CN106668054A - 异长春花苷内酰胺的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了异长春花苷内酰胺在制备治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用，解决了常规治疗蛛网膜下腔出血药物不足的问题，具有的优点及积极效果是：显著减轻蛛网膜下腔出血导致的脑水肿程度；减少蛛网膜下腔残留血液的量；降低血脑屏障的破坏程度；减轻脑基底动脉血管痉挛程度；提高神经功能评分等。通过改善上述几种临床指标进而提高患者的预后，对蛛网膜下腔出血有显著的治疗作用。

Description

异长春花苷内酰胺的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是异长春花苷内酰胺作为制备治疗药物的新用途。

背景技术

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)分为原发性和继发性两种。 原发性蛛网膜下腔出血是由于脑表面和脑底的血管破裂出血，血液直接流入蛛网膜下腔所致，又称自发性SAH。而脑实质或脑室出血、外伤性硬膜下或硬膜外出血流入蛛网膜下腔定义为继发性SAH。 原发性蛛网膜下腔出血最常见的病因是先天性颅内动脉瘤和血管畸形，死亡率高达32％-67％，其中动脉瘤性SAH占85％以上。当SAH发生后，患者表现颅内压增高，脑血流量减少，脑灌注压降低，出现脑水肿、血脑屏障破坏，神经元细胞死亡，并继发脑血管痉挛等症状。尽管目前临床对这类疾病已经形成一系列规范化诊疗，但预后仍不理想，致死、致残率较高，约50％的患者在发生SAH后30天内死亡。

目前除手术治疗外，针对蛛网膜下腔出血临床常规药物治疗包括：

(1)头痛时可用止痛药，保持便通可用缓泻剂。适量给予生理盐水保证正常血容量和足够脑灌注，低钠血症常见，可口服NaCl或3%生理盐水静脉滴注，不限制液体。避免使用损伤血小板功能药物如阿司匹林。

(2)SAH引起颅内压升高，用20%甘露醇、呋塞米(速尿)和人血白蛋白(白蛋白)等脱水降颅压治疗。

(3)预防再出血：抗纤溶药可抑制纤溶酶形成，推迟血块溶解和防止再出血。常用氨基己酸(6-氨基己酸)4～6g加于0.9%生理盐水100ml静脉滴注，15～30min内滴完，再以1g/h剂量静滴12～24h;之后24g/d，持续3～7天，逐渐减量至8g/d，维持2～3周;肾功能障碍者慎用，副作用为深静脉血栓形成。氨甲苯酸(止血芳酸)0.4g缓慢静注，2次/d，或促凝血药(立止血)、维生素K3等，但止血药应用仍有争论。高血压伴癫痫发作可增加动脉瘤破裂风险，常规推荐预防性应用抗癫痫药如苯妥英(苯妥英钠)300mg/d。 (4)预防性应用钙通道拮抗药(calciumchannelantagonist)：尼莫地平(nimodipine)40mg口服，4～6次/d，连用21天;尼莫地平(硝苯吡酯)10mg/d，6h内缓慢静脉滴注，7～14天为一疗程。可减少动脉瘤破裂后迟发性血管痉挛导致缺血合并症。用去氧肾上腺素(苯肾上腺素)或多巴胺使血压升高可治疗血管痉挛，确定动脉瘤手术治疗后用此方法较安全。

研究显示，针对SAH的病理机制使用有效的药物干预，能够阻止或减轻各类蛛网膜下腔出血导致的脑损伤，提高患者的预后，降低致残致死率，减轻国家和家庭的经济负担，提高个人的生活质量。但是目前的常规药物治疗仍然不能显著提高患者的预后，因此寻找新的有效的SAH干预药物是亟待解决并非常有临床意义的。

异长春花苷内酰胺是从植物中提取或合成的一种吲哚类生物碱糖苷，在常规医疗药物治疗中具有抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛、止咳平喘、抗肿瘤和杀疟原虫以及抗色素沉着的作用。在用其作为药效成分制成的药品和试剂的文献及报道中，未见有作为治疗制备蛛网膜下腔出血药物应用的记载。

