CN106701753B - 柑橘类植物Cit sh1基因启动子、分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柑橘类植物Cit sh1基因的启动子、分子标记及应用，其中，柑橘类植物Cit sh1基因的启动子由SEQ ID:1～SEQ ID:6中任意一条的核苷酸序列组成。本发明通过获得易诱发人体上火等炎症反应相关蛋白Cit sh1的基因序列信息，对特异性引物进行改进，分别获得了柑橘类植物Cit sh1基因的启动子、基于柑橘类植物Cit sh 1基因启动子序列差异的分子标记，能够有效解决现有的分子标记无法判断柑橘类植物是否诱发人体炎症的问题，并且该分子标记可以将上火柑橘品种和不上火柑橘品种有效地区分开来，为例如柑橘育种选育不上火品种提供支持。

Description

柑橘类植物Cit sh1基因启动子、分子标记及应用

技术领域

本发明属于柑橘类植物生物技术领域，更具体的，涉及柑橘类植物Cit sh1基因启动子、分子标记及应用，通过该分子标记对柑橘类植物(包括本地早、国庆1号、红夏橙以及高斑柚等)进行检测，得出该柑橘类植物是否诱发人体上火的结论。该分子标记可以将上火柑橘品种和不上火柑橘品种有效地区分开来，并且可为柑橘育种选育不上火品种奠定基础。

背景技术

“上火”(热量增加)是一个非常流行的中医概念，起源于传统的中医理论，在亚洲被人们所熟知。“上火”症状主要包括嘴唇干裂、口腔灼热、嘴唇和喉咙发痒肿胀、脸变红、便秘、腹泻，体温升高等【13】。两千年以来，中国和印度人都坚信相对于人的身体来讲，食物有“热性”和“寒性”之分。这个区分和食物本身的温度没有关系，主要是就它们对食用者产生的影响而言的。人体很多生理、疾病状态都和“热性”、“寒性”相关，而和自身的体温无关【3,13】。传统上，人们认为荔枝、龙眼、宽皮柑橘、榴莲、椰子、花生等是“热性”食物，过量食用(剂量依赖性)会诱导产生“上火”症状。很多人都有过“上火”的经历，严重影响了他们的生活质量。“上火”患者坚信食物不耐受是导致他们产生“上火”症状的主要原因，并且饮食上剔除某些“热性”食物可以有效地缓解他们的症状。

柑橘果实富含维生素C、类胡萝卜素，类黄酮和类柠檬苦素类等多种生物活性功能成分【11】，具有抗氧化、抗癌、预防心脑血管疾病等作用【4,5,12】，是含功能性成分最多的保健水果之一。另外，柑橘是世界上栽培面积最广泛以及消费最多的水果之一，在很多国家，柑橘以三种主要形式存在于人们的日常饮食中：鲜食、果汁以及罐头。在中国，柑橘品种繁多，但历来以宽皮柑橘为主，从产量上看，宽皮柑橘、橙、柚的比例分别为73.1％、13.5％以及12.2％【14】。经验上，温州蜜柑(宽皮柑橘)被认为是“热性”食物，容易引起“上火”；甜橙、柚不引起“上火”。因此，过多食用温州蜜柑果实后，很多食用者会出现“上火”症状，从而限制了柑橘产业的发展以及柑橘营养功能的发挥。

“上火”是中医概念，在中国被广为接受，国际上尚未有报道；“过敏”是国际上报到最多的由水果诱导的疾病。水果过敏最常见的症状是口腔反应，该症状发病轻微，仅出现在口腔部位，表现为发痒、肿胀等，称 为口腔过敏综合征(oral allergy syndrome,OAS)【8】,与“上火”出现的口腔症状非常相似。目前，国际上已分离出三种柑橘过敏原：Cit s 1(orange germin-like glycoprotein)、Cit s 2(profilin)、Cit s 3(lipid transferprotein)。Cit s 1和Cit s 3均可以从甜橙果肉、果皮中分离得到，SDS-PAGE和免疫检测揭示，它们在果皮和果肉中含量相当；Cit s 2亦存在于甜橙果肉、果皮，其在果肉中的含量远高于果皮【1,2,7】。桃果实中与上述过敏原相对应的蛋白质是Pru p 1～Pru p 3，其中，Prup 1在果皮和果肉中的平均含量分别为0.62ug/g、0.26ug/g鲜重；相应的，Pru p 3平均含量分别为132.86ug/g、0.61ug/g鲜重，表明Pru p 3主要存在于果皮中【9】。

