CN106701731B - Sba-15固定化血管紧张素转化酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种SBA‑15固定化血管紧张素转化酶的制备方法，利用螯合锌离子的介孔分子筛SBA‑15为载体，以血管紧张素转化酶为固定对象，通过吸附与键和作用，得到SBA‑15固定化血管紧张素转化酶。上述方法得到的产品中，ACE在螯合锌离子的介孔分子筛SBA‑15的孔道内部及分子筛外表面同时实现固定化。本发明制备Zn‑SBA‑15固定化ACE采用的固定化过程简单，且产品稳定性好，本发明制备的Zn‑SBA‑15固定化ACE较游离酶具有更好的温度和pH稳定性。

Description

SBA-15固定化血管紧张素转化酶的制备方法
技术领域
本发明涉及固定化酶制备技术领域，特别涉及一种应用螯合Zn2+的介孔分子筛SBA-15固定化血管紧张素转化酶的制备方法。
背景技术
高血压会改变和损坏大脑、心脏、血管、肾脏以及眼底的结构和功能，引起这些器官的并发疾病从而导致功能的衰竭。高血压导致的以下几种并发症：冠心病、脑血管病、高血压心脑疾病、慢性肾功能衰竭和动脉粥样硬化等。目前的降血压药物主要有利尿药、β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂。
血管紧张素转换酶(ACE)是一种存在于肺、肾、脑、眼球、小肠、胎盘等不同组织的多功能二肽羧基肽酶。在人体中，血压的调节主要是受到肾素－血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)和激肽释放酶－激肽系统(Kallikrein-Kinin System，KKS)的控制，当其失衡时将会引起人体血压的异常，而ACE又是这两个系统的关键酶。
目前，治疗高血压的药物多是人工合成的ACE抑制剂，但是由于其具有明显的副作用，因此开发无副作用的天然的健康的ACE抑制肽成为时下研究的热点。近年来ACE的分离纯化主要采用的方法有硫酸铵分级沉淀对酶进行初提，然后采用亲和层析法进一步纯化ACE，也有通过盐析、凝胶层析、超滤以及离子交换层析的方法分离纯化ACE。传统的固定血管紧张素转化酶的载体有琼脂糖、壳聚糖、二氧化硅、甲壳糖等，其固定后的血管紧张素转化酶的活性偏低，且固定化效率低，稳定性不是很好，同时成本也较高。
自1992年首次合成有序介孔氧化硅MCM-41以来，介孔分子筛以其在大分子物质分离方面的功用，受到了广泛应用，此后又陆续研究出SBA系列、MSU系列、CMK系列等等。介孔分子筛是具有广范应用前景的一类新材料，可作为吸附剂、催化剂等的良好载体，而固定化酶生物领域起着重要作用。所以采用新的优良载体固定化血管紧张素转化酶，提高酶活、稳定性是有意义和迫切需要的。
发明内容
本发明的目的在于应用载体SBA-15作为固定化血管紧张素转化酶(ACE)的载体制备固定化ACE，提高ACE的负载量，增强其活性和稳定性。
为达到上述目的，本发明提供了一种SBA-15固定化血管紧张素转化酶的制备方法，利用螯合锌离子的介孔分子筛SBA-15为载体，以血管紧张素转化酶为固定对象，通过吸附与键和作用，得到SBA-15固定化血管紧张素转化酶。
按质量体积比为1:50(g/mL)将聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物溶于浓度为1.4～1.6mol/L的盐酸溶液中，30～35℃水浴搅拌3～5h；然后逐滴加入正硅酸乙酯至与聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物的体积质量比为4～6:1(ml/g)的体积时终止，40～50℃水浴持续搅拌18～24h；随后将反应物转移至反应釜中，100～120℃静置条件下反应20～26h；收集固体产物，水洗抽滤干净后，70～90℃烘干10～14h，550℃焙烧6～10h，得到介孔分子筛SBA-15。
上述方法得到的产品中，ACE在螯合锌离子的介孔分子筛SBA-15的孔道内部及分子筛外表面同时实现固定化。
上述SBA-15固定化血管紧张素转化酶的制备方法，具体步骤为：
S1、取孔径为6～7nm的介孔分子筛SBA-15通过直接或间接吸附螯合的方式制得螯合Zn2+的介孔分子筛SBA-15；
所述直接螯合的具体操作为：
将介孔分子筛SBA-15与浓度为0.05～0.06mol/L的ZnSO4水溶液按质量体积比1:10～20(g/mL)的比例混合，30～40℃水浴震荡45～65min，获得直接螯合Zn2+的SBA-15载体；
