CN105647883B

CN105647883B - 拟南芥tt4基因在植物抗盐方面的新应用

Info

Publication number: CN105647883B
Application number: CN201610122693.0A
Authority: CN
Inventors: 张骁; 赵翔; 赵青平; 蔡欣媛; 王琳丹
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2016-03-04
Filing date: 2016-03-04
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2036-03-04
Also published as: CN105647883A

Abstract

本发明属于基因工程应用技术领域，具体涉及拟南芥TT4基因（拟南芥基因组编码为At5g13930）在培育耐盐植物新品种方面的应用。所述TT4基因，其CDS长度为1188 bp，编码395个氨基酸的蛋白，该基因与种子活力相关，该基因突变后使拟南芥种子活力得到释放，即：该基因突变后可增强种子活力，使种子萌发更为迅速，萌发能力更强。TT4基因主要是作为类黄酮合成途径中的第一个特异性酶，参与调控了拟南芥的种皮和种皮色素的发育。本发明通过对TT4基因在模拟干旱或高盐逆境中的研究，发现该基因特异性的调控植物对盐等引起的渗透胁迫反应，将该基因沉默掉后，其突变体植株在萌发初期表现出较好地抗盐特性。

Description

拟南芥TT4基因在植物抗盐方面的新应用

技术领域

本发明属于基因工程应用技术领域，具体涉及拟南芥TT4基因（拟南芥基因组编码为At5g13930）在培育耐盐植物新品种方面的应用。

背景技术

当前，全球水资源短缺日趋加剧，而人类大量使用化肥使土壤盐渍化日益严重，制约了农业的持续生产和发展。随着分子生物学和基因工程研究的深入，国际上很多科技工作者也在努力寻找与植物抗盐相关的基因，拟通过基因工程技术改良作物的抗盐性，但是目前可利用的成果甚少。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）属十字花科鼠耳芥属植物，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草，是植物遗传学、分子生物学常用的模式植物之一，也常用于植物逆境条件下抗性基因研究。

现有研究一般认为种皮的颜色除作为一个形态指示形状外，也常与植物品质有所关联，因此利用模式植物拟南芥开展种皮色素形成调控机理的研究也有较多成果。拟南芥种皮中色素主要是类黄酮，确切的说是花青素中的原花青素和栎精中的黄酮醇。TT4基因（拟南芥基因组编码为At5g13930）是调控拟南芥种皮色素的基因之一，该基因所编码的CHS蛋白作为类黄酮合成途径中的第一个特异性酶，催化类黄酮合成途径的第1步反应，即：4--香豆酰-Co（1分子）+丙二酰-CoA（3分子）→缩合形成查尔酮(又称苯基苯乙烯酮，Chalcone)。而查尔酮为其他类黄酮合成提供基本骨架，因此CHS蛋白催化的反应是整个类黄酮合成途径的重要限速步骤。已有的研究发现，TT4基因突变后类黄酮合成缺失引起拟南芥种皮色泽的变异，而这些聚酮化合物在植物器官着色、病虫害防护和紫外辐射抵御等方面扮演着重要角色，然而关于此基因的其他用途，特别是植物抗盐方面的研究尚无报道。

发明内容

在对TT4基因（At5g13930基因）深入研究基础上，发明人提供了TT4基因（At5g13930基因）在植物抗盐特性方面的新应用，从而为培育抗盐植物新品种提供新的可能性。

本发明所采用的技术方案如下所述。

拟南芥TT4基因在植物抗盐方面的新应用，所述TT4基因为拟南芥基因组编码At5g13930基因，其CDS长度为1188 bp，编码395个氨基酸的蛋白，该基因与种子活力相关，该基因突变后使拟南芥种子活力得到释放，即：该基因突变后可增强种子活力，使种子萌发更为迅速，萌发能力更强；进一步模拟干旱及模拟盐渍环境实验表明，该基因突变后可提高种子在萌发初期耐受盐胁迫（NaCl胁迫）和干旱（甘露醇模拟干旱）生长环境的能力，换言之，该基因突变后，可使种子萌发时耐受盐胁迫或干旱胁迫生长环境的能力得到增强。