尽管上述柑橘过敏原(蛋白质)在一定程度上揭示了导致柑橘类水果诱发过敏的原因，能够在一定程度上对柑橘类水果提前进行过敏筛选，但这些过敏原往往并不是“上火”症状的主要诱因，过敏反应是机体自身的一种免疫反应，与摄入量无关，而“上火”症状既与摄入的水果类别有关，又与摄入量有关，并且，这些已发现的过敏原大部分位于果皮中，而大部分柑橘类水果主要是食用它们的果肉部分，对在实际中过敏筛选的效果并不明显。此外，由于过敏涉及的过敏原种类较多，且与机体(如人体)自身条件有关，人体对柑橘类水果过敏的案例较为罕见，而“上火”反应在人群中发生则较为普遍，因此，为减小柑橘类水果诱发的“上火”反应，在柑橘育种选育中对柑橘类植物“上火”性状的筛选更加必要。

相关参考文献如下：

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【14】何劲，祁春节(2010)."中外柑橘产业发展模式的比较与借鉴."经济纵横2:110-113.

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种柑橘类植物Cit sh1基因的启动子、分子标记及应用，其中通过对关键的易诱发人体“上火”反应相关蛋白对应的Cit sh1基因启动子进行克隆，对特异性引物等进行改进，与现有技术相比能够有效解决现有的分子标记无法判断柑橘类植物是否诱发人体“上火”的问题，并且该分子标记可以将上火柑橘品种和不上火柑橘品种有效地区分开来，为例如柑橘育种选育不上火品种提供支持。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种柑橘类植物Cit sh1基因的启动子，其特征在于，该启动子由SEQ ID:1～SEQ ID:6中任意一条的核苷酸序列组成。

按照本发明的又一个方面，提供了一种基于柑橘类植物Cit sh 1基因启动子序列差异的分子标记，其特征在于，该分子标记是通过特异性引物进行PCR扩增得到的，所述特异性引物的正向引物的碱基序列优选为ATTCTGGGAAATCAGGTGG，反向引物的碱基序列优选为AGAGGCTAGAAGCTCAATGTA。

按照本发明的又一个方面，提供了一种上述分子标记在检测和区分柑橘类植物是否引起炎症中的应用。

按照本发明的又一个方面，提供了一种特异性引物，其特征在于，该特异性引物为第一类引物、第二类引物和第三类引物中的任意一种，其中，

所述第一类引物，其正向引物的碱基序列优选为GAGCTGGAACGTATTGGTG，反向引物的碱基序列优选为TTCTGTGGTTCTAAGGCTGT；

所述第二类引物，其正向引物的碱基序列优选为TCTTCAACTTCCTCAATCGC，反向引物的碱基序列优选为ATCTTCTTATATCCGATTCCC；

所述第三类引物，其正向引物的碱基序列优选为ATTCTGGGAAATCAGGTGG，反向引物的碱基序列优选为AGAGGCTAGAAGCTCAATGTA。

按照本发明的另一个方面，提供了上述特异性引物作为柑橘类植物Cit sh1基因相关引物的应用，其中，所述第一类引物用于克隆如权利要求1所述的启动子，所述第二类引物用于柑橘类植物Cit sh1基因的荧光定量PCR，所述第三类引物用于进行PCR扩增得到如权利要求2所述基于柑橘类植物Cit sh 1基因启动子序列差异的分子标记。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，能够取得以下有益效果：

1.本发明通过对柑橘类植物Cit sh1基因的启动子进行克隆，得出共6条柑橘类植物Cit sh1基因的启动子序列(如SEQ ID:1～SEQ ID:6所示)。除了启动子本身的作用外，还可对这些启动子特定位点核酸序列进行重组，使重组后的序列中含有上述启动子或其片段，这样就可以使位于启动子下游的目的基因(即Cit sh1基因)在柑橘类植物的组织中特异性表达，作为如分析、开发、改造柑橘类植物组织特性的研究模型。另外，还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目的片段的重组核酸，通过转基因技术对Cit sh1基因进行敲除，降低柑橘类植物中上火基因的表达。

