CN106674343A - 蛋白质Myristoyl‑mGFP及其在检测蛋白质寡聚化程度中的应用 - Google Patents

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CN106674343A CN201610976219.4A CN201610976219A CN106674343A CN 106674343 A CN106674343 A CN 106674343A CN 201610976219 A CN201610976219 A CN 201610976219A CN 106674343 A CN106674343 A CN 106674343A
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Abstract

本发明公开了蛋白质Myristoyl‑mGFP及其在检测蛋白质寡聚化程度中的应用。本发明公开的蛋白质Myristoyl‑mGFP，为如下A1)、A2)、A3)或A4)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)氨基酸序列是序列1的第8‑244位的蛋白质；A3)将序列表中序列1或序列1的第212位的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，Myristoyl‑mGFP具有很好的单体性质可用于利用荧光漂白步数分析方法分析蛋白质寡聚化程度的标准参照。

Description

蛋白质Myristoyl-mGFP及其在检测蛋白质寡聚化程度中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，蛋白质Myristoyl-mGFP及其在检测蛋白质寡聚化程度中的应用。
背景技术
作为细胞活性及功能的主要参与者，蛋白质在许多生理过程中起到了不可替代的作用。蛋白质的寡聚化是指相同或不同的亚基通过非共价键形成的聚合体形式。多数蛋白质通过亚基之间相互作用形成聚合体才能具有生理活性，因此研究蛋白质的寡聚化对于研究蛋白质活性和功能十分重要。
荧光漂白步数分析(Step-wise Photobleaching)(应用全内反射单分子荧光成像研究蛋白复合物亚基组成，中国科学:化学，2012(12):1663-1671)方法利用荧光分子的光漂白特性，对成像过程中荧光衰减的情况进行统计，得到逐步的荧光强度变化，进而分析出荧光标记亚基的聚合状态。荧光漂白步数分析主要用于检测蛋白的寡聚化程度，若蛋白荧光点的强度呈现多个阶梯式的漂白曲线，则说明此蛋白为多聚体。绝大多数荧光漂白步数分析是在对目标蛋白进行荧光标记的基础上，依靠全内反射荧光显微镜平台完成的。
可变角全内反射荧光显微镜(VA-TIRFM，variable angle-total internalreflection fluorescence microscopy)利用全内反射产生的隐失波(evanescent field)激发样品，将照明区域限定在了样品表面100nm左右的薄层。样品中只有位于这个薄层内的荧光基团才能受到激发，从而避免了样品内部荧光基团对成像的干扰，能够提供高信噪比的成像效果，非常适用于分析膜蛋白的寡聚化程度。
荧光漂白步数分析需要单体性质较好的GFP提供标准参照。一般的GFP由于静电吸附会部分形成二聚体，植物细胞生物学研究中少有单体GFP(Monomeric GFP，mGFP)的报道。此外，常用的对照方法是将重组GFP溶液滴加在预处理的载玻片上，过程繁琐、操作复杂，而且对于研究植物材料，忽略了细胞壁自发荧光带来的背景噪声。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何分析蛋白质的寡聚化程度。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了从GFP改造得到的能用于荧光漂白步数分析蛋白质寡聚化程度的蛋白质。
本发明所提供的蛋白质，将其命名为mGFP，是如下A1)、A2)、A3)或A4)：
A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列1的第8-244位的蛋白质；
A3)将序列表中序列1或序列1的第8-244位的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)或A2)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1或序列1的第8-244位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A3)中的mGFP，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述A3)中的mGFP可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A3)中的mGFP的编码基因可通过将序列2或序列2的第22-735位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
在本发明的一个实施例中，mGFP为序列1所示的Myristoyl-mGFP或序列1的第8-244位所示的mGFP。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与mGFP相关的生物材料。
