CN101134118A - 一种带内支撑的组织工程化软骨的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学组织工程技术领域，是临床上用作永久性假体的一种带有内支撑的组织工程化软骨的制备方法。本发明以不可降解、具有高稳定性的医用多孔高密度聚乙烯MEDPOR为材料制成预定形状和大小的内支撑支架，再用生物相容性好可被机体降解吸收的聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)无纺网包裹内支撑支架形成MEDPOR－PGA复合支架，然后将制备的自体骨髓基质干细胞悬液均匀滴于复合支架表面的PGA无纺网内，用含TGF－β₁、IGF－I、胰岛素的DMEM软骨向诱导液培养，经一定时间体外培养后植于皮下4－6周，即可构建出本发明组织工程化软骨。本发明用自体骨髓基质干细胞作为种子细胞制作带内支撑的组织工程化软骨假体，由于骨髓基质干细胞来源广，取材方便，体外培养增殖能力强，培养简单，因此可以制作出临床上所需的永久性植入体。

Description

一种带内支撑的组织工程化软骨的制备方法

技术领域

本发明涉及医学组织工程技术领域，是用骨髓基质干细胞构建常用形态、带有内支撑的组织工程化软骨的制备方法。

背景技术

在整形外科及其它畸形创伤修复领域，人体各部位形态的再塑造往往需要行内支撑体的植入以达到塑形矫畸的目的，尤其对颅面、耳廓、鼻背、阴茎、睾丸、等的畸形或缺损(失)修复尤为重要。传统的临床植入体主要包括：自体组织、异体组织、人工合成植入体，但这些修复方法均存在着诸多不足。自体组织的获得条件限制颇多，需行数次或数个部位的手术，往往会增加病患痛苦，供区继发畸形，移植后存在吸收变形；异体组织的组织排异反应及带入疾患的危险给患者造成了心理阴影；而人工合成植入体存在着异物排斥反应、材料老化崩解断裂、感染外露，松动移位等现象。20世纪80年代美国Vacanti提出组织工程的概念，这一概念的提出为这些畸形缺损的修复提供了崭新的思路——应用组织工程技术构建特定形态的软骨作为临床内支撑植入体。

应用软骨细胞构建组织工程化软骨的研究取得了飞速的发展。90年代初，Vacanti(Vacanti CA，Langer R，Schloo B，Vacanti JP.Synthetic polymersseeded with chondrocytes provides a template for new cartilageformation[J].Plast Reconstr Surg 1991；88：753-759.)将牛肩关节软骨细胞分离后，接种在聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)上，经过裸鼠皮下环境培养后，形成了具有组织学结构良好的透明软骨组织，证实了应用组织工程学技术再生软骨是完全可行的。为了构建能够满足整形外科临床应用要求的特殊形状软骨，曹谊林(Cao Y，Vacanti JP，Paige KT，et al.Transplantation ofchondrocytes utilizing a polymer-cellconstruct to producetissue-engineered cartilage in the shape of a human ear[J].Plast ReconstrSurg 1997；100：297-302.)将PGA材料预塑形为人耳廓形状，接种软骨细胞体外培养后植入裸鼠体内，最终在体内构建出了三维立体的人耳廓形态软骨，标志着应用组织工程技术可以形成具有特定外形和复杂结构的软骨组织，展示了组织工程广阔的应用前景。

但上述传统方法构建的组织工程化软骨的厚度一般为1～5mm，厚度增加便很可能出现“空心”现象，软骨出现塌陷，不能维持良好的形态及强度，因而难以用于临床。这种“空心”现象的主要原因在于：(1)外层细胞养分充足，代谢旺盛，基质分泌迅速，形成类似包囊样结构，阻碍营养物质运输，影响内部细胞代谢，使其活力下降甚至死亡；(2)内部的支架材料降解产物因不能及时渗透至外部而不断蓄积，致使局部PH值紊乱，从而影响了软骨细胞的活性。为克服“空心”现象，以不可降解的生物材料为内支撑是一种较切实可行的途径。医用多孔高密度聚乙烯(high-density polyethylene，HDPE，商品名为MEDPOR)不可降解，具有较高的稳定性，其多孔性使得血管及软组织可长入而不致移位。体外实验表明，其三维颗粒特点有利于分化软骨细胞表型的维持及胞外基质的形成。Arevalo-Silva(Arevalo-Silva CA，Eavey RD，Cao Y，et al.Internal supportof tissue-engineered cartilage.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2000，126：1448-1452.)等将自体软骨细胞的Pluronic悬液接种于MEDPOR，于兔皮下构建出了高质量的带有MEDPOR内核的弹性软骨。并发现，组织工程化软骨与永久性内支撑的结合成功限制了MEDPOR的炎症反应。但是Pluronic是一种水凝胶，难以预塑形，不能满足整形外科所需特殊形态的要求，经我们研究发现，利用力学性能良好的且能被机体降解吸收的PGA无纺网包裹MEDPOR制备复合支架，再将自体软骨细胞接种其上，制备出了形态良好的带内支撑的组织工程化软骨，可基本解决这一问题(详见专利申请号200610028037.0，公开号CN1872353A)这种带有内支撑的组织工程化软骨的制备方法是将自体软骨细胞接种在预定体积与形状外裹预定厚度PGA无纺网的MEDPOR-PGA复合支架上，经体外培养一定时间后行皮下培养约两周，即可形成所需的带有内支撑的组织工程化软骨。