2.本发明中的分子标记针对柑橘类植物(如橘、柑、柚、橙等)，能快速识别该柑橘类植物是否能诱发人体上火反应。通过获得温州蜜柑果肉“上火”相关蛋白，并根据测序获得的氨基酸序列搜索甜橙数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)，得到诱发人体上火反应蛋白质对应的Cit sh1基因序列。本发明以本地早、国庆1号、红夏橙和高斑柚果实不同组织(果肉、白皮层和黄皮层)为材料，着重对Cit sh1基因表达模式进行了研究。由于基因的表达模式受启动子调控，故本发明同时以上述四个品种叶片为材料，分离克隆Citsh1基因启动子。在基因表达分析和启动子克隆过程中得到相应特异性引物，即第一类引物(其碱基序列包括SEQ ID:8～SEQ ID:9，其中SEQ ID:8对应正向引物，SEQ ID:9对应 反向引物)、第二类引物(其碱基序列包括SEQ ID:10～SEQ ID:11，其中SEQ ID:10对应正向引物，SEQ ID:11对应反向引物)、第三类引物(其碱基序列包括SEQ ID:14～SEQ ID:15，其中SEQ ID:14对应正向引物，SEQ ID:15对应反向引物)和第四类引物(其碱基序列包括SEQID:12～SEQ ID:13，其中SEQ ID:12对应正向引物，SEQ ID:13对应反向引物)；利用上述第三类特异性引物进行PCR扩增最终得到分子标记，该分子标记是针对柑橘类植物Cit sh1基因启动子，即针对上火柑橘品种与不上火柑橘品种Cit sh1启动子序列之间的差异，能够对植物(尤其是柑橘类植物)是否诱发人体上火等炎症进行快速识别。

3.本发明中的分子标记应用在检测和区别柑橘类植物是否引起炎症(即是否诱发人体上火)时，能够快速检测，检测的准确性高。由于不同的柑橘品种其表现的“上火”性状差异较大，对于上火型的柑橘品种，人们的上火反应往往比较普遍，因此检测柑橘类植物是否诱发上火反应的分子标记具有良好的实用价值。本发明中的分子标记是通过特异性引物进行PCR扩增得到的，针对不同的柑橘类植物，本发明共提供了四类特异性引物，能够应用于绝大部分柑橘类植物中的Cit sh1基因及其启动子。

附图说明

图1是荧光定量PCR检测本地早、温州蜜柑(国庆1号)、红夏橙和高斑柚果肉、白皮层和黄皮层Cit sh1基因表达情况；“*”表示与其它样品相比具有显著性差异(P<0.01)；

图2是荧光定量PCR检测温州蜜柑叶片、温州蜜柑果肉、甜橙果肉、柚子果肉中Citsh1基因表达情况；“*”表示与其它样品相比具有显著性差异(P<0.01)；

图3是Cit sh1启动子序列以及小卫星相对位置示意图。A图是重复单元在Citsh1R2型启动子中的相对位置；B图是R1型(同时存在于上火和不上火柑橘品种中)和R2型(仅存在于上火柑橘品种中)启动子间的区别。

图4是本发明中的分子标记在本地早(图中序号为1)、国庆1号(图中序号为2)、红夏橙(图中序号为3)以及高斑柚(图中序号为4)中的应用；

图5是本发明中的分子标记在26个柑橘品种中的应用。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可 以相互组合。

本发明中分子标记的设计遵循以下步骤：

(1)首先，通过分析、筛选、比对等方法获得柑橘类植物中“上火”相关蛋白氨基酸序列(得出的具体氨基酸序列可见SEQ ID:16～SEQ ID:18)，搜索甜橙数据库，得到与这些“上火”相关蛋白氨基酸对应的Cit sh1基因序列(现有数据库尚未对该基因序列的功能进行注释)，该Cit sh1基因序列如SEQ ID:7所示；