本发明所提供的与mGFP相关的生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码mGFP的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b1)、b2)、b3)或b4)：
b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b2)编码序列是序列表中序列2的第22-735位cDNA分子或DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码mGFP的cDNA分子或基因组DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码mGFP的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的mGFP。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码mGFP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的mGFP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码mGFP且具有mGFP功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1或序列1的第8-244位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码mGFP的核酸分子的表达盒(mGFP基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达mGFP的DNA，该DNA不但可包括启动mGFP基因转录的启动子，还可包括终止mGFP基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述mGFP基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为植物表达载体pCAMBIA2300。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
上述生物材料中，B2)所述表达盒中，启动B1)所述核酸分子表达的启动子可为CLC2基因启动子。
所述CLC2基因启动子可为植物CLC2基因启动子或动物CLC2基因启动子。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥。所述CLC2基因启动子的序列具体可为序列表中序列3所示。
B3)所述重组载体可为将序列表中序列2或序列2的第22-735位的核苷酸插入所述载体的多克隆位点间得到的载体。B3)所述重组载体具体可为pCAMBIA2300/pCLC2::Myristoyl-mGFP或pCAMBIA2300/pCLC2::mGFP，所述pCAMBIA2300/pCLC2::Myristoyl-mGFP为将植物表达载体pCAMBIA2300的Kpn I和Xba I间的DNA片段替换为序列2所示的DNA片段，并将EcoR I和Kpn I间的DNA片段替换为启动子proCLC2得到的重组载体；所述pCAMBIA2300/pCLC2::mGFP为将植物表达载体pCAMBIA2300的Kpn I和Xba I间的DNA片段替换为序列2的第22-735位所示的DNA片段，并将EcoR I和Kpn I间的DNA片段替换为启动子proCLC2，得到重组载体。pCAMBIA2300/pCLC2::Myristoyl-mGFP能表达序列1所示的蛋白质，pCAMBIA2300/pCLC2::mGFP能表达序列1的第8-244位所示的蛋白质。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
X1)mGFP在检测蛋白质寡聚化程度中的应用；
X2)mGFP作为参照在检测蛋白质寡聚化程度中的应用；
X3)mGFP在制备检测蛋白质寡聚化程度产品中的应用；
X4)所述生物材料在检测蛋白质寡聚化程度中的应用；
X5)所述生物材料作为参照在检测蛋白质寡聚化程度中的应用；
X6)所述生物材料在制备检测蛋白质寡聚化程度产品中的应用。
上述应用中，所述检测蛋白质寡聚化程度可利用荧光漂白步数分析方法进行。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测蛋白质寡聚化程度的方法。
本发明所提供的检测蛋白质寡聚化程度的方法，包括：以mGFP作为参照，检测目的蛋白质的寡聚化程度。
上述方法中，所述检测蛋白质寡聚化程度可利用荧光漂白步数分析方法进行。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测蛋白质寡聚化程度的物质。
本发明所提供的检测蛋白质寡聚化程度的物质，包括mGFP或所述生物材料与利用荧光漂白步数分析方法检测蛋白质寡聚化程度所需的试剂和/或仪器。
上述物质可由mGFP与利用荧光漂白步数分析方法检测蛋白质寡聚化程度所需的试剂和/或仪器组成，也可由所述生物材料与利用荧光漂白步数分析方法检测蛋白质寡聚化程度所需的试剂和/或仪器。所述利用荧光漂白步数分析方法检测蛋白质寡聚化程度所需的仪器可为可变角全内反射荧光显微镜。可变角全内反射荧光显微镜可为Olympus公司产品。
本发明中，所述蛋白质寡聚化可为植物蛋白质寡聚化或动物蛋白质寡聚化。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥。
本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述mGFP基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
