沟沟宽30cm，沟深50cm。行间沟为浅沟，沟宽30cm，沟深20cm。在整个转基因青蒿种植区域周围种植非转基因玉米。在栽培过程中，每周除草一次。移栽后15-20d，结合施肥适当覆土；栽后35-45d，结合施肥进行培土。在整个青蒿生长期中，要及时浇水，尤其在多雨季节，注意清沟，防渍排涝。转基因青蒿SQS品种在栽培过程没有发现明显的虫害，但是由于遭遇强暴风雨，出现轻度茎腐病现象。因此，采用了垄式栽培，整理排水沟，加强其排水能力，茎腐病现象得到缓解。

在转基因青蒿SQS和非转基因青蒿FSN-2005生长旺盛期的5个时间点：7月6日、7月23日、8月6日、8月26日、9月9日测量转基因青蒿SQS和非转基因青蒿FSN-2005的株高，冠幅，茎粗(参见图2)。结果可以看出：转基因青蒿SQS和非转基因青蒿FSN-2005在环境释放条件下，基本农艺性状合理，生长趋势正常。

在转基因青蒿SQS和非转基因青蒿生长旺盛期的5个时间点：7月23日、8月6日、8月23日、9月6日、9月23日，用总RNA抽提试剂盒(Tiangen)提取转基因青蒿以及受体材料的上部叶中的RNA。按照生产商提供的步骤，用DNase I(Promega)除去DNA的污染。用M-MLVReverse Transcriptase作为逆转录酶，Oligo(dT)n作为引物，按照生产商提供的步骤(Promega)逆转录RNA成cDNA。以逆转录成的cDNA为模板，以目的基因特异性的正向引物SQS-F：5’-ATCCCATCACAACCTCAC-3’和反向引物SQS-R：5’-ACAACCCTATTCCAACAAGTC-3’，或内标基因的正向引物UBC-F：5’-CACACTTGAGGTTGAGTCCAG-3’和反向引物UBC-R：5’-CATAACATTTGCGGCAGATAG-3’为引物，在定量PCR仪ABI 7700(Applied Biosystem)上完成定量PCR。定量PCR反应中加入SYBR Green用来定量dsDNA的总量。采用ΔΔCt相对定量方法评价模板的相对含量。

定量PCR反应体系：

ddH₂O 13.2μl

10×buffer 2.5μl

dNTP(2mM) 2.5μl

模板DNA(20ng/μl) 5μl

正向引物(10pm/μl) 0.6μl

反向引物(10pm/μl) 0.6μl

SYBR Green 0.3μl

Taq酶(5U/μl) 0.3μl

总体积 25μl

PCR反应条件：

94℃ 5min

72℃ 7min

4℃保存。

在不同时间点转基因青蒿SQS的目的基因SQS相对于非转基因青蒿FSN-2005的表达量见图4A。由于RNAi的抑制作用，转基因青蒿SQS的目的基因SQS的表达量下调。并且在9月6日，也就是青蒿的花蕾初期，SQS基因的表达受到最强抑制。这与先前文献中报道的，青蒿生长到初蕾至盛蕾阶段青蒿素含量达到最高，随后下降这一结论相符合。也说明了本发明中所提供的方法能够在环境释放条件下，保持转基因青蒿目的性状的稳定表达，为转基因青蒿未来的商业化生产，提供技术支持。

实施例2

转基因青蒿ANF品种环境释放试验

转基因青蒿ANF是通过转入青蒿素合成途径的关键酶基因ADS，从而使ADS基因表达量上调，青蒿素的积累增加。转基因青蒿ANF和其受体材料(来源于重庆酉阳的青蒿品种FSN-2005)的种子种植于发苗培养基上发苗，发苗培养基的配方为MS培养液，另外添加30g/L的蔗糖和2.6g/L的植物凝胶。待青蒿苗长至5cm左右移栽于环境释放试验的大田环境中。按株行距125cm×125cm规格移栽。移栽时按照125cm的行距整理高15cm、宽25cm左右的浅垄，在浅垄上按125cm的株距错位挖好深15cm、直径约15cm的穴，然后将青蒿苗定植在上面。在种植区域四周挖掘排水沟，深沟沟宽30cm，沟深50cm。行间沟为浅沟，沟宽30cm，沟深20cm。在整个转基因青蒿种植区域周围种植非转基因玉米。在栽培过程中，每周除草一次。移栽后15-20d，结合施肥适当覆土；栽后35-45d，结合施肥进行培土。在整个青蒿生长期中，遇到干旱要及时浇水，尤其在多雨季节，注意清沟，防渍排涝。转基因青蒿ANF品种在栽培过程没有发现明显的虫害，但是由于遭遇强暴风雨，转基因青蒿ANF种植区域地势较低，排水不畅，出现茎腐病现象。因此，理好排水沟，引入排水系统，并在发病初期喷淋1％硫酸亚铁溶液、70％甲基托布津500倍液、15％恶霉灵水剂450倍液、58％雷多米尔500倍液、50％立枯净可湿性剂800倍液，隔5-7d喷一次，防治二三次，茎腐病现象得到缓解。