(2)对本地早、国庆1号、红夏橙、高斑柚果肉、白皮层和黄皮层Cit sh1基因进行荧光定量PCR，检测该基因在不同柑橘品种和部位的表达情况；

(3)利用同源克隆法克隆本地早、国庆1号、红夏橙以及高斑柚中Cit sh1启动子的核苷酸序列；

(4)对得到的8条启动子序列进行比对分析；

(5)根据启动子序列差异设计分子标记引物。

为了对该基因的“上火”特性进行研究，上述分子标记的设计过程中选取了4个不同的柑橘品种(即，本地早、国庆1号、红夏橙以及高斑柚)，其中本地早和国庆1号传统上被认为容易诱导人体产生“上火”；红夏橙和高斑柚则不易引起“上火”。对上述四个柑橘品种Cit sh1基因的表达情况进行分析，发现其在果肉中的表达量最高，且在国庆1号的表达量高于其它品种，差异显著(区别于背景技术中过敏原的分布)，由于基因的表达模式受启动子调控，故本发明还以本地早、国庆1号、红夏橙以及高斑柚的叶片为材料，分离克隆Citsh1基因启动子。

在具体操作过程中发现，通过基因克隆技术从4个柑橘品种(即本地早、国庆1号、红夏橙以及高斑柚)共分离得到8条Cit sh1基因启动子序列，这8条序列高度杂合。柑橘在杂交的过程中高度杂合，故在克隆启动子序列时，1个柑橘品种可能克隆得到2条启动子序列。比对这8条启动子序列(其中有2组序列重复，因此只有6条启动子序列)，发现存在3种启动子类型。第1种启动子类型(如SEQ ID:6所示序列)仅存在于高斑柚中；第2种启动子类型(如SEQ ID:2～SEQ ID:5所示序列)存在于所有4个柑橘品种中，并且只有为数不多的差异；第3种启动子类型(如SEQ ID:1所示序列)只存在于上火柑橘品种中，有100bp片段插入。

另外，上火相关基因Cit sh1在温州蜜柑果肉中特异性表达，其表达量显著高于果实其它部位以及其它柑橘品种，而第3种类型启动子只存在于上火柑橘品种中(本地早和国庆1号)，故根据该100bp插入片断设计引物，开发分子标记，用于区分上火柑橘品种以及不上火柑橘品种。

下面以具体实施例对本发明进行说明，以下实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rded.)或植物分子生物学－实验手册(Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual,Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg,1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 在不同柑橘品种中对Cit sh1基因的表达情况进行分析

通过分析、筛选、比对等方法获得柑橘类植物中“上火”相关蛋白氨基酸序列(例如，可利用酚提法提取柑橘类植物果汁中的总蛋白，再利用凝胶色谱柱以及高效液相色谱法对蛋白进行精细提取，可将提取到的精细蛋白进一步处理巨噬细胞RAW 264.7细胞系，通过检测其中的环氧合酶-2的转录水平来判断各个精细蛋白是否对应“上火”相关蛋白)；

利用已经公布的甜橙和克里曼丁(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmL)基因组数据库，获取与“上火”相关蛋白氨基酸对应的Cit sh1基因序列信息，根据保守序列设计用于实时定量PCR(Real-time PCR，即荧光定量PCR)分析的引物(见表3，或序列SEQ ID:10～SEQ ID:13)，其中F1和R1是对Cit sh1基因进行相对定量扩增的引物(即第二类引物)，而A-F和A-R是对内参基因actin进行扩增的引物(即第四类引物)。

柑橘果肉、果皮总RNA提取可参照刘庆(Liu Q,Xu J,Liu Y,Zhao X,Deng X,GuoL,Gu J.A novel bud mutation that confers abnormal patterns of lycopeneaccumulation in sweet orange fruit(Citrus sinensis L.Osbeck).J Exp Bot,2007,58(15-16):4161-4171)的方法。

首先进行初提取：⑴.向10mL离心管(DEPC水浸泡后灭菌)中加入5mL Trizol抽提液(见表1)；⑵.液氮研磨好样品后，称取适量(0.5-1g)样品加入抽提液中；⑶.上下剧烈振荡混匀30s，室温静置15min；⑷.加入2-3mL氯仿，剧烈振荡15-30s后，室温静置10min；⑸4℃，11000g离心15min，取上清液至另一10mL离心管中；⑹.重复步骤4和5各一次；⑺.加入等体积冷冻异丙醇，混匀后静置5-10min；⑻.4℃，11000g离心20min，弃上清；⑼.沉淀用预冷的75％乙醇(灭菌DEPC水配制)漂洗，并浸泡30min；(10).10000g离心5min，弃乙醇后，稍风干后进入纯化步骤。