实验证明，mGFP比GFP具有更好的单体性质：转Myristoyl-mGFP植物中Myristoyl-mGFP的单体所占百分比为转Myristoyl-GFP植物中Myristoyl-GFP的单体所占百分比的1.10倍，单体所占百分比增加了10％；转Myristoyl-mGFP植物中Myristoyl-mGFP的二聚体所占百分比为转Myristoyl-GFP植物中Myristoyl-GFP的二聚体所占百分比的0.22倍，二聚体所占百分比降低了78％。表明，mGFP及在其N端添加肉豆蔻酰化序列得到的Myristoyl-mGFP可用于利用荧光漂白步数分析方法分析蛋白质寡聚化程度的标准参照。
附图说明
图1为pCAMBIA2300/pCLC2::Myristoyl-GFP和pCAMBIA2300/pCLC2::Myristoyl-mGFP的结构示意图。
图2为可变角度全内反射荧光显微镜拍摄到的转Myristoyl-GFP拟南芥(pCLC2::Myristoyl-GFP)和转Myristoyl-mGFP拟南芥(pCLC2::Myristoyl-mGFP)的图像。
图3为背景移除后的转Myristoyl-GFP拟南芥(pCLC2::Myristoyl-GFP)和转Myristoyl-mGFP拟南芥(pCLC2::Myristoyl-mGFP)的图像。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的植物表达载体pCAMBIA2300(Robatzek S,Chinchilla D,BollerT.2006 Ligand-induced endocytosis of the pattern recognition receptor FLS2 inArabidopsis Gene Dev 20:537-542)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、与Myristoyl-GFP相比拟南芥中Myristoyl-mGFP的寡聚化程度减弱
本发明提供了蛋白质Myristoyl-mGFP，其氨基酸序列如序列表中序列1所示，蛋白质Myristoyl-mGFP为将GFP的氨基酸进行突变、并在其N端添加肉豆蔻酰化序列(序列1的第1-7位)得到的蛋白质。编码蛋白质Myristoyl-mGFP的DNA序列(Myristoyl-mGFP基因序列)为序列表中序列2。肉豆蔻酰化序列使得目的蛋白锚定在拟南芥叶片表皮细胞膜上有表达。
将只将GFP的一个氨基酸进行突变得到的蛋白质命名为mGFP，其氨基酸序列为序列表中序列1的第8-244位，编码mGFP的DNA序列(mGFP基因序列)为序列2的第22-735位。
将只在GFP的N端添加肉豆蔻酰化序列(序列1的第1-7位)得到的蛋白质命名为Myristoyl-GFP，其氨基酸序列为将序列表中序列1的第212位的赖氨酸突变为丙氨酸得到的序列，编码Myristoyl-GFP的DNA序列(Myristoyl-GFP基因序列)为将序列2的第634-636位的AAA突变为GCC得到的序列。
GFP的氨基酸序列为将序列1的第212位的赖氨酸突变为丙氨酸后第8-244位所示的序列，编码GFP的DNA序列(GFP基因序列)为将序列2的第634-636位的AAA突变为GCC后第22-735位所示的序列。
本实施例采用拟南芥网格蛋白轻链基因(AT2G40060)的内源启动子proCLC2(序列表中序列3所示DNA片段，pCLC2)用来驱动GFP基因、Myristoyl-GFP基因、mGFP基因和Myristoyl-mGFP基因的表达。
一、植物材料的制备
1、植物表达重组质粒的构建
将植物表达载体pCAMBIA2300的Kpn I和Xba I间的DNA片段替换为Myristoyl-mGFP基因，并将EcoR I和Kpn I间的DNA片段替换为启动子proCLC2，得到重组载体，将该重组载体命名为pCAMBIA2300/pCLC2::Myristoyl-mGFP，该重组载体中，pCLC2启动Myristoyl-mGFP基因的表达，得到Myristoyl-mGFP(图1)。
将植物表达载体pCAMBIA2300的Kpn I和Xba I间的DNA片段替换为mGFP基因，并将EcoR I和Kpn I间的DNA片段替换为启动子proCLC2，得到重组载体，将该重组载体命名为pCAMBIA2300/pCLC2::mGFP，该重组载体中，pCLC2启动mGFP基因的表达，得到mGFP。
将植物表达载体pCAMBIA2300的Kpn I和Xba I间的DNA片段替换为Myristoyl-GFP基因，并将EcoR I和Kpn I间的DNA片段替换为启动子proCLC2，得到重组载体，将该重组载体命名为pCAMBIA2300/pCLC2::Myristoyl-GFP，该重组载体中，pCLC2启动Myristoyl-GFP基因的表达，得到Myristoyl-GFP(图1)。
将植物表达载体pCAMBIA2300的Kpn I和Xba I间的DNA片段替换为GFP基因，并将EcoR I和Kpn I间的DNA片段替换为启动子proCLC2，得到重组载体，将该重组载体命名为pCAMBIA2300/pCLC2::GFP，该重组载体中，pCLC2启动GFP基因的表达，得到GFP。
2、转基因拟南芥的获得
利用拟南芥浸花法转化方法，将步骤1构建的重组载体分别导入农杆菌中转化哥伦比亚(Columbia-0)野生型拟南芥，经卡那霉素筛选获得转基因单拷贝纯合体植株，收获转基因拟南芥种子。利用pCAMBIA2300转化拟南芥，作为空载体对照。