经动物体内移植证明，由PGA无纺网包裹的MEDPOR假体能保持一定的形态大小，PGA在体内逐渐被降解吸收并不断被新生的软骨基质替代，假体能长期留存体内而不发生排斥反应。

然而，由于软骨细胞属于增殖能力极弱的终末分化细胞，缺乏再生能力，来源极其有限，需经过手术切取肋软骨、耳廓等部位的软骨组织获取，常会造成供区的继发畸形，且软骨细胞体外培养传代会发生“去分化”现象，丧失增殖和分泌基质的能力，这严重限制了其作为种子细胞的应用，不适应临床所需，故必须探索新的种子细胞来源。骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)来源广泛，取材方便，体外增殖能力强，培养方法简便，更为重要的是可以在体内或体外定向分化为多种中胚层细胞，并表达相应分化细胞的表型。近来研究发现，TGF-β₁、TGF-β₃、IGF-1、BMP-6、地塞米松等生长因子或者糖皮质激素可以诱导BMSCs分化为软骨细胞(Pedrozo HA，Schwartz Z，Gomez R，etal.Growth plate chondrocytes store latent transforming growth factor(TGF)-beta 1 in their matrix through latent TGF-beta 1 bindingprotein-1.J Cell Physiol.1998，177：343-354.Arevalo-Silva CA，CaoYL，Weng YL，et al.The effect of fibroblast growth factor and transforminggrowth factor-βon porcine chondrocytes and t i ssue-engineeredautologous elastic cartilage.Tissue Engineering，2001，7：81-88.KiepeD，Ciarmatori S，Hoeflich A，et al.Insulin-like growth factor(IGF)-Istimulates cell proliferation and induces IGF binding protein(IGFBP)-3and IGFBP-5 gene expression in cultured growth plate chondrocytes viadistinct signaling pathways.Endocrinology.2005，146：3096-3104)但这些因子具有不同的生物学效能，产生的诱导效果并不完全，突出表现为构建组织结构不均、细胞外基质合成量少、力学强度不佳及可重复性不强。而以TGF-β1、IGF-I、胰岛素行联合诱导，可提高细胞的诱导效率和组织的成熟度。但迄今为止，尚未见以自体BMSCs为种子细胞，制备带内支撑的组织工程化软骨的报道。

发明内容

本发明提供一种用自体骨髓基质干细胞作为种子细胞制备具有一定体积与形状的带有内支撑的组织工程化软骨的方法。

本发明选用生物力学良好、具有可控降解速率的PGA无纺网包裹于特定形态和大小的内支撑——MEDPOR外，再于PGA无纺网内接种自体骨髓基质干细胞，经一定时间软骨向诱导液体外立体复合诱导，植入皮下一定时间后可构建出特定形态、组织学良好的MEDPOR-软骨复合体，用作临床内支撑植入体，以满足人体各部位塑形矫畸的目的。

本发明所用的软骨向诱导液为含TGF-β₁ 5-15ng/ml、IGF-I 40-60ng/ml、胰岛素20-40ng/ml的DMEM培养液。这种用骨髓基质干细胞作为种子细胞构建带有内支撑组织工程化软骨的制备方法如下：

1.BMSCs的分离培养及细胞悬液制备：

按常规在无菌条件下穿刺抽取自体骨髓，利用全骨髓贴壁培养法分离并提纯BMSCs，CO₂孵箱内培养，收集细胞制成细胞悬液备用。

2.生物材料支架的制备

将MEDPOR制成预定的体积与形状，外裹PGA无纺网，制成MEDPOR-PGA复合支架。

3.细胞-支架材料的复合

将复合支架清洗消毒后置入含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液预培养24h，取出吸干后，将上述制备的自体BMSCs细胞悬液均匀滴加于复合支架表面，37℃培养2-4h后移入含10％FBS的DMEM的培养液内按常规继续培养，隔日换液一次，5-7天后改用软骨向诱导液继续培养，3周后行皮下移植，皮下培养4-6周，即成本发明带内支撑的组织工程化软骨。