纯化步骤包括：⑴.加入400μL TESAR(见表1)，充分涡旋溶解上述沉淀物，涡旋时间至少3min；⑵.分别加入400μL Bu/CTAB(见表1)和Aq/CTAB(见表1)，涡旋3min；⑶.将混合液转移至1.5mL的离心管中(DEPC水处理后灭菌)；⑷.室温下，15000g离心10-15min；⑸.离心后溶液分成两层，将上层溶液转移至另一个新的1.5mL离心管中；⑹.再加入350μL的0.2MNaCl溶液，充分混匀，4℃，10000g离心8min；⑺.离 心后溶液分为两层，将下层溶液转移至另一新的1.5mL离心管中，加入50μL 3M NaAc和1mL预冷无水乙醇，-80℃冰冻1h；4℃15000g离心30min，弃上清，稍风干；⑻.加30-100μL灭菌DEPC水溶解；⑼.电泳检测(如，120V，15min)总RNA质量，NanoDrop1000测定总RNA浓度；RNA于-80℃保存。

表1 RNA提取试剂

反转录PCR(RT-PCR)步骤：将上述总RNA用DNaseI(Invitrogen,美国)处理30分钟以去除基因组DNA污染。然后将RNA样品按照RevertAidTM First Strand cDNA SynthesisKit试剂盒(Fermentas,Lithuania)的操作方法反转录合成第一链cDNA：取1-1.5μg总RNA作为反转录模板(20μL体系)，反转录完成后加入80μL灭菌双蒸水(ddH₂O)稀释，存于-20℃冰箱备用。

基因的表达：基因的表达分析在ABI7500实时定量PCR仪(Applied Biosystems,CA,USA)上完成。基因扩增体系见表2，扩增的反应程序如下：50℃2min，95℃10min，[95℃15s，60℃1min](其中中括号部分共进行40次循环)。每个样品的cDNA扩增反应进行3次独立重复。基因的表达量采用2^-△△Ct方法计算【6】。之后使用SPSS软件对各表达量进行显著性分析(P<0.01)。

表2 实时荧光定量PCR反应体系

分析结果发现，Cit sh1在温州蜜柑(国庆1号)的果肉中表达量最高，与温州蜜柑白皮层、黄皮层中Cit sh1表达量存在显著性差异(P<0.01),并且与红夏橙、高斑柚汁胞、白皮层以及黄皮层中Cit sh1表达量也存在显著性差异(P<0.01)(如图1所示)；Cit sh1在温州蜜柑的果肉中表达量与其叶片，甜橙(即纽荷尔脐橙)、柚子(即琯溪蜜柚)果肉相比，亦存在显著性差异(P<0.01)(如图2所示)，表明Cit sh1是温州蜜柑果肉特异性表达基因。

实施例2 Cit sh1启动子的克隆

柑橘基因组DNA提取

DNA buffer的配制：先分别配制0.5M EDTA(pH8.0)，1M Tris-HCl(pH8.0)，5MNaCl，再将上述3种试剂与ddH₂O以1:1:3:5的比例混合，灭菌后于室温下保存备用。用时按2％的比例往buffer中加入CTAB，65℃水浴条件下使其充分溶解；在通风橱里加入1％的巯基乙醇(现配现用)。柑橘基因组DNA采用改良CTAB法(可参见程运江，柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发研究，华中农业大学博士学位论文)小量提取：

1)取0.5g叶片，加入适量液氮研碎，转入至预冷的1.5mL离心管中，加入600μL含有CTAB及巯基乙醇的DNA buffer，充分摇匀，于65℃水浴60～90min，中途轻轻摇匀2-3次，避免叶片褐化。