将利用pCAMBIA2300/pCLC2::Myristoyl-mGFP得到的转基因拟南芥命名为转Myristoyl-mGFP拟南芥，将利用pCAMBIA2300/pCLC2::mGFP得到的转基因拟南芥命名为转mGFP拟南芥，将利用pCAMBIA2300/pCLC2::Myristoyl-GFP得到的转基因拟南芥命名为转Myristoyl-GFP拟南芥，将利用pCAMBIA2300/pCLC2::GFP得到的转基因拟南芥命名为转GFP拟南芥，将利用pCAMBIA2300得到的转基因拟南芥命名为空载拟南芥。
二、寡聚化程度检测
将步骤一得到的各转基因拟南芥的T3代纯合种子及哥伦比亚野生型拟南芥种子置于1.5ml离心管中，加入2.5％的次氯酸钠浸泡10min，随后用灭菌水清洗5次，播种到1/2MS培养基(1/2MS培养基中的蔗糖的质量百分比含量为1.0％，除蔗糖外，该1/2MS培养基其余溶质均同MS培养基，且其余溶质均为MS培养基的1/2，pH值为5.8)上，22℃培养4天，得到拟南芥幼苗。以拟南芥幼苗叶片表皮细胞为检测材料，利用荧光漂白步数分析方法分析各拟南芥中目的蛋白的寡聚化程度，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
(一)可变角全内反射荧光显微镜观测样品并获取图像
用可变角全内反射荧光显微镜(Olympus公司)对上述各拟南芥叶片表皮细胞进行观测，曝光时间为200ms，绿色通道激发光波长为473nm，EMCCD(Andor公司)增益值为400，帧数为100，对视野下的拟南芥幼苗叶片表皮进行拍摄，得到图像。图2为用可变角全内反射荧光显微镜拍摄的叶片表皮细胞的原始图像。
(二)图像格式转换及背景移除
启动ImageJ(版本为1.42q)软件，打开时间序列图像，在图像非细胞区域选择背景区域。通过Plugins->ROI->BG Subtraction from ROI，设置Enter Scaling factor为3，点击“OK”，待完成背景移除，可通过Image->Adjust->Brightness/Contrast，点击“Auto”看到移除背景后的图像。点击将完成背景移除的图像File->Save as另存为Tiff格式文件，图3为背景移除后的转Myristoyl-GFP拟南芥和转Myristoyl-mGFP拟南芥的图像。
(三)PIF(progressive idealization and filtering)完成荧光漂白步数分析
(1)启动PIF软件，点击Parameters进行参数设定，将Time per frame设定为235.5ms，同时勾选去“Auto detect starting frame”选项。点击“OK”。
(2)点击“set global path”选择路径，设定分析结果保存的文件夹目录。
(3)点击“Select Files”，选择完成背景移除的图像文件。
(4)点击“ROI”，在弹出对话框中点击“New ROI matrix”，然后再点击Add ROI，在图中选择分析区域。完成点击“Done”。
(5)点击“FIT IT”，执行分析，待分析结束后，保存“further analysis”文件。
(6)点击“CLEAR”，清除已分析的图像信息，以便进行新的分析。
(7)在保存分析结果的文件夹中打开histo numofstep.xls文件，统计单体(一步漂白)和二聚体(二步漂白)的百分比，结果如表2所示。
在检测过程中发现，空载拟南芥和野生型拟南芥均无荧光信号，故只统计其余转Myristoyl-mGFP拟南芥和转Myristoyl-GFP拟南芥的目的蛋白的单体和二聚体所占百分比。
表2、各拟南芥目的蛋白单体和二聚体所占百分比
拟南芥 单体 二聚体
转Myristoyl-mGFP拟南芥 97.62±0.04％ 2.37±0.41％
转Myristoyl-GFP拟南芥 88.81±2.55％ 10.55±2.56％
结果显示，转Myristoyl-mGFP拟南芥中目的蛋白单体所占百分比为转Myristoyl-GFP拟南芥的1.10倍，单体所占百分比增加了10％；转Myristoyl-mGFP拟南芥中目的蛋白二聚体所占百分比为转Myristoyl-GFP拟南芥的0.22倍，二聚体所占百分比降低了78％。表明，Myristoyl-mGFP比Myristoyl-GFP具有更好的单体性质，可用于利用荧光漂白步数分析方法分析蛋白质寡聚化程度的标准参照。
<110> 中国科学院植物研究所
<120> 蛋白质Myristoyl-mGFP及其在检测蛋白质寡聚化程度中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Met Gly Ile Gly Lys Ser Lys Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
1 5 10 15
Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys
20 25 30
Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu
35 40 45
Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro
50 55 60
Thr Leu Val Thr Thr Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu
85 90 95
Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr
100 105 110
Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg
115 120 125
Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly
130 135 140
His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala
145 150 155 160
Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn
165 170 175
Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr
180 185 190
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser
195 200 205
Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met
210 215 220
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp
225 230 235 240
Glu Leu Tyr Lys
<210> 2
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
atgggcatcg gcaaatctaa aagtaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt 60
cttgttgaat tagatggtga tgttaatggg cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa 120
ggtgatgcaa catacggaaa acttaccctt aaatttattt gcactactgg aaaactacct 180
gttccatggc caacacttgt cactaccttc acctatggtg ttcaatgctt ttcaagatac 240
ccagatcata tgaagcggca cgacttcttc aagagcgcca tgcctgaggg atacgtgcag 300
gagaggacca tcttcttcaa ggacgacggg aactacaaga cacgtgctga agtcaagttt 360
gagggagaca ccctcgtcaa caggatcgag cttaagggaa tcgatttcaa ggaggacgga 420
aacatcctcg gccacaagtt ggaatacaac tacaactccc acaacgtata catcatggcc 480
gacaagcaaa agaacggcat caaagccaac ttcaagaccc gccacaacat cgaagacggc 540
ggcgtgcaac tcgctgatca ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt 600
ttaccagaca accattacct gtccacacaa tctaaacttt cgaaagatcc caacgaaaag 660
agagaccaca tggtccttct tgagtttgta acagctgctg ggattacaca tggcatggat 720
gaactataca aataa 735
<210> 3
<211> 1841
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gagtcggaga tgatgattat gatgaaaata aagtatcact ccttcagata tcacctcgaa 60
cggtccatca ttttctgtta tatcgattat ctctggtata ccttcgagtt cttttccatc 120
ccacacatct ttcccaagag cgcatattga atgaacaaca taatcgctac acgtgtcaca 180
agtatatgca ccataatcaa cgttaatact taaacggcaa actccacaaa accattctct 240
agatgtaaga gaaaaagtga acgagatacg atgacggtga cgtgatatct tgatgatgtg 300
tggggaattc atacagtcat tatgagttac aaagttacat ctgaaacaaa cgtaggtggg 360
ataaattttt ctcaacaaac cacaaacatt acaagtcaag gaagtttgtc tggggaaaaa 420
agtgagagga tggatatgct tttttggtgg gtctataaga aaaggtattg gcttcatcgc 480
acatatggga tgcataaaag cctggcatgt ggtgcaatga taaatcaacc aatgtgcttt 540
tcttccacaa cataaacact caatcttacg aaagttatca tcatgaaaga aaagttggag 600
atagtgctca gggtggtaag gatgtttgat tataagtgga gattgaatgc attctttgtg 660
taattttatg ctacaatagt tgcagaaata atagtcggtg ccggaatttg agccttcgca 720