进一步实验表明，TT4基因突变后，可使拟南芥种子在萌发初期耐受不超过400 mM甘露醇的模拟干旱的胁迫生长环境，或可耐受不超过150 mM NaCl的盐胁迫生长环境；在拟南芥种子萌发后，可耐受生长环境中不超过300 mM甘露醇的模拟干旱的胁迫生长环境，或可耐受不超过150 mM NaCl的盐胁迫生长环境。

现有研究一般认为，拟南芥TT4基因主要是作为类黄酮合成途径中的第一个特异性酶，参与调控了拟南芥的种皮和种皮色素的发育。而本发明通过对拟南芥TT4基因（At5g13930基因）在模拟干旱或高盐逆境中的研究，发现该基因特异性的调控植物对盐等引起的渗透胁迫反应，进一步将该基因沉默掉后，其突变体植株在萌发初期表现出较好地抗盐特性。因此通过该基因的进一步研究和转化，可以将其用于培育新的优良的耐盐植物新品种。

附图说明

图1为拟南芥野生型（WT）、tt4-2和tt4-3突变体通过TTC染色法测定种子活力的结果；图A为拟南芥野生型（WT）、tt4-2和tt4-3突变体着色情况，其中Control组为对照组，为自然结实后种子情况，从图中可以看出，野生型（WT）种子具有较深的天然色泽，而突变体种子则表现为近似无色；图B为拟南芥野生型（WT）、tt4-2和tt4-3突变体着色种子所占比例的统计结果，其中横坐标的“Stained Seeds”表示着色（染色）种子；

图2为拟南芥野生型（WT）、tt4-2和tt4-3突变体在添加不同浓度NaCl的MS培养基上培养两周时种子的萌发情况统计结果；

图3为拟南芥野生型（WT）、tt4-2和tt4-3突变体在添加200 mM NaCl的MS培养基上培养时的萌发情况，其中图A为拟南芥野生型（WT）、tt4-2和tt4-3突变体在添加200 mMNaCl的MS培养基上培养一周时种子萌发情况；图B为拟南芥野生型（WT）、tt4-2和tt4-3突变体在添加200 mM NaCl的MS培养基上5天内种子每天的萌发情况统计结果；

图4为TT4基因的组织表达定位情况，其中图A为拟南芥生长7天时转基因幼苗中TT4基因的组织表达情况；图B为子叶、茎中TT4基因的组织表达情况；图C为根毛区中TT4基因的组织表达情况；图D为根成熟区中TT4基因的组织表达情况；图E为根尖和分生区中TT4基因的组织表达情况；图F为TT4基因在花器官中的组织表达情况；图G为TT4基因在花中表达情况；

图5为野生型与tt4-2突变体在300mM甘露醇、150 mM NaCl处理下的生长情况；其中A为将野生型与tt4-2突变体的种子直接点到胁迫培养基中生长15天后的表型；B为正常培养基中生长的幼苗移栽到胁迫培养基后，野生型与tt4-2突变体幼苗的生长情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步地解释说明。

实施例1

本实施例主要对TT4基因（At5g13930基因）与植物种子活力的关系进行简要说明。

前期基础研究过程中，发明人认为TT4基因（At5g13930基因）与植物种子活力相关，为此，发明人以拟南芥野生型（WT）、tt4-2和tt4-3突变体为例对此结论进行了对比实验验证。相关实验过程介绍如下。

将干燥后的拟南芥野生型（WT）、tt4-2和tt4-3突变体种子分别置于含有氯化三苯四唑氮（TTC）的溶液中，温度30℃，避光染色48h，观察并统计种子的着色请况。

所述tt4-2和tt4-3突变体均为从拟南芥资源中心获得的TT4基因（At5g13930基因）分别通过基因敲除三个碱基、多一个碱基的突变体（具体突变情况为：tt4-2突变体在5号染色体4489272~4489274的位置敲除掉三个碱基TGC;tt4-3突变体在5号染色体4489274的位置插入一个碱基C，致使其发生移码突变），该突变体的TT4基因失活，不能正确编码相关蛋白质。