2)加入700μL氯仿:异戊醇(24:1)，上下晃动10min，充分混匀，10000g离心10min。

3)吸取上清液至另一离心管中，依次加入60μL 5M NaCl，1mL预冷无水乙醇，轻轻颠倒混匀，于-20℃冰冻30min沉淀DNA。

4)10000g离心5min，弃上清，加入1mL70％乙醇室温浸泡沉淀2h或过夜。

5)10000g离心5min，弃上清，稍风干，加入50μL 1×TE充分溶解。每管加2μL 5mg/mL RNase，37℃水浴6h或过夜，以去除RNA污染。

6)分光光度计检测DNA浓度，琼脂糖凝胶检测DNA质量。

根据同源克隆法获得Cit sh1基因的启动子。利用已经公布的甜橙基因组数据库，获取Cit sh1基因启动子序列信息，即Cit sh1基因上游2kb区域，据此设计引物，正向引物MF1和反向引物MR1(见表3)，从本地早、国庆1号、红夏橙以及高斑柚叶片中分离Cit sh1基因启动子。启动子利 用快速酶(TransGen，北京全式金生物)进行扩增，扩增体系：10μL 5×NF Buffer，2.5μL 10μM MF1和MR1引物，1μL FastPfu酶，1μL 10mM dNTP,1μL DNA模板(<500ng)，加灭菌去离子水补至50μl。PCR反应程序见表4。表3中的MF1、MR1即对应第一类引物，F1、R1即对应第二类引物，AaF、AaR即对应第三类引物，A-F、A-R即对应第四类引物。

表3 本发明设计的相关引物的核苷酸序列

PCR结束后，利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用 凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，美国)回收特异DNA条带，回收步骤参照使用说明书进行。回收纯化的DNA溶液与pMD18-T载体(购自TaKaRa公司，中国)进行连接反应,按说明书操作,连接反应总体积是10μL：5μL的solutionⅠ，4μL的回收产物，1μL T载体。4℃连接过夜。取10μL连接产物，采用热击法【10】转化大肠杆菌DH5α，大肠杆菌涂布在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养(约14-16h)，挑取转化平板上生长出的单菌落，接种于含50mg/L氨苄霉素的液体LB中，37℃190r/min培养过夜(7-9h)，吸取1μL菌液作为扩增的模板，进行PCR验证。挑选10个阳性克隆测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)。

表4 启动子克隆PCR反应条件

实施例3 分子标记的开发与应用

分别对每个品种的10个阳性克隆序列进行比对，挑选测序正确的序列，柑橘的基因组序列高度杂合，故发现每个品种有2条启动子序列，4个品种共得到8条启动子序列。比对这8条启动子序列发现，本地早中1条序列和国庆1号中的1条序列一模一样，另1条序列和红夏橙中的1条序列一模一样。综合可得，从4个柑橘品种中共克隆得到6条启动子序列。这6条启动子序列共显示了3种不同的启动子类型。第1种启动子类型(如SEQ ID:6所示序列)仅存在于高斑柚中，其在翻译起始位点上游650bp左右有一段45bp片段插入；第2种启动子类型(如SEQ ID:2～SEQ ID:5所示序列)存在于所有4个柑橘品种中，并且只有为数不多的差异。例如，对比国庆1号和本地早该序列，发现国庆1号中存在3个碱基缺失，7个碱基置换；第3种启动子类型(如SEQ ID:1所示序列)只存在于上火柑橘品种中，在翻译起始位点上游1123bp左右有一段100bp片段插入，该100bp片段中有97bp是一段重复序列，在其原始序列下游3bp处(图3A)，根据插入序列片段大小，我们将这段重复序列称之为小卫星，存在于所有4个柑橘品种中的启动子序列只含有一个重复单元，我们称之为R1启动子(如SEQ ID:2～SEQ ID:6所示序列)，而仅存在于上火品种中的启动子序列含有2个重复单元，我们称之为R2启动子(如SEQ ID:1所示序列)(图3B)；故我们根据该小卫星序列，设计了引物AaF和AaR,序列如表3所示，对4个柑橘品种启动子区域进行PCR扩增，以检验AaF,AaR在区分柑橘上火品种与不上火品种中的有效性，PCR扩增体系：2μL 10×NH₄(SO₄)₂Buffer，1.2μL 25mMMgCl₂，0.5μL 10μM AaF和AaR引物，0.2μL Taq酶，0.4μL 10mM dNTP,1μL DNA模板，加灭菌去离子水补至20μl。PCR扩增程序如表5。结果如图4所示，550bp片段代表R2启动子，仅存在于上火柑橘品种(本地早、国庆1号)中，而450bp片段代表R1启动子，存在于所有4个柑橘品种中，说明R2启动子与柑橘上火相关，该分子标记可以很好地区分上火柑橘品种和不上火柑橘品种。