tatgtagcat ccaccatcag catcaaattc tttattgttg caccaaaaca aagggagtac 780
atgatgatca tgagaggtcg tcgttgtaga aaggacgtac tcgggggaag aattaagcgg 840
ataagtgtct gaatacgact tgatttttcg acgtcgtgat cgagggcata agaaaagagg 900
ttgaaggtca ctggaggagg ttacggtctg tgtttggggt atggggcaat atttcggatg 960
atggtatacc aaaacaaggt taccatcctt ttccacctca taaaatcctc cgacgctaga 1020
atccatgaat gtgttaagtc tttgtttatt tttgttttag gcttttataa aaaaatattt 1080
gtcatacaag atatcaagtt gttaacattt ttcctctata aatacgaaaa tttgattcca 1140
aaagttttct tctactcttg attattaata tacttaaacg tgaaaacata tggttgattt 1200
tgttcctttt ctcagtagtt gtgatgataa tgttcttctt tacatgcaaa taaagaatca 1260
acttttcttt gcacatagtt ttgttcattt ctgatgttcc atgacttcaa gactctatat 1320
taatcgtgct caatgattgt gccaattcat tagtagtgta taatttgaga ctttgtgaac 1380
tcaatcacga aacacacaaa aagaaaatga aggtttattc aaaaaaaaaa aaaaaatgaa 1440
ggtttgaaat ggaaaatgaa acaatcgtac caaaaccaaa ttgcaaaacg ttttaaacaa 1500
gaaaagaaga acacgtagtt tcaatgatcc ggttgaatta gaaagtagaa caaccgaacc 1560
cacactaaat tgcaaaacgt tttgattaag ataagaagaa cacgtatgga acattaattg 1620
taatctaatg gatcggttgg aacctaaacc ataactaaac cggaatactc atgatgaatt 1680
ggaagtattt gggctcgaaa aaagcccatt aagaaaaatg gaaataaaaa tagtcacaaa 1740
tctccgttat taatttttgc cataagcttg agaacacttg aaaagacaag attcgcgagt 1800
tcttcgttct gccttttttt ttttttttgt gtgttcgaga g 1841

Claims (10)

1.蛋白质，为如下A1)、A2)、A3)或A4)：
A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列1的第8-244位的蛋白质；
A3)将序列表中序列1或序列1的第212位的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)、b2)、b3)或b4)：
b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b2)编码序列是序列表中序列2的第22-735位cDNA分子或DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
和/或，
B2)所述表达盒中，启动B1)所述核酸分子表达的启动子为CLC2基因启动子。
4.下述任一应用：
X1)权利要求1所述蛋白质在检测蛋白质寡聚化程度中的应用；
X2)权利要求1所述蛋白质作为参照在检测蛋白质寡聚化程度中的应用；
X3)权利要求1所述蛋白质在制备检测蛋白质寡聚化程度产品中的应用；
X4)权利要求2所述生物材料在检测蛋白质寡聚化程度中的应用；
X5)权利要求2所述生物材料作为参照在检测蛋白质寡聚化程度中的应用；
X6)权利要求2所述生物材料在制备检测蛋白质寡聚化程度产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述检测蛋白质寡聚化程度利用荧光漂白步数分析方法进行。
6.检测蛋白质寡聚化程度的方法，包括：以权利要求1所述蛋白质作为参照，检测目的蛋白质的寡聚化程度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述检测蛋白质寡聚化程度利用荧光漂白步数分析方法进行。
8.检测蛋白质寡聚化程度的物质，包括权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述生物材料与利用荧光漂白步数分析方法检测蛋白质寡聚化程度所需的试剂和/或仪器。
9.根据权利要求4或5所述的应用，或权利要求6或7所述的方法，或权利要求8所述的物质，其特征在于：所述蛋白质寡聚化为植物蛋白质寡聚化或动物蛋白质寡聚化。
10.根据权利要求9所述的应用、方法或物质，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
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