CN106715702B - 制备具有低丙烯酸浓度的丙烯酰胺水溶液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备具有低丙烯酸浓度的丙烯酰胺水溶液的方法。此外，本发明涉及用于降低丙烯酰胺水溶液的丙烯酸浓度的方法。该方法包括在生物催化剂的存在下将丙烯腈生物转化为丙烯酰胺，其中在生物转化期间，丙烯腈的含量保持在相对于反应器中组合物总重量的0.3w/w％或更高。还提供了通过本发明的方法获得的丙烯酰胺水溶液。此外，本发明涉及通过聚合所述水溶液的丙烯酰胺而获得的丙烯酰胺均聚物或共聚物。

Description

制备具有低丙烯酸浓度的丙烯酰胺水溶液的方法
本发明涉及用于制备具有低丙烯酸浓度的丙烯酰胺水溶液的方法、可通过所述方法获得的丙烯酰胺水溶液、以及可通过聚合所述丙烯酰胺获得的丙烯酰胺均聚物或共聚物。此外，本发明还涉及降低丙烯酰胺水溶液的丙烯酸浓度的方法。
聚丙烯酰胺广泛用作絮凝剂，在造纸工业中用作增稠剂，在三级油回收中用作添加剂，以及许多其它领域。聚丙烯酰胺的原料通常是其单体丙烯酰胺。原则上，在工业规模中存在两种不同的生产丙烯酰胺的方法：化学合成和生物合成，其中由于更温和的反应条件和固有的加工安全性，生物合成方法越来越多地增加。由于更温和的反应条件，在生物合成中可以避免存在铜催化剂和腈的定量转化、昂贵的下游加工步骤例如蒸馏或离子交换，因此导致更廉价的工厂，具有显著降低的工厂占地面积。
两种合成方法都使用丙烯腈作为起始物质。虽然化学合成方法使用铜催化剂(例如，US4048226、US3597481)，但是生物合成方法(也称为以生物为基础的方法)使用生物催化剂来水合(即转化)丙烯腈以获得丙烯酰胺。通常，这样的生物催化剂是微生物，其能够产生(即编码)腈水合酶(IUBMB命名法，截至2014年9月30日:EC 4.2.1.84；CAS编号2391-37-5；也称为例如NHase)。产生腈水合酶的微生物广泛分布在环境中，并且尤其包含以下物种的代表：玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinovorans)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、马红球菌(Rhodococcusequi)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、不透明红球菌(Rhodococcus opacus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)、敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苍白芽孢杆菌(Bacillus pallidus)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、芽孢杆菌属物种BR449(Bacillus sp BR449)、Bradyrhizobium oligotrophicum、高效固氮慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumdiazoefficiens)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、Burkholderiacenocepacia、唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)、产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、变栖克雷伯菌(Klebsiellavariicola)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、Mesorhizobiumopportunistum、中慢生根瘤菌属物种F28(Mesorhizobium sp F28)、莫拉菌属(Moraxella)、Pantoea endophytica、凝聚成团泛菌(Pantoea agglomerans)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)、根瘤菌属(Rhizobium)、沼泽红假单孢菌(Rhodopseudomonas palustris)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属物种CH1(Brevibacterium sp CH1)、短杆菌属物种CH2(Brevibacterium sp CH2)、短杆菌属物种R312(Brevibacterium sp R312)、Brevibacterium imperiale、Corynebacterium nitrilophilus、假白喉棒状杆菌(Corynebacterium pseudodiphteriticum)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、霍夫曼棒状杆菌(Corynebacterium hoffmanii)、蛾微杆菌(Microbacteriumimperial)、Microbacterium smegmatis、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、球形诺卡菌(Nocardia globerula)、玫瑰色诺卡菌(Nocardia rhodochrous)、嗜热假诺卡菌(Pseudonocardia thermophile)、木霉属(Trichoderma)、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)、出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)、无名假丝酵母(Candidafamata)、吉利蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、黄隐球菌(Cryptococcus flavus)、隐球菌属物种UFMG-Y28(Cryptococcussp UFMG-Y28)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hanseii)、白地霉(Geotrichumcandidum)、地霉属物种JR1(Geotrichum sp JR1)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、胶红类酵母菌(Rhodotorula glutinis)、睾丸酮丛毛单胞菌(Comomonas testosterone)、Pyrococcus abyssi、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和堀越氏火球菌(Pyrococcushorikoshii)。(参见例如，Prasad,生物技术进展(Biotechnology Advances)(2010),28(6):725-741；FR2835531)。这种腈水合酶是铁或钴依赖性的(即，其具有在其活性中心配位的铁或钴原子)，其特征具体在于其通过水合丙烯腈而催化丙烯腈转化获得丙烯酰胺的能力(Kobayashi,自然生物技术(Nature Biotechnology)(1998),16:733-736)。
将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物合成方法的产物是丙烯酰胺在水中的溶液。然而，通常所获得的丙烯酰胺水溶液还含有丙烯酸，其在生物转化期间作为副产物形成。
丙烯酰胺用作单体以形成丙烯酰胺的聚合物。对于聚合反应，可以使用通过生物合成方法制备的丙烯酰胺水溶液。
然而，已经发现用于聚合反应的丙烯酰胺水溶液中存在的丙烯酸导致所得的丙烯酰胺聚合物的性能降低。更具体地说，丙烯酸的存在会显著损害丙烯酰胺聚合物材料的物理性能，例如在各种应用如水处理、造纸、油回收或采矿中导致降低的溶解性和性能。
因此，需要制备具有低浓度丙烯酸的丙烯酰胺水溶液的生物催化方法。
这个客观的技术问题已经通过权利要求中限定的并且如下文所描述和示例的本发明所克服。
本发明涉及一种制备丙烯酰胺水溶液的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(a)将下列组分(i)至(iii)加入反应器中以获得用于生物转化的组合物：
(i)能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂；
(ii)丙烯腈；
(iii)水；和
(b)对步骤(a)中获得的组合物进行生物转化；
(c)进一步加入丙烯腈，并在步骤(b)期间将丙烯腈的含量保持在0.3w/w％或更多，持续10分钟至48小时，优选15分钟至24小时，更优选30分钟至18小时，并且最优选1小时至12小时，其中w/w％的指示是基于反应器中组合物的总重量。
此外，本发明还涉及一种制备丙烯酰胺水溶液的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(a)将下列组分(i)至(iii)加入反应器中以获得用于生物转化的组合物：
(i)能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂；