表5 分子标记PCR扩增条件

将上述开发的分子标记应用于更多的柑橘品种，用以对柑橘上火性状进行评价，同时对该分子标记在评价柑橘上火方面的适用性作最后验证。 以26个柑橘品种DNA为模板，对它们的启动子区域进行分子标记PCR扩增，品种名为：1.鄂柑1号；2.黔阳无核；3.本地早；4.南丰蜜橘；5.红橘；6.皇陵庙橘；7.道县野橘；8.克里曼丁；9.国庆1号；10.国庆2号；11.国庆3号；12.国庆4号；13.锦橙；14.暗柳橙；15.雪柑；16.桃叶橙；17.奥林达夏橙；18.红夏橙；19.纽荷尔脐橙；20.红肉脐橙；21.塔罗科血橙；22.沙田柚；23.琯溪蜜柚；24.高斑柚；25.无酸柚；26.马叙葡萄柚。结果如图5所示。R2启动子存在于所有上火柑橘品种中(仅有R2型启动子，或同时包含R1和R2型启动子)，而不上火柑橘品种只包含R1型启动子。说明该分子标记可以有效地用于对柑橘的上火性状进行评价，可为育种过程中选育不上火柑橘品种提供技术支撑。

综上，本发明利用设计的引物对上述4个柑橘品种进行检验，发现该分子标记能够很好的将上火品种与不上火品种区分开来。将该分子标记应用于26个柑橘品种中，发现该分子标记能很好的应用于柑橘中，可有效地区分上火品种与不上火品种。

本发明中的柑橘类植物，主要包括柑橘属植物(如橘、柑、柚、橙等)，例如本发明实施例3所例举的26个柑橘品种。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种柑橘类植物Cit sh1基因的启动子，其特征在于，该启动子由SEQ ID:1～SEQID:6中任意一条的核苷酸序列组成。

2.一种基于柑橘类植物Cit sh1基因启动子序列差异的分子标记，其特征在于，该分子标记是通过特异性引物进行PCR扩增得到的，所述特异性引物的正向引物的碱基序列为ATTCTGGGAAATCAGGTGG，反向引物的碱基序列为AGAGGCTAGAAGCTCAATGTA。

3.一种根据权利要求2所述的分子标记在检测和区分柑橘类植物属于上火柑橘类植物还是属于不上火柑橘类植物中的应用。

4.一种特异性引物，其特征在于，该特异性引物为第一类引物和第三类引物中的任意一种，其中，

所述第一类引物，其正向引物的碱基序列为GAGCTGGAACGTATTGGTG，反向引物的碱基序列为TTCTGTGGTTCTAAGGCTGT；

所述第三类引物，其正向引物的碱基序列为ATTCTGGGAAATCAGGTGG，反向引物的碱基序列为AGAGGCTAGAAGCTCAATGTA。

5.一种特异性引物作为柑橘类植物Cit sh1基因相关引物的应用，其特征在于，该特异性引物为第一类引物、第二类引物和第三类引物中的任意一种，其中，

所述第一类引物，其正向引物的碱基序列为GAGCTGGAACGTATTGGTG，反向引物的碱基序列为TTCTGTGGTTCTAAGGCTGT；

所述第二类引物，其正向引物的碱基序列为TCTTCAACTTCCTCAATCGC，反向引物的碱基序列为ATCTTCTTATATCCGATTCCC；

所述第三类引物，其正向引物的碱基序列为ATTCTGGGAAATCAGGTGG，反向引物的碱基序列为AGAGGCTAGAAGCTCAATGTA；

所述应用具体包括，所述第一类引物用于克隆如权利要求1所述的启动子，所述第二类引物用于柑橘类植物Cit sh1基因的荧光定量PCR，所述第三类引物用于进行PCR扩增得到如权利要求2所述基于柑橘类植物Cit sh1基因启动子序列差异的分子标记。