所述间接螯合的具体操作为：
将介孔分子筛SBA-15加入到无水乙醇中，向所述无水乙醇中加入3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)，20～30℃水浴震荡10～20h，反应结束后抽滤，收集固体物质，洗净；
上述介孔分子筛SBA-15与无水乙醇、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的质量体积比为1:350～400:20～30(g/mL/mL)；
将所得固体物质与浓度为0.6～0.8mol/L的亚氨基二乙酸溶液按质量体积比1:10～20(g/mL)的比例混合，30～40℃水浴震荡反应60～90min，反应结束后抽滤，再次收集固体物质；
将再次收集的固体物质与浓度为0.05～0.06mol/L的ZnSO4溶液按质量体积比1:10～20(g/mL)的比例混合，30～40℃水浴震荡60～90min，获得间接螯合Zn2+的SBA-15载体。
上述螯合Zn2+的螯合过程根据是否以连接-COOH为前提将Zn2+连接到SBA-15的形式，分为直接螯合和间接螯合。直接螯合主要是通过吸附原理，间接的螯合是将锌和连上去的羧基螯合，而间接螯合方式在提供吸附作用的同时提供键合作用将Zn2+螯合到载体上。两种方法获得的螯合Zn2+的SBA-15载体上的Zn2+的接合状态及数量略有差别。间接螯合Zn2+制备的载体的Zn2+的量及稳定性更高，具有更好的固定ACE的效果。
本发明方法优选间接螯合的方法制备式制得螯合Zn2+的介孔分子筛SBA-15。
S2、固定血管紧张素转化酶：将步骤S1制得的螯合Zn2+的介孔分子筛SBA-15与血管紧张素转化酶溶液按质量体积比1:5～20(g/mL)的比例混合，45℃～50℃，在水浴锅中水浴震荡30～40min，至反应液中的蛋白含量不变，反应结束；抽滤、清洗、除去未吸附结合的血管紧张素转化酶，得到SBA-15固定化血管紧张素转化酶；
本发明通过用BBS缓冲液大量反复冲洗，除去未吸附结合的血管紧张素转化酶；以洗脱液中的酶活为零，证明已将ACE洗净。
所述血管紧张素转化酶溶液以pH为7.8～9.3的硼酸盐缓冲溶液配置，浓度为10～50mg/mL，酶活为0.1～0.2U/mL。
优选方式下，步骤S1所述介孔分子筛SBA-15的制备方法为：
按质量体积比为1:50(g/mL)将聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)溶于浓度为1.4～1.6mol/L的盐酸溶液中，30～35℃水浴搅拌3～5h；然后逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)至与聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物的体积质量比为4～6:1(mL/g)的体积时终止，40～50℃水浴持续搅拌18～24h；随后将反应物转移至反应釜中，100～120℃静置条件下反应20～26h；收集固体产物，水洗抽滤干净后，70～90℃烘干10～14h，550℃焙烧6～10h，得到介孔分子筛SBA-15。
优选方式下，步骤S2所述血管紧张素转化酶溶液采用粗提猪肺血管紧张素转化酶配置。
采用上述方案后，本发明与已有技术相比具有以下优点：
1、本发明首次制备出了SBA-15固定化ACE，本发明采用介孔分子筛SBA-15的孔径在6～7nm，其孔径与ACE的分子量150kDa相匹配，应用此特点本发明就以SBA-15作为固定化ACE的载体。
2、本发明采用介孔分子筛SBA-15具有高比表面积，酶负载量高；且SBA-15分子筛的孔道具有可控制性，可增强酶的稳定性和活性；SBA-15分子筛孔道高度有序且表面性质均一，酶的固定化过程可预测。
3、血管紧张素转化酶为Zn2+依赖型二肽羧肽酶，本发明制得的螯合Zn2+的介孔分子筛SBA-15利用对金属离子和金属氧化物磷酸基团的特殊亲和力选择性捕获磷酸化的蛋白质和肽，对血管紧张素转化酶具有特异性亲和吸附的作用，提高了与ACE的结合率，使更多的ACE分子吸附键和到载体上，进而达到提高酶活及吸附率的效果。
4、本发明制备Zn-SBA-15固定化ACE采用的固定化过程简单，且产品稳定性好，本发明制备的Zn-SBA-15固定化ACE较游离酶具有更好的温度和pH稳定性。
具体实施方式
实施例1
1)一种介孔分子筛SBA-15载体的制备，具体制备方法过程如下：