(ii)丙烯腈；
(iii)水；和
(b)对步骤(a)中获得的组合物进行生物转化；
(c)进一步加入丙烯腈，并在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，直到丙烯酰胺含量至少为20w/w％，优选至少25w/w％，更优选至少30w/w％，甚至更优选至少35w/w％，还更优选至少40w/w％，还更优选至少42.5w/w％，还更优选至少45w/w％，还更优选至少47.5w/w％，并且最优选至少50w/w％，其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
本发明还包括降低丙烯酰胺水溶液的丙烯酸浓度的方法，其中所述丙烯酰胺水溶液通过使用生物催化剂将丙烯腈转化为丙烯酰胺的方法制备，该方法包含以下步骤：
(a)将以下组分(i)至(iii)加入反应器中以获得用于生物转化的组合物：
(i)能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂；
(ii)丙烯腈；
(iii)水；和
(b)对步骤(a)中获得的组合物进行生物转化；
(c)进一步加入丙烯腈，并在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更高，其中w/w％的指示是基于反应器中组合物的总重量。
关于制备丙烯酰胺水溶液的这些方法，发明人发现，通过在步骤(b)的生物转化期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，持续10分钟至48小时，或通过在步骤(b)的生物转化期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更高，直到丙烯酰胺含量达到至少20w/w％，所得丙烯酰胺水溶液中丙烯酸的浓度降低。此外，发明人已经发现了一种用于降低丙烯酰胺水溶液的丙烯酸浓度的方法，其中通过在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更高，在丙烯酰胺水溶液中的丙烯酸浓度降低。关于本文所述的制备丙烯酰胺水溶液或降低丙烯酰胺水溶液的丙烯酸浓度的任何一种方法，丙烯酰胺水溶液中丙烯酸浓度的降低意味着根据本发明的任何一种方法制备的丙烯酰胺水溶液(其中在步骤(b)的生物转化期间丙烯腈的含量保持在0.3w/w％或更高)与使用在生物转化期间丙烯腈的含量不保持在0.3w/w％或更高的方法制备的丙烯酰胺水溶液相比，具有更低的丙烯酸浓度。
本文在本发明的任何一种方法的上下文中使用的术语“生物转化”通常表示一种反应，其中丙烯腈在水和生物催化剂的存在下转化为丙烯酰胺。将丙烯酰胺溶解在水中，从而形成通过本文描述和提供的任何一种方法的丙烯酰胺水溶液。如本文所用，术语“组合物”包含存在于反应器中的所有组分，例如，生物催化剂、丙烯腈、丙烯酰胺和水。
如本文所述的任何一种方法所使用的，术语“生物催化剂”具体地讲，包括能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的微生物(例如，细菌或原生真核生物)和酶。测定给定的生物催化剂(例如，微生物或酶)将丙烯腈转化为丙烯酰胺的能力的方法是本领域熟知的。例如，在本发明的任何一种方法的上下文中，在本发明的意义上，能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的给定的生物催化剂的活性可以如下确定：首先使100μl的细胞悬浮液、细胞裂解物、溶解的酶粉末或含有假定的生物催化剂的任何其它制剂与875μl的50mM磷酸钾缓冲液和25μl的丙烯腈在25℃在Eppendorf管振荡器上以1,000rpm反应10分钟。在10分钟的反应时间后，可以抽取样品，并通过加入相同体积的1.4％盐酸立即淬灭。样品混合后，可以通过在10,000rpm离心1分钟除去细胞，并通过HPLC分析澄清上清液来测定形成的丙烯酰胺的量。为了在本发明的背景中确认能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂，丙烯酰胺的浓度应当在0.25和1.25mmol/l之间，在必要时，样品必须相应地稀释，并且必须重复转化。然后，可以通过将来自HPLC分析的丙烯酰胺浓度除以反应时间(其为10分钟)，并通过将该值与HPLC样品和原始样品之间的稀释因子相乘，从丙烯酰胺的浓度推导出活性。活性>5U/mg干细胞重量，优选>25U/mg干细胞重量，更优选>50U/mg干细胞重量，最优选>100U/mg干细胞重量，表示存在功能性生物催化剂，并在本发明的背景下被认为是能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂。
更具体地讲，通过使用本发明的任何一种方法，生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度可以为1500ppm或更少，优选1200ppm或更少，更优选1000ppm或更少，进一步优选750ppm或更少，甚至更优选500ppm或更少，还更优选300ppm或更少，还更优选200ppm或更少，并且最优选100ppm或更少，其中ppm的指示各自涉及重量份数，并且各自基于在生物转化结束时组合物的总重量。在这方面，术语“生物转化结束”表示在本文所述的任何一种方法中，已经达到丙烯腈基本上完全转化为丙烯酰胺。具体地讲，“丙烯腈基本上完全转化为丙烯酰胺”是指该组合物的丙烯腈的含量为1000ppm或更少，优选500ppm或更少，更优选200ppm或更少，并且最优选100ppm或更少，其中ppm的指示各自涉及重量份数，并且各自基于组合物的总重量。生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度和/或丙烯腈的含量可以使用HPLC测定。优选地，如下面实施例所述使用HPLC方法。
因此，本发明还涉及一种制备丙烯酰胺水溶液的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(a)将下列组分(i)至(iii)加入反应器中以获得用于生物转化的组合物：
(i)能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂；
(ii)丙烯腈；
(iii)水；
(b)对步骤(a)中获得的组合物进行生物转化；
(c)进一步加入丙烯腈，并在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更高，其中w/w％的指示是基于反应器中组合物的总重量；和
(d)获得组合物，其中在生物转化结束时，组合物的丙烯酸浓度为1500ppm或更少，优选1200ppm或更少，更优选1000ppm或更少，进一步优选750ppm或更少，甚至更优选500ppm或更少，还更优选300ppm或更少，还更优选200ppm或更少，并且最优选100ppm或更少，其中ppm的指示各自涉及重量份数，并且各自基于在生物转化结束时组合物的总重量。
具体地讲，发明人已经发现，通过进行如本文所述的本发明的任何一种方法，与参考的方法相比，丙烯酸浓度可以降低至少10％，优选至少15％，更优选至少20％，甚至更优选至少25％，并且最优选至少35％。在本文中，如本发明方法中所定义的丙烯酸浓度的降低与通过本发明的方法(即在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更高)制备的丙烯酰胺水溶液中所含的丙烯酸的最终浓度有关，与不通过本发明的方法(即在步骤(b)期间没有保持丙烯腈的含量为如本文所述的0.3w/w％或更多)制备的丙烯酰胺水溶液中所含的丙烯酸的最终浓度相比。
在本文所述和提供的任何一种方法中，在步骤(a)中将丙烯腈(组分(ii))加入到反应器中。在本发明的任何一种方法的上下文中，丙烯腈可以在加入水之前、在加入水之后或与水一起加入到反应器中。
根据本文所述的任何一种方法，在步骤(c)中进一步加入丙烯腈。在这方面，可以连续地或间歇地加入丙烯腈。丙烯腈可以以恒定或可变的进料速率或分批进行添加。丙烯腈可以以纯的形式或以溶液加入。例如，可以使用丙烯腈的水溶液。
此外，在本文所述和提供的任何一种方法中，在步骤(a)中将水(组分(iii))加入到反应器中。水可以作为本文所述的生物催化剂的一部分、作为本文所述的丙烯腈溶液的一部分、或以其它方式加入。在如此加入水的情况下，通常可以使用自来水或去离子水。水也可以是水性组合物的一部分，例如盐的水溶液。具体地讲，可以采用缓冲液。
对于本文所述和提供的任何一种方法的步骤(a)，组分(i)至(iii)以何种顺序加入到反应器中是不相关的。
关于所添加的组分的量，在本文所述的任何一种方法的步骤(a)至(c)中，生物催化剂、丙烯腈和水可以以重量比为0.001至0.5w/w％的生物催化剂，22至45w/w％的丙烯腈和平衡至100w/w％的水加入；优选0.005至0.2w/w％的生物催化剂，26至42w/w％的丙烯腈和平衡至100w/w％的水；更优选0.01至0.1w/w％的生物催化剂，30至40w/w％的丙烯腈和平衡至100w/w％的水；最优选0.015至0.065w/w％的生物催化剂，35至39w/w％的丙烯腈和平衡至100w/w％的水，其中在每种情况下w/w％的指示是基于在步骤(a)至(c)期间加入的生物催化剂、丙烯腈和水的组合重量的总重量(100w/w％)。例如，在步骤(a)和步骤(c)中加入丙烯腈的情况下，这意味着使用在步骤(a)和(c)中加入的丙烯腈的组合量计算比例。生物催化剂比例的w/w％的指示可以表示，在每种情况下生物催化剂的比例是根据生物催化剂的干重，具体地讲是生物催化剂的干细胞重量。形成100w/w％平衡的水没有特别限制。例如，水可以是水性组合物，例如盐的水溶液。具体地讲，可以使用缓冲液。然而，优选水是自来水或去离子水。