需要说明的是，采用氯化三苯四唑氮（TTC）染色种子（种子生活力四唑染色测定法）是一种判定植物种子活力较为直观的方法，由德国的H.Lakon于1942年首先发明，1995年我国将其列入农作物种子检验规程，其原理是无色的三苯基四氮唑被种子吸收后，在胚部活细胞中脱氢酶的作用下还原成红色、稳定、不扩散的三苯基甲，因而可根据染色的部位和深浅来直观的反应和区分种子的活性。

实验结果如图1所示。从图中可以看出，tt4-2和tt4-3突变种子被染成红色的比例明显比野生型（WT）植株种子多，且着色较深。这表明TT4基因（At5g13930基因）突变后拟南芥种子的活力得到了增强。

实施例2

在实施例1基础上，发明人认为TT4基因突变后可以提高种子的活力，也有可能提高其耐盐能力，因而发明人做了进一步的实验验证。相关过程简要介绍如下。

将拟南芥野生型（WT）、tt4-2和tt4-3突变体种子分别播种于含有100 mM NaCl、150 mM NaCl、200 mM NaCl的MS培养基上，同时设置未添加其他物质的MS培养基作为对照，MS培养基琼脂质量含量为0.6%。

所述tt4-2和tt4-3突变体来源同实施例1。

种子播种完成后，培养生长环境为：光/暗周期为 8/16h，温度22℃，黑暗温度18℃，相对湿度70%，光照强度90 µmol·m^-2·s^-1。

对拟南芥种子萌发过程进行具体观察并统计种子的萌发率。

实验结果如图2、3所示。从图中可以看出，盐胁迫条件下，随着盐浓度的升高，野生型（WT）植株种子萌发率逐渐下降，且浓度越高，种子萌发率下降越明显；而TT4基因突变体（tt4-2和tt4-3突变体）种子的萌发率在一定盐浓度（150 mM NaCl）的条件下，其萌发率不受影响，只有在盐浓度超过一定程度时才造成种子萌发率的下降，但在200 mM NaCl浓度条件下，即使野生型（WT）植株种子萌发率降低为0时，TT4基因突变体（tt4-2和tt4-3突变体）种子仍有较高萌发率；而就具体突变类型而言，较高浓度盐环境条件下，tt4-2突变体又比tt4-3突变体种子萌发率稍高。而且在实际观察中，TT4基因突变体（tt4-2和tt4-3突变体）种子萌发速度也较野生型（WT）种子萌发速度快。

需要解释的是，对TT4基因耐盐功能验证同时，发明人设计有相关的渗透对照实验（以不同浓度甘露醇研究渗透压影响，由于该部分实验与本申请关联度不高，因而不再单独说明），最终结果表明，TT4基因耐盐功能实现不依赖于渗透因素，而仅与盐的作用相关。

实施例3

基于实施例2的研究结果，发明人认为有必要对TT4基因在拟南芥组织中的表达情况进行进一步分析，相关实验过程简要介绍如下。

对TT4基因在拟南芥组织中的表达情况进行分析时，所采取的技术方案为：将TT4基因启动子与pCAMBIA1391载体上的GUS报告基因的编码区融合，构建pTT4-pCAMBIA1391载体，并采用农杆菌侵染拟南芥花絮的方法获得了野生型拟南芥转化TT4-GUS的转基因植株，然后对TT4基因在拟南芥组织中的表达情况进行具体分析。

具体实验过程介绍如下。

（1）制备pTT4-pCAMBIA1391载体

从拟南芥网站（http://www.arabidopsis.org）上，获得At5g13930基因启动子序列，根据pCAMBIA1391载体的多克隆位点，利用primer5.0软件设计特异性引物，引物序列设计为：

LP: 5'- GCCAGCCTGACGGCATCGGAAG -3'，

RP: 5'- GAGTTTGATGTTGCTGTTGTGT-3'；

以野生型拟南芥基因组DNA为模板，PCR扩增出At5g13930基因启动子的1355bp序列（具体序列如SEQ ID NO.1所示）；

同时对扩增的At5g13930基因启动子序列和pCAMBIA1391质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后回收，连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，提取质粒并进一步进行PCR鉴定、双酶切筛选和测序比对，获得正确的含有At5g13930基因启动子序列的pTT4-pCAMBIA1391载体。

