CN106701667A - 一种软骨细胞的分离培养方法 - Google Patents

一种软骨细胞的分离培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106701667A
CN106701667A CN201710161478.6A CN201710161478A CN106701667A CN 106701667 A CN106701667 A CN 106701667A CN 201710161478 A CN201710161478 A CN 201710161478A CN 106701667 A CN106701667 A CN 106701667A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cartilage
culture method
collagenase
digestion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710161478.6A
Other languages
English (en)
Inventor
陈海佳
葛啸虎
王飞
王一飞
赵萌萌
王小燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd filed Critical Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority to CN201710161478.6A priority Critical patent/CN106701667A/zh
Publication of CN106701667A publication Critical patent/CN106701667A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种软骨细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括：将软骨组织处理成组织块，加入胰蛋白酶进行消化，然后加入II型胶原酶进行消化；II型胶原酶的质量百分比浓度为0.05％～0.1％，II型胶原酶的消化时间为16～20h。本发明通过实验研究得知，采用适宜的II型胶原酶的浓度和消化时间用于软骨组织的消化，可有效维持软骨细胞的活力，使得分离得到的软骨细胞在后期的增殖培养时能够在较短时间内获得足够数量的软骨细胞，大大提高了细胞培养的效率。

Description

一种软骨细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种软骨细胞的分离培养方法。
背景技术
关节软骨是一种由软骨细胞、软骨基质和II型胶原组成的透明软骨，关节的创伤和炎症均可引起关节软骨的损伤。关节软骨的损伤会导致患者的关节反复疼痛和活动受限，严重影响了他们的日常生活。由于关节软骨再生能力有限，一旦损伤，难以自行修复，关节软骨的损伤修复一直是骨科研究的重要课题之一。
软骨组织工程技术是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并且以较高浓度将其种植于具有良好的生物相容性和降解性的支架材料上构建组织工程软骨，然后植入到组织缺损部位，完成组织的修复和重建。软骨组织工程的最终目的就是得到高质量的修复组织和长期有效的功能，为病人最终解决痛苦。从这种意义上看，组织工程方法是目前治疗关节软骨损伤最有希望的方法，是目前软骨损伤修复研究的主要方面。近年来，研究者致力于应用组织工程学治疗修复关节软骨损伤的研究，但其前提条件是获取足够数量的软骨细胞，即关节软骨细胞的体外分离、体外培养及扩增问题。
目前，软骨细胞体外分离的方法主要有组织块机械分离法、酶一步消化分离法和酶两步消化分离法。这些方法由于操作的细节不同，最终获得的软骨细胞在数量与质量上出现了明显的差异。组织块机械分离法虽然操作方法简单，但是细胞分离周期长，只适合于细胞需求量少的研究。胶原酶消化法相对于组织块机械分离法来说，细胞获得周期较短，但是，由于不同研究者使用的酶种类、浓度和消化时间不同，可能会出现消化不足或者酶毒性损伤，从而导致细胞的数量和质量差异。因此，需要提供一种细胞得率高的软骨细胞体外分离方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种软骨细胞的分离培养方法。该分离培养方法软骨细胞得率高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种软骨细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
将软骨组织处理成组织块，加入胰蛋白酶进行消化，然后加入II型胶原酶进行消化；II型胶原酶的质量百分比浓度为0.05％～0.1％，II型胶原酶的消化时间为16～20h。
本发明通过实验研究出一种比较好的软骨细胞原代分离方法，该方法细胞获得周期短、数量较多，获得细胞的活率也较高。
作为优选，II型胶原酶的质量百分比浓度为0.05％。
作为优选，II型胶原酶的消化时间为18h。
在本发明提供的实施例中，胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.25％。
作为优选，胰蛋白酶的消化时间为20～30min。
优选地，胰蛋白酶的消化时间为30min。
作为优选，组织块为小于1mm3的组织块。
在本发明中，II型胶原酶进行消化后还包括细胞培养的步骤。
在本发明提供的实施例中，细胞培养的培养基为含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培养基。
作为优选，细胞培养的细胞密度为(1～10)×104个/mL。
在本发明提供的实施例中，细胞培养的细胞密度为2×104个/mL。
在本发明提供的实施例中，加入胰蛋白酶进行消化与加入II型胶原酶进行消化之间还包括清洗的步骤。
在本发明提供的实施例中，清洗采用PBS清洗，清洗的次数为3次。
本发明提供了一种软骨细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括：将软骨组织处理成组织块，加入胰蛋白酶进行消化，然后加入II型胶原酶进行消化；II型胶原酶的质量百分比浓度为0.05％～0.1％，II型胶原酶的消化时间为16～20h。本发明具有的技术效果为：
本发明通过实验研究得知，采用适宜的II型胶原酶的浓度和消化时间用于软骨组织的消化，可有效维持软骨细胞的活力，使得分离得到的软骨细胞在后期的增殖培养时能够在较短时间内获得足够数量的软骨细胞，大大提高了细胞培养的效率。
具体实施方式
本发明公开了一种软骨细胞的分离培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的软骨细胞的分离培养方法中所用生物材料或试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：软骨细胞的分离
取4周龄的新西兰兔，耳静脉注射法处死后，无菌条件下分离后肢关节软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜后，放入盛有PBS的玻璃培养皿中。将分离得到的软骨组织切成小于1mm的小块。
在软骨组织中加入0.25％的胰蛋白酶消化20min；PBS清洗3次后，终浓度为0.05％的II型胶原酶酶消化18h，每3h收集细胞一次。
将收集的细胞计数后接种于25cm2细胞培养瓶中，每瓶加入1×105个软骨细胞，5mL含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培养基中。
实施例2：软骨细胞的分离
取4周龄的新西兰兔，耳静脉注射法处死后，无菌条件下分离后肢关节软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜后，放入盛有PBS的玻璃培养皿中。将分离得到的软骨组织切成小于1mm的小块。
在软骨组织中加入0.25％的胰蛋白酶消化30min；PBS清洗3次后，终浓度为0.05％的II型胶原酶酶消化18h，每3h收集细胞一次。
将收集的细胞计数后接种于25cm2细胞培养瓶中，每瓶加入1×105个软骨细胞，5mL含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培养基中。
实施例3：软骨细胞的分离
取4周龄的新西兰兔，耳静脉注射法处死后，无菌条件下分离后肢关节软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜后，放入盛有PBS的玻璃培养皿中。将分离得到的软骨组织切成小于1mm的小块。
在软骨组织中加入0.25％的胰蛋白酶消化20min；PBS清洗3次后，终浓度为0.1％的II型胶原酶酶消化18h，每3h收集细胞一次。
将收集的细胞计数后接种于25cm2细胞培养瓶中，每瓶加入1×105个软骨细胞，5mL含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培养基中。
对比例1：软骨细胞的分离
取4周龄的新西兰兔，耳静脉注射法处死后，无菌条件下分离后肢关节软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜后，放入盛有PBS的玻璃培养皿中。将分离得到的软骨组织切成小于1mm的小块。
在软骨组织中加入0.25％的胰蛋白酶消化20min；PBS清洗3次后，终浓度为0.2％的II型胶原酶酶消化18h，每3h收集细胞一次。
将收集的细胞计数后接种于25cm2细胞培养瓶中，每瓶加入1×105个软骨细胞，5mL含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培养基中。
试验例1：细胞获得率
实施例1-3和对比例1的细胞经5d的培养，统计细胞获得率。试验结果如表1所示：
表1 细胞获得率
由表1的试验结果可知，实施例1-3的细胞获得率显著高于对比例1的细胞获得率，结果表明，延长胰酶消化的时间或降低II型胶原酶的终浓度均可有效保持软骨细胞的活力，从而保证了在后期增殖培养时能够在较短时间内获得足够数量的软骨细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种软骨细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将软骨组织处理成组织块，加入胰蛋白酶进行消化，然后加入II型胶原酶进行消化；所述II型胶原酶的质量百分比浓度为0.05％～0.1％，所述II型胶原酶的消化时间为16～20h。
2.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述II型胶原酶的质量百分比浓度为0.05％。
3.根据权利要求1或2所述的分离培养方法，其特征在于，所述II型胶原酶的消化时间为18h。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.25％。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的消化时间为20～30min。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述组织块为小于1mm3的组织块。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述II型胶原酶进行消化后还包括细胞培养的步骤。
8.根据权利要求7所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养的培养基为含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培养基。
9.根据权利要求7或8所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养的细胞密度为(1～10)×104个/mL。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述加入胰蛋白酶进行消化与所述加入II型胶原酶进行消化之间还包括清洗的步骤。
CN201710161478.6A 2017-03-17 2017-03-17 一种软骨细胞的分离培养方法 Pending CN106701667A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710161478.6A CN106701667A (zh) 2017-03-17 2017-03-17 一种软骨细胞的分离培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710161478.6A CN106701667A (zh) 2017-03-17 2017-03-17 一种软骨细胞的分离培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106701667A true CN106701667A (zh) 2017-05-24