本文所述和提供的任何一种方法的步骤(b)代表生物转化步骤，在该步骤中丙烯腈通过本文所述和例举的生物催化剂转化为丙烯酰胺。更具体地讲，在本文所述的任何一种方法中，步骤(b)中的生物转化可以在5℃至40℃进行10分钟至48小时，优选在5℃至35℃进行10分钟至48小时，更优选在15℃至30℃进行10分钟至48小时，并且最优选在20℃至28℃进行10分钟至48小时。具体地讲，从生物催化剂的高活性和合理的反应时间来看，这样的反应温度是优选的。用于步骤(b)的实际时间段还取决于待生产的丙烯酰胺水溶液所需的丙烯酰胺含量。
除了或独立于这些温度和时间条件，在本发明的任何一种方法中，在步骤(b)期间丙烯腈的含量可以保持在0.3w/w％或更高，持续10分钟至48小时，优选15分钟至24小时，更优选30分钟至18小时，并且最优选1小时至12小时。具体地讲，在步骤(b)期间丙烯腈的含量可以保持在0.3w/w％或更高，持续2小时至12小时，持续4小时至12小时，持续6小时至12小时，持续8小时至12小时或持续10小时至12小时。
根据本文所述的任何一种方法，在步骤(b)期间丙烯腈的含量可以维持在0.3w/w或更高，直到丙烯酰胺含量至少为20w/w％，优选至少25w/w％，更优选至少30w/w％，甚至更优选至少35w/w％，还更优选至少40w/w％，还更优选至少42.5w/w％，还更优选至少45w/w％，还更优选至少47.5w/w％，并且最优选至少50w/w％，其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的全部重量。在达到这样的丙烯酰胺含量之后，可以停止加入丙烯腈。在本文所述的任何一种方法中，反应器中组合物的丙烯酰胺含量可以使用傅立叶变换红外光谱(FTIR)测量。
如上所述，在本发明的任何一种方法中，在步骤(b)的生物转化期间丙烯腈的含量保持在0.3w/w％或更高。优选地，在步骤(b)期间丙烯腈的含量保持在0.4w/w％或更高，更优选0.5w/w％或更高，甚至更优选0.6w/w％或更高，还更优选0.8w/w％或更高，最优选1.0w/w％或更高，其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。在这方面，发明人已经发现，通过在步骤(b)期间增加丙烯腈的含量，可以进一步降低丙烯酸浓度。
除了保持丙烯腈含量的最小值之外，在本文所述的任何一种方法中，在步骤(b)期间丙烯腈的含量优选保持在6w/w％或更低，优选5w/w％或更低，更优选4w/w％或更低，最优选3w/w％或更低，其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。发明人已经发现，将丙烯腈含量保持在所述上限以下，能够实现生物催化剂的优异活性并且有效降低所得丙烯酰胺水溶液中的丙烯酸浓度。此外，在丙烯腈含量超过6w/w％的值的情况下，可能发生生物催化剂的活性损失。具体地讲，在步骤(b)期间丙烯腈含量可以保持在0.3w/w％至6w/w％的范围内，优选0.4w/w％至5w/w％，更优选0.5w/w％至4w/w％，甚至更优选0.6w/w％至3w/w％，还更优选0.8w/w％至3w/w％，最优选1.0w/w％至3w/w％，其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
根据本发明任何一种方法的实施方案，具体地讲是制备丙烯酰胺水溶液的任何一种方法，在添加丙烯腈期间丙烯腈的含量不是2w/w％，其中w/w％的指示是基于反应器中组合物的总重量。这对于根据步骤(c)的丙烯腈的添加特别有效。
如上所述，在步骤(b)的生物转化期间维持高丙烯腈含量的情况下，生物催化剂的活性可能降低。在这方面，发明人已经发现，如果在第一时间段期间将丙烯腈含量保持在第一范围内之后，在第二时间段期间丙烯腈含量降低至第二范围内并保持在第二范围内，则在生物转化期间生物催化剂的活性损失减少。因此，为了实现生物催化剂的高活性和合理的反应时间，在本文所述的任何一种方法中，在步骤(b)期间保持丙烯腈含量为0.3w/w％或更高可以包含：
(i)在第一时间段期间将丙烯腈含量保持在第一范围内；
(ii)将丙烯腈含量降低至第二范围内；和
(iii)在第二时间段期间将丙烯腈含量保持在第二范围内。
具体地讲，通过采用这样的方案，其包含在生物转化期间降低丙烯腈含量，在本文所述的方法中可以实现将丙烯腈基本上完全转化为丙烯酰胺。
优选地，本发明任何一种方法的步骤(b)，其中丙烯腈含量在第一时间段期间保持在第一范围内，丙烯腈含量降低至第二范围内，并且在第二时间段期间将丙烯腈含量保持在第二范围内，包含：
(i)在30分钟至4小时的第一时间段期间将丙烯腈含量保持在1.2w/w％至6w/w％的第一范围内；
(ii)将丙烯腈含量降低至第二范围内；和
(iii)在30分钟至24小时的第二时间段期间将丙烯腈含量保持在0.3w/w％至1.2w/w％的第二范围内，
其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
更优选地，本文所述的任何一种方法的步骤(b)包含：
(i)在30分钟至3小时的第一时间段期间将丙烯腈含量保持在1.2w/w％至4w/w％的第一范围内；
(ii)将丙烯腈含量降低至第二范围内；和
(iii)在30分钟至12小时的第二时间段期间将丙烯腈含量保持在0.5w/w％至1.1w/w％的第二范围内，
其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
最优选地，本发明的任何一种方法的步骤(b)包含：
(i)在30分钟至2小时的第一时间段期间将丙烯腈含量保持在1.3w/w％至3w/w％的第一范围内；
(ii)将丙烯腈含量降低至第二范围；和
(iii)在1小时至8小时，优选1小时至5小时的第二时间段期间将丙烯腈含量保持在0.6w/w％至1.0w/w％的第二范围内，
其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
本文所述的任何一种方法可以使用连续方法进行。具体地将，本文所用的术语“连续方法”是指这样的方法，其中以连续方式生产丙烯酰胺水溶液而不在反应器中收集整个反应混合物。这意味着用于反应的原料(其可以包含生物催化剂、水和丙烯腈)连续或间歇地进料到反应器中，并且从反应器中连续或间歇地回收获得的产物。
或者，本发明的任何一种方法可以使用半间歇法(semi-batch process)进行。具体地讲，本文所用的术语“半间歇法”可以包含以不连续的方式制备丙烯酰胺水溶液。根据进行这种半间歇法的非限制性实例，将水、一定量的丙烯腈和生物催化剂置于反应器中。然后在生物转化期间进一步加入丙烯腈，直到达到组合物所需的丙烯酰胺含量。在达到所需的丙烯酰胺含量后，将所得组合物从反应器中全部回收，随后将新的反应物置于反应器中。
关于在生物转化步骤(b)期间丙烯腈的进料，根据本发明任何一种方法的非限制性实施方案，可以如此进料丙烯腈，以使在步骤(b)期间丙烯腈的含量保持在丙烯腈含量的预定值±10w/w％的范围内，优选±5w/w％，更优选±2w/w％，最优选±1w/w％，其中w/w％的指示各自是基于反应器中丙烯腈的总重量。具体地，在本发明的任何一种方法中，可以进料丙烯腈，以使在步骤(b)期间丙烯腈的含量基本在预定值上保持恒定。
通常，在本发明的任何一种方法中，可以使用傅立叶变换红外光谱(FTIR)测量在步骤(b)期间的丙烯腈含量和/或丙烯酰胺含量。具体地讲，可以使用FTIR在线测量丙烯腈含量和/或丙烯酰胺含量。
根据本发明的任何一种方法，能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂可以是编码腈水合酶的微生物。就此而言，本发明无论所述微生物是天然编码腈水合酶还是其已经被基因修饰以编码所述酶，或者天然编码腈水合酶的微生物是否已被修饰，例如能够产生更多和/或增强的腈水合酶，是不相关的。如本文所用，“编码腈水合酶的生物催化剂(例如，微生物)”等此类的这种表述通常是指所述微生物通常也能够产生并稳定保持腈水合酶。也就是说，如本文所使用的并且如技术人员容易理解的，根据本发明所使用的(天然或非天然)编码腈水合酶的生物催化剂(例如，微生物)通常还能够产生和稳定地保持腈水合酶。然而，根据本发明，这些微生物还可能仅在微生物的培养(或发酵)期间产生腈水合酶，因此含有腈水合酶，然后根据本文描述和提供的任何一种方法的步骤(a)将其加入反应器。在这种情况下，微生物可能在本文所描述和提供的方法中不产生腈水合酶，但是它们仅通过它们之前已经产生并且它们仍然含有的腈水合酶单元起作用。如本领域技术人员容易理解的，一些腈水合酶分子也可能离开微生物(例如，由于微生物的裂解)，并且作为生物催化剂在溶液中自由地起作用。因此，如本文所使用的术语“生物催化剂”也可能包含腈水合酶本身，只要其能够如本文所述和例举的将丙烯腈转化为丙烯酰胺。在本发明的背景下，也可能直接使用腈水合酶作为生物催化剂。