在转基因青蒿ANF和非转基因青蒿生长旺盛期的5个时间点：7月6日、7月23日、8月6日、8月26日、9月9日测量转基因青蒿ANF和非转基因青蒿FSN-2005的株高，冠幅，茎粗(见图3)。在环境释放时期中，由于转基因青蒿ANF受到强暴风雨的影响，导致在7月中下旬生长放缓，随后转基因青蒿ANF生长逐渐恢复正常。总体而言，在整个环境释放试验过程中，转基因青蒿ANF和非转基因青蒿的基本农艺性状合理，生长趋势正常。

在转基因青蒿ANF和非转基因青蒿生长旺盛期的5个时间点：7月23日、8月6日、8月23日、9月6日、9月23日，用总RNA抽提试剂盒(Tiangen)提取转基因青蒿以及受体材料的上部叶中的RNA。按照生产商提供的步骤，用DNase I(Promega)除去DNA的污染。用M-MLVReverse Transcriptase作为逆转录酶，Oligo(dT)n作为引物，按照生产商提供的步骤(Promega)逆转录RNA成cDNA。以逆转录成的cDNA为模板，以目的基因特异性的正向引物ADS-F：5’-AATGGGCAAATGAGGGACAC-3’和反向引物ADS-R：5’-TTTCAAGGCTCGATGAACTATG-3’，或内标基因的正向引物UBC-F：5’-CACACTTGAGGTTGAGTCCAG-3’和反向引物UBC-R：5’-CATAACATTTGCGGCAGATAG-3’为引物，在定量PCR仪ABI 7700(Applied Biosystem)上完成定量PCR。定量PCR反应中加入SYBR Green用来定量dsDNA的总量。采用ΔΔCt相对定量方法评价模板的相对含量。

定量PCR反应体系：

ddH₂O 13.2μl

10×buffer 2.5μl

dNTP(2mM) 2.5μl

模板DNA(20ng/μl) 5μl

正向引物(10pm/μl) 0.6μl

反向引物(10pm/μl) 0.6μl

SYBR Green 0.3μl

Taq酶(5U/μl) 0.3μl

总体积 25μl

PCR反应条件：

94℃ 5min

72℃ 7min

4℃保存。

转基因青蒿ANF的目的基因ADS相对于非转基因青蒿FSN-2005的表达量见图4B。由于转基因转入目的基因ADS的作用，转基因青蒿ANF的目的基因ADS的表达量上调。并且在9月6日，也就是青蒿的花蕾初期的时候，ADS基因的相对表达量最高。这与先前文献中报道的，青蒿生长到初蕾至盛蕾阶段青蒿素含量达到最高，随后下降这一结论相一致。也说明了本发明中所提供的方法能够在环境释放条件下，保持转基因青蒿目的性状的稳定表达，为转基因青蒿未来的商业化生产，提供技术支持。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims

1.一种转基因青蒿环境释放试验的栽培管理方法，其特征在于，首先将青蒿种子种植于发苗培养基中发苗，然后将青蒿苗移栽于环境释放试验的大田环境中，通过田间设计、合理灌溉、施肥、除草以及病虫害管理，为青蒿提供生长环境；

其中，所述发苗培养基是通过在MS培养液中另外添加30g/L的蔗糖和2.6g/L的植物凝胶而得；

所述大田环境是上海地区的转基因植物环境安全评价试验基地，四周通过铁丝网和水泥围墙与周围环境隔离。

2.根据权利要求1所述的转基因青蒿环境释放试验的栽培管理方法，其特征在于，按株行距125cm×125cm规格移栽，移栽时田间设计按照125cm的行距整理出高15cm、宽25cm左右的浅垄，在浅垄上按125cm的株距错位挖好深15cm、直径约15cm的穴，然后将青蒿苗定植在上面。

3.根据权利要求2所述的转基因青蒿环境释放试验的栽培管理方法，其特征在于，在种植区域四周挖掘排水沟，深沟沟宽30cm，沟深50cm，行间沟为浅沟，沟宽30cm，沟深20cm。

4.根据权利要求1至3任一项所述的转基因青蒿环境释放试验的栽培管理方法，其特征在于，在整个转基因青蒿种植区域周围种植非转基因玉米。

5.根据权利要求1所述的转基因青蒿环境释放试验的栽培管理方法，其特征在于，所述青蒿施肥用的专用复混肥的营养成分N、P₂O₅、K₂O按照重量比1.0∶0.7∶1.2的比例混配。

6.根据权利要求1所述的转基因青蒿环境释放试验的栽培管理方法，其特征在于，在青蒿整个生长期中，及时浇水，同时在多雨季节，注意清沟，防渍排涝。

7.根据权利要求1所述的转基因青蒿环境释放试验的栽培管理方法，其特征在于，在青蒿整个生长期中，定期除草，针对青蒿常见的茎腐病、黄萎病、白粉病、枯萎病、蚜虫、小弟老虎或黄蚁，喷洒相应的杀虫剂。