（2）将步骤（1）中所制备pTT4-pCAMBIA1391载体转化

将步骤（1）中所制备pTT4-pCAMBIA1391载体转化农杆菌GV3101感受态细胞，筛选并挑取阳性农杆菌单菌落扩大培养至OD₆₀₀=1.2~1.6。

（3）浸染转化

当拟南芥野生型WT幼苗花序长至5~10 cm高时（培养条件同实施例2），利用步骤（2）中转化后的农杆菌侵染拟南芥花絮进行转化，具体过程为：将拟南芥花序浸没在菌液中，每株浸花30 s，将浸花过的苗盆平放在托盘中，以塑料膜覆盖保持湿度，避光放置16~24h后取出，正常培养；5~7天后，重复侵染一次。

（4）阳性植株筛选

将步骤（3）中农杆菌侵染后拟南芥继续培养，收获种子。

将所收获的种子撒种于含25 mg/L潮霉素的MS培养基平板上，4℃春化3 d，移到材料室培养一周（培养条件同实施例2）。

阳性植株对潮霉素有抗性，可正常生长，阴性植株对潮霉素敏感，不能正常生长最后死亡。基于此特性，筛选阳性植株，所获得阳性植株可初步认为其成功转录有GUS基因，并且该基因获得了正确表达。

（5）染色鉴定

将步骤（4）中所筛选获得的阳性幼苗移栽到栽培基质中（所述栽培基质为，质量比1:2的营养土/蛭石），20℃±2℃、光暗周期16 h / 8 h、相对湿度80%培养。对2周大的幼苗分别取幼嫩叶片进行GUS染色检测，将检测为阳性的幼苗继续培养至种子成熟，所得种子继续用潮霉素筛选并做GUS染色检测鉴定，并将阳性苗进一步扩大繁殖。

上述拟南芥培养过程中，将拟南芥种子播种于培养基时，拟南芥种子均需消毒，具体方法为：将拟南芥种子置于1.5 mL的离心管中，用0.1%升汞表面消毒5 min，以无菌水冲洗5~8次，然后选取尖头滴管吸取种子进行点播。

拟南芥种子采用培养基培养时，所采用的MS固体培养基配方为：MS盐+3%蔗糖+0.6%琼脂，pH 6.0；培养条件为：光/暗 16 h / 8 h，光照强度 0.3~0.4 mmol·m^-2·s^-1，温度18℃~22℃。

上述步骤（5）中GUS染色液的配制方法为：称取1 mg 的X-Gluc (5-溴-4氯-3-吲哚-β-葡糖醛酸)放入锡箔纸包好的1.5mL的EP管中，加入1~2滴N,N-二甲基甲酰胺使X-Gluc完全溶解，然后依次加入980 µL 100 mM磷酸缓冲液（pH=7.0）、10µL 5mM铁氰化钾和10 µL5 mM亚铁氰化钾，最后加入1 µL Triton X-100，混匀即可。

上述步骤（5）中GUS染色方法为：将所采集的植株的器官组织浸没于GUS染液中（GUS染液用量依据组织器官大小适量取用，以完整浸没组织器官为限），避光条件下，37℃水浴染色至少4~5h，然后依次用50%乙醇脱色、75%乙醇脱色和无水乙醇进行脱色，直至叶绿素全部被脱去，最后进行染色情况观察并照相；染色时对各个组织器官（根、茎、叶以及花等）均进行采集染色。

GUS染色原理为：GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶，该水解酶以β-葡萄糖苷酸酯类物质为作用底物，其反应产物可用多种方法检测出来；由于该基因仅存在于一些细菌基因组内，而在植物基因组中并不存在，因此可用通过GUS基因的表达，可特异性检测与该基因相关联的欲检测基因（如本申请中At5g13930基因）在植物组织中的表达位置。对该基因的组织化学法检测原理为：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞中转入有GUS基因，并成功表达出Gus蛋白，在适宜条件下，该酶就可将底物水解生成蓝色产物，使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，进而可通过肉眼或显微镜观察得到，且在一定程度下可根据染色深浅反映Gus活性，并进而反映出欲检测基因的表达量等表达情况。