在本发明的背景下，天然编码腈水合酶的微生物可以用作本文所述的任何一种方法中的生物催化剂，包括属于选自以下属的物种：红球菌属(Rhodococcus)、曲霉属(Aspergillus)、食酸菌属(Acidovorax)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短根瘤菌属(Bradyrhizobium)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、埃希氏菌属(Escherichia)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、克雷伯菌属(Klebsiella)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、莫拉菌属(Moraxella)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、诺卡菌属(Nocardia)、假诺卡菌属(Pseudonocardia)、木霉属(Trichoderma)、漆斑菌属(Myrothecium)、短梗霉菌属(Aureobasidium)、假丝酵母属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、地霉属(Geotrichum)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、丛毛单胞菌属(Comomonas)和火球菌属(Pyrococcus)。在本发明的优选实施方案中，生物催化剂选自红球菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属和土芽孢杆菌属的细菌。
在本发明的任何一种方法的上下文中使用的优选生物催化剂包含红球菌属的代表。在本发明的任何一种方法的上下文中适合用作生物催化剂的物种可以包括：例如，玫瑰色红球菌(例如，NCIMB 41164、J1/FERM-BP1478、M33或M8)、嗜吡啶红球菌、红串红球菌、马红球菌、赤红球菌、不透明红球菌、黑曲霉、燕麦食酸菌、敏捷食酸菌、根癌土壤杆菌、放射形土壤杆菌、枯草芽孢杆菌、苍白芽孢杆菌、史氏芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种BR449、Bradyrhizobium oligotrophicum、高效固氮慢生根瘤菌、大豆慢生根瘤菌、Burkholderiacenocepacia、唐菖蒲伯克霍尔德菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、土芽孢杆菌属物种RAPc8(Geobacillus sp.RAPc8)、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、变栖克雷伯菌、鹰嘴豆中慢生根瘤菌、Mesorhizobium opportunistum、中慢生根瘤菌属物种F28、莫拉菌属、Pantoeaendophytica、凝聚成团泛菌、绿针假单胞菌、恶臭假单孢菌、根瘤菌属、沼泽红假单孢菌、液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、拟无枝酸菌属、节杆菌属、短杆菌属物种CH1、短杆菌属物种CH2、短杆菌属物种R312、Brevibacterium imperiale、乳酪短杆菌(Brevibacteriumcasei)、Corynebacterium nitrilophilu、假白喉棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、霍夫曼棒状杆菌、蛾微杆菌、Microbacterium smegmatis、藤黄微球菌、球形诺卡菌、玫瑰色诺卡菌、诺卡菌属物种163(Nocardia sp 163)、嗜热假诺卡菌、木霉属、疣孢漆斑菌、出芽短梗霉菌、无名假丝酵母、吉利蒙假丝酵母、热带假丝酵母、黄隐球菌、隐球菌属物种UFMG-Y28、汉逊德巴利酵母、白地霉、地霉属物种JR1、有孢汉逊酵母属、耐热克鲁维酵母、克鲁维毕赤酵母、胶红类酵母菌、睾丸酮丛毛单胞菌、Pyrococcus abyssi、激烈火球菌和堀越氏火球菌。
根据本发明的任何一种方法的一个实施方案，所使用的生物催化剂属于玫瑰色红球菌的物种。属于玫瑰色红球菌的菌株的具体实例包含NCIMB41164、J1(FERM-BP 1478)、M33和M8，其可用于本文所述的任何一种方法的上下文中。
可选地或除玫瑰色红球菌外，在本文所述的任何一种方法中使用的生物催化剂可以是嗜吡啶红球菌。
在本发明的上下文中，非天然编码腈水合酶的编码腈水合酶的微生物可以是经过基因工程处理的微生物，其天然不含有编码腈水合酶的基因，但是已被操作以含有例如编码腈水合酶的多核苷酸(例如，通过转化、转导、转染、接合或本领域已知的适合将多核苷酸转移或插入细胞的其它方法；参见Sambrook和Russell 2001,分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual),CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA)，从而使得微生物能够产生并稳定地维持腈水合酶。为此目的，可能进一步需要插入额外的多核苷酸，其可以是分别允许腈水合酶基因或mRNA的转录和翻译所必需的。此类额外的多核苷酸可尤其包含启动子序列、polyT-或polyU-尾、或复制起点或其它质粒控制序列。在本文中，这种经过基因工程处理的微生物，其天然不含有编码腈水合酶的基因，但已被操作例如以含有编码腈水合酶的多核苷酸，可以是原核或真核微生物。此类原核微生物的实例包括，例如大肠杆菌物种的代表。此类真核微生物的实例包括，例如酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。
在本发明的上下文中，术语“腈水合酶”(本文也称为NHase)通常是指能够催化丙烯腈转化(即水合)成丙烯酰胺的酶。这样的酶可以是，例如在2014年9月30日IUBMB命名法EC 4.2.1.84下注册的酶；CAS编号2391-37-5。然而，本文所用的术语“腈水合酶”还包含修饰或增强的酶，其例如能够更快地将丙烯腈转化为丙烯酰胺，或者可以以更高的产量/时间比产生，或其更稳定，只要它们能够催化丙烯腈转化(即水合)成丙烯酰胺。测定给定的生物催化剂(例如，微生物或酶)催化丙烯腈转化为丙烯酰胺的能力的方法是本领域已知的。例如，在本发明的上下文中，在本发明意义上，给定的生物催化剂作为腈水合酶起作用的活性可以如下测定：首先使100μl细胞悬浮液、细胞裂解物、溶解的酶粉末或含有假定的腈水合酶的任何其它制剂与875μl 50mM磷酸钾缓冲液和25μl丙烯腈在25℃在Eppendorf管振荡器上以1,000rpm反应10分钟。在10分钟的反应时间后，可以抽取样品，并通过加入相同体积的1.4％盐酸立即淬灭。样品混合后，可以通过在10,000rpm离心1分钟除去细胞，并通过HPLC分析澄清上清液来测定形成的丙烯酰胺的量。为了在本发明的背景下确认酶是腈水合酶，丙烯酰胺的浓度应当在0.25和1.25mmol/l之间，在必要时，样品必须相应地稀释，并且必须重复转化。然后可以通过将来自HPLC分析的丙烯酰胺浓度除以反应时间(其为10分钟)，并通过将该值与HPLC样品和原始样品之间的稀释因子相乘，从丙烯酰胺的浓度推导出酶活性。活性>5U/mg干细胞重量，优选>25U/mg干细胞重量，更优选>50U/mg干细胞重量，最优选>100U/mg干细胞重量，表明存在功能性表达的腈水合酶，并且在本发明的背景下被认为是腈水合酶。
在本发明的背景下，腈水合酶可以是由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含或由一段核苷酸序列组成，其与以下的核苷酸序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.5％，并且最优选100％的同一性：SEQ ID NO:1的核苷酸序列(玫瑰色红球菌的腈水合酶的α-亚基：
GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACCAAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCCGCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGCCCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCTGAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCGTCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTCTTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGTTCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTACAAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGAGTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAGGTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATCCCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTGACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCGCTCACACCGCAGGAAGTGATCGTATGA)和/或SEQ ID NO：3的核苷酸序列(玫瑰色红球菌的腈水合酶的β-亚基：
ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCGGTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAGGGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATATCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAACGAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGGCTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACCGAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTCGGTACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATCGAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTTCCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTGAAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTGCGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATCTATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCGCTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGACGGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTACCTGATCTCTGCGTGA)，
条件是所述多核苷酸编码的多肽能够如本文所述和例举的催化丙烯腈水合成丙烯酰胺(即具有腈水合酶活性)。同样在本发明的背景下，腈水合酶可以是多肽，其包含或由一段氨基酸序列组成，其与以下的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.5％，并且最优选100％的同一性：SEQ ID NO：2的氨基酸序列(玫瑰色红球菌的腈水合酶的α-亚基：VSEHVNKYTE YEAKTKAIETLLYEKGLITP AAVDKVVSYY ENEIGPMGGA KVVAKSWVDP EYRKWLEEDA TAAMASLGYA GEQAHQISAVFNDSQTHHVV VCTLCSCYPW PVLGLPPAWY KSMEYRSRVV ADPRGVLKRD FGFDIPDEVE VRVWDSSSEIRYIVIPERPA GTDGWSEEEL TKLVSRDSMI GVSNALTPQE VIV)，和/或SEQ ID NO：4的氨基酸序列(玫瑰色红球菌的腈水合酶的β-亚基：
MDGIHDTGGM TGYGPVPYQK DEPFFHYEWE GRTLSILTWM
HLKGISWWDK SRFFRESMGN ENYVNEIRNSY YTHWLSAAE RILVADKIIT EEERKHRVQEILEGRYTDRK PSRKFDPAQI EKAIERLHEP HSLALPGAEP SFSLGDKIKV KSMNPLGHTR CPKYVRNKIGEIVAYHGCQI YPESSSAGLG DDPRPLYTVA FSAQELWGDD GNGKDVVCVD LWEPYLISA)，条件是所述多肽能够如本文所述和例举的催化丙烯腈水合成丙烯酰胺。
两个或更多个序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)之间的同一性水平可以通过本领域已知的方法容易地确定，例如通过BLAST分析。通常，在本发明的上下文中，如果通过例如序列比对来进行比较的两个序列(例如，多核苷酸序列或氨基酸序列)的同一性不同，则术语“同一性”可以指较短的序列和与所述较短序列匹配的较长序列的那部分。因此，当比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度可以优选地指较短序列中与较长序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比，或者指较长序列中与较短序列中的核苷酸序列相同的核苷酸的百分比。在本文中，技术人员容易确定与较短序列匹配的较长序列的那部分。此外，如本文所使用的，核酸序列或氨基酸序列的同一性水平可以指相应序列的整个长度，并且优选成对评估，其中每个空位计为一个错配。序列比对的这些定义(例如，“同一性”值的建立)适用于本文所描述和公开的所有序列。
此外，如本文所使用的术语“同一性”是指在相应序列之间存在功能和/或结构的等同物。与本文所述的特定核酸/氨基酸序列具有给定同一性水平的核酸/氨基酸序列可以表示这些序列的衍生物/变体，其优选具有相同的生物学功能。它们可以是天然存在的变异，例如来自其他品种、物种等的序列，或突变，并且所述突变可以是天然形成的或可以通过有意诱变产生。此外，变异可以是合成产生的序列。变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。与上述核酸序列的偏差可以通过例如缺失、替代、添加、插入和/或重组产生。术语“添加”是指在给定序列的末端添加至少一个核酸残基/氨基酸，而“插入”是指在给定序列中插入至少一个核酸残基/氨基酸。术语“缺失”是指删除或去除给定序列中的至少一个核酸残基或氨基酸残基。术语“替代”是指替换给定序列中的至少一个核酸残基/氨基酸残基。同样，这里使用的这些定义根据实际情况可适用于本文所提供和描述的所有序列。
通常，如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”或“核酸分子”应当同义地解释。通常，核酸分子尤其可以包含DNA分子、RNA分子、寡核苷酸硫代磷酸酯、取代的核糖寡核苷酸或PNA分子。此外，术语“核酸分子”可以指本领域已知的DNA或RNA或其杂交物或其任何修饰(参见例如US5525711、US 4711955、US 5792608或EP 302175中修饰的实例)。多核苷酸序列可以是单链或双链、线性或环状、天然或合成的，并且没有任何大小限制。例如，多核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA、线粒体DNA、mRNA、反义RNA、核酶RNA或编码此类RNA或嵌合体的DNA(Gamper,核酸研究(Nucleic Acids Research),2000,28,4332-4339)。所述多核苷酸序列可以是载体、质粒或病毒DNA或RNA的形式。本文还描述了与上述核酸分子互补的核酸分子以及能够与本文所述的核酸分子杂交的核酸分子。本文所述的核酸分子还可以是本发明上下文中的核酸分子的片段。具体地讲，这样的片段是功能性片段。这种功能性片段的实例是能够用作引物的核酸分子。
当在本发明的任何一种方法中将生物催化剂添加到反应器中时，生物催化剂可以直接从发酵液中获得。进一步设想，生物催化剂可以以发酵液的形式用于本文公开的方法中。因此，生物催化剂不需要从发酵液中分离，并且包含生物催化剂的发酵液可以用于生物转化。例如，可以将包含生物催化剂的发酵液加入到本发明方法的步骤(a)中的反应器中。或者，根据本文所述的任何一种方法，生物催化剂在加入反应器之前可以被干燥。在此处，术语“之前”不一定意味着生物催化剂已经干燥，然后直接加入到反应器中。相当充分的是，在将生物催化剂加入到反应器中之前的任何时间，生物催化剂已经经历了干燥步骤，这与干燥和添加之间是否进行其他的步骤无关。作为非限制性实例，在干燥步骤和添加到反应器中之间的这些其他的步骤可以是储存或重配。然而，也可以在干燥后直接将生物催化剂加入反应器中。发明人惊奇地发现，与使用在用于生物转化之前没有经历干燥的生物催化剂的情况相比，通过使用已经经历干燥步骤的生物催化剂，本文所述的任何一种方法所获得的丙烯酰胺水溶液中的丙烯酸浓度进一步降低。
关于干燥方法，在本文提供的任何一种方法中，可以使用已经用冷冻干燥、喷雾干燥、加热干燥、真空干燥、流化床干燥和/或喷雾造粒干燥的生物催化剂。在这方面，优选喷雾干燥和冷冻干燥，因为通常通过使用已经进行喷雾或冷冻干燥的生物催化剂，与使用其它方法干燥的生物催化剂相比，实现了所获得的丙烯酰胺水溶液中的丙烯酸浓度更大的降低。
根据本发明的任何一种方法，可以将干燥的生物催化剂加入到反应器中。这意味着生物催化剂以干燥形式加入到反应器中。具体地讲，生物催化剂可以具有粉末或颗粒的形式。作为向反应器中加入干燥的生物催化剂的替代方案，干燥的生物催化剂可以在加入反应器之前重配。例如，生物催化剂可以通过悬浮在水性组合物中来重配。在这方面，水性组合物可以是水或缓冲液。作为另一种选择，可以将基质结合的微生物形式的生物催化剂加入到反应器中。