介孔分子筛SBA-15载体的制备：取1g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)溶解于50mL 1.6mol/L盐酸溶液中30℃水浴搅拌3h，然后逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)5mL，并在40℃水浴持续搅拌20h；随后将反应物转移至反应釜中，放入烘箱110℃静置条件下反应24h；最后收集固体产物，水洗抽滤干净后放入烘箱80℃放置12h，取出后放入马弗炉550℃烧8h，得介孔分子筛SBA-15；然后取0.5g SBA-15并以质量体积为SBA-15:ZnSO4(0.05mol/L的ZnSO4溶液)＝1:10(g/mL)加入到ZnSO4溶液，35℃恒温水浴震荡锅震荡反应50min；50min后取出用大量的水通过抽滤的方式将微球表面的Zn2+洗净。
2)血管紧张素转化酶分别在上步制备SBA-15和Zn-SBA-15载体上的固定化
分别称取1)步制备的SBA-15和Zn-SBA-15载体0.5g加入10ml的血管紧张素转化酶(酶活为0.17U/mL，用pH8.3的0.1mol/L硼酸盐缓冲溶液配置而成)，50℃，恒温水浴锅中水浴震荡30min。反应结束后抽滤洗净未吸附结合的酶，从而获得固定化血管紧张素转化酶。
固定化ACE活力测定方法与游离ACE测定方法相似，采用高效液相色谱法测定，即测定反应混合液中生成的马尿酸的含量。根据马尿酸的生成速率计算酶活力。
称取0.0500g固定化ACE，加入160μL BBS，在37℃恒温水浴中保温10min，加入50μL5mmol/L HHL(溶于pH为8.3的0.1M BBS缓冲溶液中)，37℃反应15min，最后加入150μL1mol/L的HCl终止反应，测定马尿酸含量，计算得Zn-SBA-15固定化ACE的酶活为0.2372U/g，SBA-15固定化ACE的酶活为0.1736U/g。说明在前述制备的过程的相同条件下螯合Zn2+的SBA-15固定ACE的酶活与直接应用SBA-15固定化ACE相比有更高的酶活。
1个酶活力单位(U)定义为：本实验条件下，每分钟催化生成1μmol马尿酸所需的酶量。固定化ACE活力单位指1g固定化ACE每分钟催化底物生成1μmol马尿酸为1个活力单位，以U/g表示。
游离ACE及本实施例制得的SBA-15固定化ACE的热稳定性测试：
取7mg左右的游离酶(酶活为0.007U)和20mg左右的固定化酶(酶活为0.00605U)，两者酶活相近，分别置于pH 8.3缓冲液中(0.1ml/L BBS，含0.3mol/L NaCl)，分别在37℃、60℃放置1h，然后测其活性，以未进行处理的ACE活力最高值为100％，计算其活力。
固定化酶在60℃(pH＝8.3)下放置1h后酶活保留45％而游离酶仅保留35％。在37℃条件放置1h后固定化酶的酶比活95％比游离酶的比活85％高出10％。
实施例2
1)介孔分子筛SBA-15载体的制备：取1g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)溶解于50mL 1.6mol/L盐酸溶液中30℃水浴搅拌3小时，然后逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)5mL，并在40℃水浴持续搅拌20h；随后将反应物转移至反应釜中，放入烘箱110℃静置条件下反应24h；最后收集固体产物，水洗抽滤干净后放入烘箱80℃放置12h，取出后放入马弗炉550℃烧8h，得介孔分子筛SBA-15；0.5g SBA-15加入200ml无水乙醇再加入12mL 3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，30℃水浴震荡15h，反应结束后抽滤，洗净后连接IDA，按1:10(g/mL)的比例加入0.7mol/L IDA溶液(IDA溶液用1.5mol/L碳酸钠溶液配制)，35℃水浴震荡反应60min，反应结束抽滤后，以质量体积比为1：10(g/ml)加入0.05mol/L的ZnSO4溶液，30℃水浴震荡75min。从而获得相应的载体Zn-SBA-15。
2)血管紧张素转化酶在上步制备Zn2+-SBA-15载体上的固定化
称取1)步制备的Zn-SBA-15载体0.5g加入10ml的血管紧张素转化酶(酶活为0.17U/mL，用pH 8.3的0.1mol/L硼酸盐缓冲溶液配置而成)，50℃，恒温水浴锅中水浴震荡30min。反应结束后抽滤洗净未吸附结合的酶，从而获得固定化血管紧张素转化酶。