Family

ID=58886807

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710161478.6A Pending CN106701667A (zh) 2017-03-17 2017-03-17 一种软骨细胞的分离培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106701667A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111019888A (zh) * 2020-01-10 2020-04-17 中怡(深圳)医疗科技集团有限公司 一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
常青: "软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养构建组织工程软骨的最佳比例", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111019888A (zh) * 2020-01-10 2020-04-17 中怡(深圳)医疗科技集团有限公司 一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Passaretti et al. Cultured chondrocytes produce injectable tissue-engineered cartilage in hydrogel polymer
CN102188748B (zh) 一种新型软骨细胞外基质膜及其制备方法
Schuman et al. Chondrocyte behaviour within different types of collagen gel in vitro
US7771717B2 (en) Enhanced submucosal tissue graft constructs
CN105963785B (zh) 一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法
JPS59192364A (ja) 軟骨および骨の修復方法
EP2138196A1 (en) Methods to maintain, improve and restore the cartilage phenotype of chondrocytes
CN101757691A (zh) 一种组织工程角膜的制备方法
CN108342356A (zh) 一种软骨移植物及其构建方法
Gigante et al. Engineered articular cartilage: influence of the scaffold on cell phenotype and proliferation
CN106635971A (zh) 一种自体软骨细胞的原代分离方法
AU766719B2 (en) Enhanced submucosal tissue graft constructs
JP3680067B2 (ja) 移植用軟骨細胞の製法
JP2002525043A5 (zh)
RU2016137290A (ru) Fgf-18 в процедурах пересадки трансплантата и тканевой инженерии
Liu et al. The application and progress of stem cells in auricular cartilage regeneration: a systematic review
CN106701667A (zh) 一种软骨细胞的分离培养方法
JPWO2006011296A1 (ja) 軟骨細胞の三次元培養方法
CN107320778A (zh) 一种软骨脱细胞基质的制备方法
CN111712270B (zh) 弹性蛋白的减少实现软骨植入物的再细胞化
JP2006314759A (ja) 移植用軟骨組成物
CN101134118A (zh) 一种带内支撑的组织工程化软骨的制备方法
CN104120105A (zh) 一种用于培养老龄人群软骨细胞的无血清培养基
RU2731314C1 (ru) Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей
JP2001293081A (ja) 軟骨移植用材料及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170524