本文所用的术语“干燥的生物催化剂”是指已经经历干燥步骤的生物催化剂。干燥的生物催化剂通常具有小于约20w/w％，更优选小于约15w/w％，甚至更优选小于约14w/w％，最优选约5至约10w/w％的水分含量，其基于生物催化剂样品的总重量。确定水分含量的方法是本领域技术人员熟悉的。例如，在本发明的上下文中，干燥的生物催化剂样品的水分含量可以通过热重分析来确定。在热重分析开始时，确定样品的初始重量。然后加热样品，水分蒸发。继续加热直到样品重量保持恒定。分析结束时的恒定重量和初始重量之间的差表示在分析期间蒸发的水量，其能够计算样品的水分含量。为了通过热重分析测定水分含量，生物催化剂样品可以例如在130℃下操作的“Mettler Toledo HB43-S卤素水分分析仪”上分析，直到样品重量保持恒定至少30秒。
通过进行本文所述的任何一种方法，可以与生物催化剂一起获得丙烯酰胺水溶液。因此，可以从得到的丙烯酰胺水溶液中分离生物催化剂。生物催化剂的这种分离可以考虑所需的应用进行，其可以例如包含丙烯酰胺的均聚或共聚。用于分离生物催化剂的合适方法是本领域已知的，并且包括例如离心、沉降(例如，絮凝)、膜分离和过滤。
本发明还涉及通过本文所述和提供的任何一种方法可获得的或获得的丙烯酰胺水溶液。
丙烯酰胺水溶液，具体地讲是通过本文所述的任何一种方法可获得的或获得的丙烯酰胺水溶液，可以含有35至65w/w％的丙烯酰胺，并且丙烯酸浓度可以不超过1500ppm，优选不超过1000ppm，更优选不超过750ppm，进一步优选不超过500ppm，甚至更优选不超过300ppm，还更优选不超过200ppm，并且最优选不超过100ppm，其中w/w％和ppm的指示各自基于溶液的总重量，并且ppm各自涉及重量份数。
优选地，丙烯酰胺水溶液含有40至60w/w％的丙烯酰胺，并且丙烯酸浓度不超过1500ppm，优选不超过1000ppm，更优选不超过750ppm，进一步优选不超过500ppm，甚至更优选不超过300ppm，还更优选不超过200ppm，并且最优选不超过100ppm，其中w/w％和ppm的指示各自基于溶液的总重量，并且ppm各自涉及重量份数。
更优选地，丙烯酰胺水溶液包含45至55w/w％的丙烯酰胺，并且丙烯酸浓度不超过1500ppm，优选不超过1000ppm，更优选不超过750ppm，进一步优选不超过500ppm，甚至更优选不超过300ppm，还更优选不超过200ppm，最优选不超过100ppm，其中w/w％和ppm的指示各自基于溶液的总重量，并且ppm各自涉及重量份数。
最优选地，丙烯酰胺水溶液含有50至54w/w％的丙烯酰胺，并且丙烯酸浓度不超过1500ppm，优选不超过1000ppm，更优选不超过750ppm，进一步优选不超过500ppm，甚至更优选不超过300ppm，还更优选不超过200ppm，最优选不超过100ppm，其中w/w％和ppm的指示各自基于溶液的总重量，并且ppm各自涉及重量份数。
在任何一种丙烯酰胺水溶液中，丙烯酰胺含量和/或丙烯酸浓度可以使用HPLC测定。优选地，使用HPLC方法，如下面实施例所述。
此外，本发明涉及通过聚合如本文所述的水溶液的丙烯酰胺可获得的或获得的丙烯酰胺均聚物或共聚物。在这方面，在均聚物的情况下，术语“聚合”是指均聚反应，而在共聚物的情况下，术语“聚合”是指共聚反应。均聚或共聚可以使用通过本文所述的任何一种方法可获得的或获得的丙烯酰胺水溶液进行。具体地讲，可以使用在聚合之前已经从中分离生物催化剂的丙烯酰胺水溶液。或者，丙烯酰胺可以在进行均聚或共聚之前从丙烯酰胺水溶液中分离。
丙烯酰胺均聚物或共聚物，具体地讲是通过聚合如本文所述水溶液的丙烯酰胺可获得的或获得的丙烯酰胺均聚物或共聚物，可具有60,000ppm或更少的丙烯酸含量，优选20,000ppm或更少，更优选10,000ppm或更低，并且最优选2,000ppm或更少，其中ppm的指示各自涉及重量份数，并且各自基于固体丙烯酰胺均聚物或共聚物的总重量。
在丙烯酰胺溶液中的高丙烯酸含量可导致所得聚丙烯酰胺均聚物和共聚物的性能降低，特别是阳离子聚丙烯酰胺产物，即，丙烯酰胺与阳离子共聚单体的共聚物。这对于具有低阳离子共聚单体含量的阳离子共聚物是非常明显的。不希望受任何理论限制，共聚物链内的阴离子丙烯酸和阳离子共聚单体的摩尔当量导致电荷复合物的产生。这可显著损害聚丙烯酰胺材料的物理性质，降低在诸如水处理、造纸、油回收或采矿的应用中的溶解性和性能。
关于丙烯酸的这种影响，本文描述和提供的丙烯酰胺均聚物或共聚物优选是阳离子聚丙烯酰胺。如本领域技术人员通常已知的，术语“阳离子聚丙烯酰胺”表示除丙烯酰胺单体外还含有阳离子共聚单体的共聚物，例如，包含季铵基团的共聚单体。特别优选是丙烯酸含量为60,000ppm或更少，优选20,000ppm或更少，更优选10,000ppm或更少，并且最优选2,000ppm或更少的阳离子聚丙烯酰胺，其中ppm的指示各自涉及重量份数，并且各自基于固体丙烯酰胺均聚物或共聚物的总重量。
通常，本文所述的任何聚合物或共聚物的丙烯酸含量可以使用本领域已知的方法测定，例如NMR光谱法，如欧洲聚合物杂志(European Polymer Journal)(2007)，43(3):824-834中所述。
丙烯酰胺均聚物和/或共聚物，例如用于油田应用中。具体地讲，在三级油回收中使用丙烯酰胺均聚物和/或共聚物，其也称为提高的油回收。在这方面，在三级油回收的方法中，可以将聚合物的水溶液注入岩石中，以促进油置换并因此提高原油的产量。因此，本发明还涉及本文所述的任何丙烯酰胺均聚物和/或共聚物的水溶液。作为水溶液的水，可以使用海水。
本说明书包括可用于理解本发明的信息。这不表示承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确或暗示地承认参考的任何出版物是现有技术。
应当注意，除非上下文另有明确说明，否则本文所使用的单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，并且提及“该方法”包括提及本领域普通技术人员已知的等价步骤和方法，其可以被本文所述的方法所修饰或替代。
本领域技术人员可使用不超出常规的实验来确认或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。本发明旨在包含这样的等同物。
除非另有说明，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个要素。本领域技术人员可使用不超出常规的实验来确认或能够确定本文所述的方法和用途的具体实施方案的许多等同物。本发明旨在包含这样的等同物。
在本公开文本的整个文本中引用了几个文献。无论是上文还是下文，本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)都以整体引用的方式并入本文。在所引用的材料与本说明书矛盾或不一致的情况下，本说明书将取代任何这样的材料。本文中的任何内容不应被解释为承认本发明由于引用了以前的发明而没有资格早于这些公开物。
在本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”及其变体如“包括”将被理解为暗示包括所述整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或者整体或步骤的组。在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或有时在本文中用术语“具有”替代。
在本文中使用时，“由...组成”排除了没有在权利要求要素中指定的任何要素、步骤或成分。在本文中使用时，“基本上由......组成”不排除实质上不影响权利要求的基本和新颖的特征的材料或步骤。在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个可以用其它两个术语之一替代。
如本文所使用的，多个所述要素之间的连接词“和/或”被理解为包含单独的和组合的选项。例如，当两个要素通过“和/或”连接时，第一个选项指的是采用没有第二个要素的第一个要素。第二个选项指的是采用没有第一个要素的第二个要素。第三种选项指的是采用第一和第二要素共同。这些选项中的任何一个被理解为落入该含义内，并且因此满足本文所使用的术语“和/或”的要求。多于一个选项的同时采用也被理解为落入该含义内，并且因此满足本文所使用的术语“和/或”的要求。
如本文所使用的词语“约”是指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内的值，其将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准偏差内。术语“约”还用于指示所讨论的量或值可以是指定的值或接近该值的某个其它值。该短语旨在表达类似的值促进本发明的等价结果或效果。在本文中，“约”可以指高于和/或低于最多10％的范围。词语“约”在一些实施方案中是指高于和低于某个值的范围，其高于或低于该值最多5％，例如最多2％，最多1％或最多0.5％。在一个实施方案中，“约”是指高于和低于给定值的最多0.1％的范围。
一般来说，本发明涉及本文所述的所有实施方案以及其所有排列和组合。本文描述的任何特定方面或实施方案不应被解释为限制本发明在这些方面或实施方案的范围。
以下实施例进一步描述和举例说明了本文提供的本发明，但不将本发明限制于其中限定的任何说明或实施方案中。
实施例
实施例1：