GUS染色结果如图4所示。从图中可以看出，TT4基因在拟南芥根、茎、叶和花中均有表达，并且根的成熟区、茎和花器官中表达量相对更高。

实施例4

在前述关于TT4基因基本功能与其在植物组织中表达情况已有基本研究的基础上，发明人对TT4基因（At5g13930基因）调节拟南芥抗盐能力进行了进一步的检测验证，相关试验情况简介如下。

将春化过的种子（野生型 WT和突变体tt4-2）直接点在含300 mM的甘露醇和150mM氯化钠的0.6%MS培养基中，光照材料间培养2~3周（具体培养条件参考实施例2），观察结果。

对栽培结果进行统计，结果显示，突变体tt4-2在含300 mM的甘露醇的培养基中萌发率能达到96%以上，叶子变绿的能达到90%以上；而在含150 mM氯化钠的培养基中萌发率能达到92%以上，叶子变绿的在87%以上；野生型（WT）在含150 mM氯化钠的培养基中萌发率不到3%，大部分不能萌发，叶子变绿仅有1%左右；而在含300 mM甘露醇的培养基中萌发率只有10%左右，叶子变绿在5%左右；具体表型可参见图5A所示。

另外一组实验中，将春化过的种子（野生型 WT和突变体tt4-2）先点到正常的0.8%MS培养基中，竖直培养，待根长至1cm左右时，再移至含150mM氯化钠或300mM的甘露醇的0.8%MS培养基中，光照材料间竖直培养2周左右（具体培养条件参考实施例2）。

实验结果表明，野生型幼苗在移栽到含氯化钠培养基中后，不再生长，并且叶子很快发黄干枯，接近死亡状态，而与之相对应的tt4-2突变体则生长良好，表现明显的对盐的耐受性（或者说抗性）；而同等浓度的甘露醇处理条件下，tt4-2突变体与野生型并没有明显的表型区别，这一结果表明，tt4-2突变体对盐的抗性表现，可能不依赖于其对渗透胁迫调控。相关表型结果如图5B所示。

综上所述，发明人认为，TT4（At5g13930）基因可能是抗盐胁迫的关键性负调控因子，其突变后可赋予拟南芥较强的抗盐胁迫的能力，可明显提高幼苗抗高浓度盐环境能力（在环境浓度150mM时，种子萌发与生长基本不受影响；而在环境中NaCl浓度达到200mM时，种子萌发受到影响的效果才能得到较为明显的表现）。发明人认为，本发明可为培育抗盐抗干旱的转基因作物新品种提供新的借鉴和参考，即，利用TT4基因的抗盐功能特点，通过干扰该基因在作物中翻译表达情况，有望开发培育出新的丰产抗盐作物新品种，因而使得本申请具有进一步深入研究开发的价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学

<120> 拟南芥TT4基因在植物抗盐方面的新应用

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<170> PatentIn version 3.5

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<213> Arabidopsis thaliana

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ctttttcccg tgtcagtttg ttatataagc tctcactctc cggtatattt ccaaatacac 1320

ctaacttgtt tagtacacaa cagcaacatc aaact 1355

Claims

1.拟南芥TT4基因在植物抗逆境胁迫中的应用，其特征在于，所述TT4基因为拟南芥基因组编码At5g13930基因，其CDS长度为1188 bp，编码395个氨基酸的蛋白；

种子萌发初期，TT4基因突变后，可耐受不超过150 mM NaCl的盐胁迫生长环境；

种子萌发后，TT4基因突变后，可耐受生长环境中不超过300 mM甘露醇的模拟干旱的胁迫生长环境，和可耐受不超过150 mM NaCl的盐胁迫生长环境；

所述TT4基因突变为TT4基因失活，无法正常表达。