本发明利用生物力学性能较好的PGA无纺网包裹于具有特定形状大小且不会被降解的MEDPOR外制备支架，选用来源广，取材方便，体外培养增殖能力强，培养简单的自体BMSCs作为种子细胞，构建带有内支撑的组织工程化软骨，克服了以自体软骨细胞作为种子细胞的种种不足，使构建软骨假体变得容易，可适应临床需要。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作详细描述。

实施例1：构建用作耳廓假体的带内支撑的组织工程化软骨

1、BMSCs的分离培养及细胞悬液制备：

无菌条件下穿刺抽取小猪髂、股骨骨髓40ml，用无血清DMEM培养液离心洗涤2次，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液制成细胞混悬液，计数有核细胞，以7.5×10⁵个/cm²的密度接种于培养皿(美国Falcon公司)，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下培养，利用全骨髓贴壁培养法分离BMSCs，接种5d后首次换液，以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，去除悬浮红细胞。待细胞生长达到80％～90％融合后，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1.5×10⁴个/cm²的密度接种，常规传代扩增，将第1代细胞消化、收集、离心(1500r/min、5min)后弃上清，漩涡振荡器内混匀，加入含10％FBS的DMEM培养液，配成细胞密度为10×10⁷/ml的细胞悬液备用。

2、支架的制备与预处理

将MEDPOR(型号：6331；规格：50mm×76mm×1.5mm；性能：由多孔高密度聚乙烯聚合物制成；制造单位：Porex Surgical Inc.)于82-100℃热水内浸10分钟软化后，裁剪预塑形成耳廓形态，外裹2mm厚PGA无纺网，制成PGA-MEDPOR复合支架，95％酒精浸泡固定，外模具加压塑形。支架在细胞接种前75％酒精浸泡消毒30min，PBS冲洗两遍，加入含10％FBS的DMEM培养液预培养24h，吸干后备用。

3、细胞-支架复合及培养

将上述BMSCs细胞悬液均匀滴加于MEDPOR-PGA复合支架表面，37℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂孵箱内培养4h后移入60ml含有10％FBS的DMEM培养液内继续培养，隔日换液一次，5天后改用含TGF-β₁ 10ng/ml、IGF-I50 ng/ml、胰岛素40ng/ml的DMEM软骨向诱导液培养，3周后行猪皮下移植，继续培养6周后取出，即成为耳廓形态的带内支撑的组织工程化软骨假体。

实施例2：构建用作阴茎假体的带内支撑组织工程化软骨

细胞获取、支架预处理及细胞-支架复合培养方法同实施例1，内支撑的MEDPOR改为直径6mm，长30mm。

按需用上述方法，可制备多种假体，如鼻背、颅颌面骨/睾丸等假体。

Claims (3)

1.一种带内支撑的组织工程化软骨的制备方法，步骤如下：

(1)制备自体骨髓基质干细胞悬液

按常规在无菌条件下抽取自体骨髓，利用全骨髓贴壁培养法分离提纯BMSCs，CO₂孵箱内培养，收集细胞制成细胞悬液备用；

(2)生物材料支架的制备

将MEDPOR制成预定的体积与形状，外裹PGA无纺网，制成MEDPOR-PGA复合支架；

(3)细胞-支架复合及培养

将MEDPOR-PGA复合支架清洗消毒后置入含10％胎牛血清的DMEM培养液预培养后，取出吸干，将上述(1)制备的自体BMSCs细胞悬液均匀滴加于复合支架表面，37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂孵箱内培养培养2-4h后移入含10％FBS的DMEM的培养液内按常规继续培养，隔日换液一次，5-7天后改用软骨向诱导液继续培养，所说的软骨向诱导液为含TGF-β₁5-15ng/ml、IGF-I40-60ng/ml、胰岛素20-40ng/ml的DMEM培养液，3周后行皮下移植，皮下培养4-6周，即成带内支撑的组织工程化软骨。

2.按权利要求1所述带内支撑的组织工程化软骨的制备方法，其特征在于所说的软骨向诱导液含TGF-β₁10ng/ml、IGF-I50ng/ml、胰岛素40ng/ml。

3.权利要求1或2所述方法制备的带内支撑的组织工程化软骨。