以半间歇法，将丙烯腈和2446g水置于玻璃反应器中，其中每次运行加入丙烯腈使得在反应器中达到如下表1中所示的丙烯腈浓度。然后加入干燥的生物催化剂玫瑰色红球菌菌株NCIMB 41164以启动生物转化。在生物转化期间，以控制的速率进一步加入丙烯腈，同时丙烯腈的含量恒定保持在表1中所述的初始值。在这方面，在生物转化期间使用傅立叶变换红外光谱(FTIR)在线测量丙烯腈和丙烯酰胺的含量。总而言之，将1553g丙烯腈转化为丙烯酰胺，丙烯腈是在开始生物转化之前在反应器中放置的和在反应期间加入的丙烯腈的总量。在反应结束时，获得4kg丙烯酰胺水溶液，其含量为基于反应器中组合物总重量的52w/w％丙烯酰胺。
下表1显示了分别在20℃和26℃的温度下在前述段落中描述的方法的不同运行，其中使用不同量的生物催化剂，并且在生物转化期间将丙烯腈含量保持在不同的值。
表1
Figure BDA0001253723580000241
Figure BDA0001253723580000251
*在生物转化期间使用傅立叶变换红外光谱(FTIR)在线测量
**根据以下提供的方法使用HPLC测定
表1中概述的结果表明，通过将生物转化期间的丙烯腈含量保持在0.3w/w％或更多，产生具有低浓度丙烯酸的丙烯酰胺水溶液。具体地讲，结果表明通过增加在生物转化期间保持的丙烯腈含量，所得丙烯酰胺水溶液中的丙烯酸浓度降低。
实施例2：
在与实施例1相同的条件下进行丙烯腈到丙烯酰胺的生物转化的运行，除了：
(i)从生物转化开始1小时内保持较高的丙烯腈含量；
(ii)在生物转化开始1小时后，丙烯腈含量降低至较低的丙烯腈含量；和
(iii)保持较低的丙烯腈含量直到生物转化结束，即直到1553g丙烯腈转化为形成4kg丙烯酰胺水溶液，其含量为基于反应器中组合物总重量的52w/w％丙烯酰胺含量。
具体条件和结果示于表2中。
表2
Figure BDA0001253723580000261
*在生物转化期间使用傅立叶变换红外光谱(FTIR)在线测量
**根据以下提供的方法使用HPLC测定
在表2的运行1中，在整个生物转化期间丙烯腈的含量保持在0.8w/w％。在运行2和3中，分别保持较高含量的1.5和2w/w％的丙烯腈，直到生物转化开始1小时。1小时后，丙烯腈的含量降至0.8w/w％，并保持该值直至生物转化结束。
结果表明，在直到生物转化结束所需的相当的时间中，在一段时间内保持较高丙烯腈含量、然后丙烯腈含量降低到较低的丙烯腈含量、并且保持该较低的丙烯腈含量直到生物转化结束的情况下，所得丙烯酰胺水溶液中丙烯酸的浓度进一步降低。
实施例3：
将水和18g丙烯腈放入反应器中。调节水的量，使水和生物催化剂的总量为1835g。生物催化剂的两种不同形式(i)和(ii)用于独立的运行中，如下所述：
(i)含有玫瑰色红球菌菌株J1(FERM-BP 1478)细胞的发酵液，其具有1512kU/kg的NHase活性和96.1w/w％的水含量；和
(ii)将(i)通过离心浓缩至83.6w/w％的水含量，然后冷冻干燥浓缩物而获得干粉。干燥粉末的水含量为13w/w％，NHase活性为211kU/g。
将生物催化剂加入到反应器中，由此开始反应。在生物转化期间，加入额外的1147g丙烯腈，使得最终的总反应批量大小为3000g。在反应期间温度保持恒定在23℃。在生物转化期间使用傅立叶变换红外光谱(FTIR)在线测量丙烯腈的含量，并且调节丙烯腈的添加速率，使得反应混合物中的丙烯腈含量保持恒定在1.0±0.1w/w％或0.3w/w％，直到将全部丙烯腈加入到反应器中。在丙烯腈含量由于转化降低到<100ppm后停止反应。在反应结束时，每次运行中的丙烯酰胺浓度为≥51w/w％。
条件和结果示于下表3中。
表3
Figure BDA0001253723580000271
*在生物转化期间使用傅立叶变换红外光谱(FTIR)在线测量
**根据以下提供的方法使用HPLC测定
表3的结果表明，通过在生物转化中使用干燥的生物催化剂，其中丙烯腈含量保持恒定，所得丙烯酰胺水溶液中丙烯酸的浓度与使用未经过干燥的生物催化剂相比降低。
在上述实施例中，使用HPLC测定所得丙烯酰胺水溶液中丙烯酸的浓度。应用以下条件以测定丙烯酰胺、丙烯酸和丙烯腈的含量：
Figure BDA0001253723580000272
Figure BDA0001253723580000281
梯度：
时间[min] A[％] B[％] 流速[ml/min]
0.0 90.0 10.0 1.00
8.0 90.0 10.0 1.00
基质：发酵液、生物转化混合物
样品通过0.22μm过滤
分析物：
保留时间[min]
丙烯酰胺 3.29
丙烯酸 3.91
丙烯腈 4.35
Figure IDA0001253723610000011
Figure IDA0001253723610000021
Figure IDA0001253723610000031

Claims (52)

1.制备丙烯酰胺水溶液的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)将下列组分(i)至(iii)加入反应器中以获得用于生物转化的组合物：
(i)能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂，其中所述生物催化剂是玫瑰色红球菌；
(ii)丙烯腈；
(iii)水；和
(b)对步骤(a)中获得的组合物进行生物转化；
(c)进一步加入丙烯腈，并在步骤(b)期间将丙烯腈的含量保持在0.3w/w％或更多，持续10分钟至48小时，其中w/w％的指示是基于反应器中组合物的总重量，
其中所述的进一步加入丙烯腈包含：
(i)在30分钟至4小时的第一时间段期间将丙烯腈含量保持在1.2w/w％至6w/w％的第一范围内；
(ii)将丙烯腈含量从所述第一范围降低至0.3w/w％至1.2w/w％的第二范围内；和
(iii)在30分钟至24小时的第二时间段期间将丙烯腈含量保持在所述第二范围内，
其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
2.制备丙烯酰胺水溶液的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)将下列组分(i)至(iii)加入反应器中以获得用于生物转化的组合物：
(i)能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂，其中所述生物催化剂是玫瑰色红球菌；
(ii)丙烯腈；
(iii)水；和
(b)对步骤(a)中获得的组合物进行生物转化；
(c)进一步加入丙烯腈，并在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，直到丙烯酰胺含量至少为20w/w％，其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量，
其中所述的进一步加入丙烯腈包含：
(i)在30分钟至4小时的第一时间段期间将丙烯腈含量保持在1.2w/w％至6w/w％的第一范围内；
(ii)将丙烯腈含量从所述第一范围降低至0.3w/w％至1.2w/w％的第二范围内；和
(iii)在30分钟至24小时的第二时间段期间将丙烯腈含量保持在所述第二范围内，
其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，直到丙烯酰胺含量为至少25w/w％。
4.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，直到丙烯酰胺含量为至少30w/w％。
5.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，直到丙烯酰胺含量为至少35w/w％。
6.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，直到丙烯酰胺含量为至少40w/w％。
7.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，直到丙烯酰胺含量为至少42.5w/w％。
8.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，直到丙烯酰胺含量为至少45w/w％。
9.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，直到丙烯酰胺含量为至少47.5w/w％。
10.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更多，直到丙烯酰胺含量为至少50w/w％。
11.降低丙烯酰胺水溶液的丙烯酸浓度的方法，其中所述丙烯酰胺水溶液是通过使用生物催化剂将丙烯腈转化为丙烯酰胺的方法制备，所述方法包含以下步骤：
(a)将以下组分(i)至(iii)加入反应器中以获得用于生物转化的组合物：
(i)能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂，其中所述生物催化剂是玫瑰色红球菌；
(ii)丙烯腈；
(iii)水；和
(b)对步骤(a)中获得的组合物进行生物转化；
(c)进一步加入丙烯腈，并在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更高，其中w/w％的指示是基于反应器中组合物的总重量，
其中所述的进一步加入丙烯腈包含：