3)称取0.0500g固定化ACE，加入160μL BBS，在37℃恒温水浴中保温10min，加入50μL 5mmol/L HHL(溶于pH为8.3的0.1M BBS缓冲溶液中)，37℃反应15min，最后加入150μL1mol/L的HCl终止反应，测定马尿酸含量，计算得酶活为0.3074U/g。
游离ACE及本实施例制得的SBA-15固定化ACE的pH稳定性测试：
取7mg左右的游离酶(0.007U)和20mg左右的固定化酶(0.00605U)，两者酶活相近，置于pH分别为5、8.3的缓冲液中(0.1mol/LBBS，含0.3mol/L NaCl)，37℃放置1h，然后测其活性，以未进行处理的ACE活力最高值为100％，计算其相对活力。
固定化酶在pH 5放置1h后固定化酶活保留45％，而游离酶仅保留22％；在pH 8.3的缓冲溶液中放置1h后，固定化酶的酶比活为92％，比游离酶83％的比活高出9％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种SBA-15固定化血管紧张素转化酶的制备方法，其特征在于，利用螯合锌离子的介孔分子筛SBA-15为载体，以血管紧张素转化酶为固定对象，通过吸附与键和作用，得到SBA-15固定化血管紧张素转化酶；
具体步骤为：
S1、取孔径为6～7nm的介孔分子筛SBA-15通过直接或间接吸附螯合的方式制得螯合Zn2 +的介孔分子筛SBA-15；
所述直接螯合的具体操作为：
将介孔分子筛SBA-15与浓度为0.05～0.06mol/L的ZnSO4水溶液按质量体积比1:10～20(g/mL)的比例混合，30～40℃水浴震荡45～65min，获得直接螯合Zn2+的SBA-15载体；
所述间接螯合的具体操作为：
将介孔分子筛SBA-15加入到无水乙醇中，向所述无水乙醇中加入3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，20～30℃水浴震荡10～20h，反应结束后抽滤，收集固体物质，洗净；
所述介孔分子筛SBA-15与无水乙醇、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的质量体积比为1:350～400:20～30(g/mL/mL)；
将所得固体物质与浓度为0.6～0.8mol/L的亚氨基二乙酸溶液按质量体积比1:10～20(g/mL)的比例混合，30～40℃水浴震荡反应60～90min，反应结束后抽滤，再次收集固体物质；
将再次收集的固体物质与浓度为0.05～0.06mol/L的ZnSO4溶液按质量体积比1:10～20(g/mL)的比例混合，30～40℃水浴震荡60～90min，获得间接螯合Zn2+的SBA-15载体；
S2、固定血管紧张素转化酶：将步骤S1制得的螯合Zn2+的介孔分子筛SBA-15与血管紧张素转化酶溶液按质量体积比1:5～20(g/mL)的比例混合，45℃～50℃，在水浴锅中水浴震荡30～40min，至反应液中的蛋白含量不变，反应结束；抽滤、清洗、除去未吸附结合的血管紧张素转化酶，得到SBA-15固定化血管紧张素转化酶；
所述血管紧张素转化酶溶液以pH为7.8～9.3的硼酸盐缓冲溶液配置，浓度为10～50mg/mL，酶活为0.1～0.2U/mL。
2.根据权利要求1所述SBA-15固定化血管紧张素转化酶的制备方法，其特征在于，步骤S1采用间接螯合的方法制备螯合Zn2+的介孔分子筛SBA-15。
3.根据权利要求1所述SBA-15固定化血管紧张素转化酶的制备方法，其特征在于，步骤S1所述介孔分子筛SBA-15的制备方法为：
按质量体积比为1:50(g/mL)将聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物溶于浓度为1.4～1.6mol/L的盐酸溶液中，30～35℃水浴搅拌3～5h；然后逐滴加入正硅酸乙酯至与聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物的体积质量比为4～6:1(mL/g)的体积时终止，40～50℃水浴持续搅拌18～24h；随后将反应物转移至反应釜中，100～120℃静置条件下反应20～26h；收集固体产物，水洗抽滤干净后，70～90℃烘干10～14h，550℃焙烧6～10h，得到介孔分子筛SBA-15。
4.根据权利要求1所述SBA-15固定化血管紧张素转化酶的制备方法，其特征在于，步骤S2所述血管紧张素转化酶溶液采用粗提猪肺血管紧张素转化酶配置。
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