(i)在30分钟至4小时的第一时间段期间将丙烯腈含量保持在1.2w/w％至6w/w％的第一范围内；
(ii)将丙烯腈含量从所述第一范围降低至0.3w/w％至1.2w/w％的第二范围内；和
(iii)在30分钟至24小时的第二时间段期间将丙烯腈含量保持在所述第二范围内，
其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
12.根据权利要求1-11任一项所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为1500ppm或更少，其中ppm的指示各自涉及重量份数，并且各自基于在生物转化结束时组合物的总重量。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为1200ppm或更少。
14.根据权利要求12所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为1000ppm或更少。
15.根据权利要求12所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为750ppm或更少。
16.根据权利要求12所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为500ppm或更少。
17.根据权利要求12所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为300ppm或更少。
18.根据权利要求12所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为200ppm或更少。
19.根据权利要求12所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为100ppm或更少。
20.制备丙烯酰胺水溶液的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将下列组分(i)至(iii)加入反应器中以获得用于生物转化的组合物：
(i)能够将丙烯腈转化为丙烯酰胺的生物催化剂，其中所述生物催化剂是玫瑰色红球菌；
(ii)丙烯腈；
(iii)水；
(b)对步骤(a)中获得的组合物进行生物转化；
(c)进一步加入丙烯腈，并在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为0.3w/w％或更高，其中w/w％的指示是基于反应器中组合物的总重量；和
(d)获得组合物，其中在生物转化结束时，组合物的丙烯酸浓度为1500ppm或更少，其中ppm的指示各自涉及重量份数，并且各自基于在生物转化结束时组合物的总重量，
其中所述的进一步加入丙烯腈包含：
(i)在30分钟至4小时的第一时间段期间将丙烯腈含量保持在1.2w/w％至6w/w％的第一范围内；
(ii)将丙烯腈含量从所述第一范围降低至0.3w/w％至1.2w/w％的第二范围内；和
(iii)在30分钟至24小时的第二时间段期间将丙烯腈含量保持在所述第二范围内，
其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为1200ppm或更少。
22.根据权利要求20所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为1000ppm或更少。
23.根据权利要求20所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为750ppm或更少。
24.根据权利要求20所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为500ppm或更少。
25.根据权利要求20所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为300ppm或更少。
26.根据权利要求20所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为200ppm或更少。
27.根据权利要求20所述的方法，其中在生物转化结束时组合物的丙烯酸浓度为100ppm或更少。
28.根据权利要求1-11和13-27中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)至(c)期间，生物催化剂、丙烯腈和水以重量比为0.001至0.5w/w％的生物催化剂、22至45w/w％的丙烯腈和平衡至100w/w％的水加入；其中在每种情况下w/w％的指示是基于在步骤(a)至(c)期间加入的生物催化剂、丙烯腈和水的组合重量的总重量。
29.根据权利要求28所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)至(c)期间，生物催化剂、丙烯腈和水以重量比为0.005至0.2w/w％的生物催化剂、26至42w/w％的丙烯腈和平衡至100w/w％的水加入。
30.根据权利要求28所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)至(c)期间，生物催化剂、丙烯腈和水以重量比为0.01至0.1w/w％的生物催化剂、30至40w/w％的丙烯腈和平衡至100w/w％的水加入。
31.根据权利要求28所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)至(c)期间，生物催化剂、丙烯腈和水以重量比为0.015至0.065w/w％的生物催化剂、35至39w/w％的丙烯腈和平衡至100w/w％的水加入。
32.权利要求1-11和13-27中任一项的方法，其中步骤(b)中的生物转化在5℃至40℃进行10分钟至48小时。
33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(b)中的生物转化在5℃至35℃进行10分钟至48小时。
34.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(b)中的生物转化在15℃至30℃进行10分钟至48小时。
35.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(b)中的生物转化在20℃至28℃进行10分钟至48小时。
36.根据权利要求1-11和13-27中任一项所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为6w/w％或更低，其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
37.根据权利要求36所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为5w/w％或更低。
38.根据权利要求36所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为4w/w％或更低。
39.根据权利要求36所述的方法，其中在步骤(b)期间保持丙烯腈的含量为3w/w％或更低。
40.根据权利要求1-11和13-27中任一项所述的方法，其中所述第一范围为1.2w/w％至4w/w％，所述第一时间段为30分钟至3小时，所述第二范围为0.5w/w％至1.1w/w％，且所述第二时间段为30分钟至12小时，其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述第一范围为1.3w/w％至3w/w％，所述第一时间段为30分钟至2小时，所述第二范围为0.6w/w％至1.0w/w％，且所述第二时间段为1小时至8小时，其中w/w％的指示各自是基于反应器中组合物的总重量。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述第二时间段为1小时至5小时。
43.根据权利要求1-11和13-27中任一项所述的方法，其中所述方法使用半间歇法进行。
44.根据权利要求1-11和13-27中任一项所述的方法，其中在步骤(b)期间使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)测量丙烯腈含量和/或丙烯酰胺含量。
45.根据权利要求1-11和13-27中任一项所述的方法，其中所述的生物催化剂编码腈水合酶。
46.根据权利要求1-11和13-27中任一项所述的方法，其中生物催化剂选自玫瑰色红球菌的菌株NCIMB 41164、J1(FERM-BP 1478)、M33和M8。
47.根据权利要求1-11和13-27中任一项所述的方法，其中生物催化剂在加入到反应器之前已经干燥。
48.根据权利要求47所述的方法，其中生物催化剂已经使用冷冻干燥、喷雾干燥、加热干燥、真空干燥、流化床干燥和/或喷雾造粒进行干燥。
49.根据权利要求48所述的方法，其中生物催化剂已经使用喷雾干燥或冷冻干燥进行干燥。
50.根据权利要求47所述的方法，其中将干燥的生物催化剂加入到反应器中。
51.根据权利要求47所述的方法，其中干燥的生物催化剂在加入到反应器之前进行重配。
52.根据权利要求51所述的方法，其中生物催化剂通过悬浮在水性组合物中来重配。
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