发明内容

本发明的目的是提供异长春花苷内酰胺在制备药物中的新应用，解决了常规治疗蛛网膜下腔出血药物不足的问题，该应用使异长春花苷内酰胺具有了作为制备治疗蛛网膜下腔出血药物有效成分的新用途。

本发明的技术方案是：异长春花苷内酰胺的应用，技术要点是：异长春花苷内酰胺在制备治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。

所述的异长春花苷内酰胺，是从含有该成分的植物、中药材或者中药饮片中提取得到，或采用化学合成的产品。

所述植物和中药材包括乌檀、钩藤、长春花、蛇根木、短小蛇根草、黄长春花、风箱树、鸡仔木、蛇根木。

所述的异长春花苷内酰胺是从茜草科乌檀属植物的枝、干、皮或叶中提取得到。

所述的异长春花苷内酰胺作为药效成分单独或与制药可接受的赋形剂结合使用，制成肌肉注射给药或静脉给药剂型的药物制剂。

所述的异长春花苷内酰胺是纯的异长春花苷内酰胺化合物单体或异长春花苷内酰胺单体含量在95%以上的异长春花苷内酰胺提取物。

所述的蛛网膜下腔出血包括先天性颅内动脉瘤和脑血管动静脉畸形引发的蛛网膜下腔出血，还包括外伤、高血压、脑动脉硬化、颅内肿瘤、血液病、脑底异常血管网症、动脉炎、脑炎、抗凝治疗并发症和/或脑膜炎诱发的蛛网膜下腔出血。

本发明具有的优点及积极效果是：

1.显著减轻蛛网膜下腔出血导致的脑水肿程度；

2.减少蛛网膜下腔残留血液的量；

3.降低血脑屏障的破坏程度；

4.减轻脑基底动脉血管痉挛程度；

5.提高神经功能评分等。

通过改善上述几种临床指标进而提高患者的预后，对蛛网膜下腔出血有显著的治疗作用。

附图说明

图1为sham组、SAH组、STR(3)治疗组和STR(6)治疗组的四组脑水肿程度比较图；

图2为脑表面出血量分区评分示例图；

图3为sham组、SAH组、STR(3)治疗组和STR(6)治疗组的四组大鼠蛛网膜下腔残留血量比较及评分图；

图4为sham组、SAH组、STR(3)治疗组和STR(6)治疗组的四组神经功能评分图；

图5为 sham组、SAH组、STR(3)治疗组和STR(6)治疗组的各组脑组织血脑屏障完整性含量测定图；

图6为sham组、SAH组、STR(3)治疗组和STR(6)治疗组的各组脑基底动脉血管痉挛程度评估图。

具体实施方式

本发明提供了一种异长春花苷内酰胺的新用途，即作为制备治疗蛛网膜下腔出血药物应用，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但并不意味着本发明仅限于此，实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂、药品等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

使用的异长春花苷内酰胺可以是从含有该成分的植物、中药材或者中药饮片中提取得到，或采用化学合成的产品，可以通过现有技术中公开的方法获得，也可以采用常规中药提取方法获得，所述植物和中药材包括乌檀、钩藤、长春花、蛇根木、短小蛇根草、黄长春花、风箱树、鸡仔木、蛇根木。其中优选为从茜草科乌檀属植物的枝、干、皮或叶中提取得到。异长春花苷内酰胺可以作为药效成分单独或与制药可接受的赋形剂结合使用，可以制成肌肉注射给药或静脉给药剂型的药物制剂。异长春花苷内酰胺可以是纯的异长春花苷内酰胺化合物单体，也可以是异长春花苷内酰胺单体含量在90%以上的异长春花苷内酰胺提取物，优选95%以上，可采用高效液相色谱法测得。本申请人例举了采用异长春花苷内酰胺含量为95%开展了相关药效作用实验。

采用SD大鼠作为蛛网膜下腔出血模型，并使用异长春花苷内酰胺作为制备治疗药物应用实验，首先将SD大鼠随机分成四组，分别为sham组、SAH组、STR (3)治疗组和STR (6)治疗组，每组18只，其中sham组为假手术组；SAH组为蛛网膜下腔出血模型组；STR(3)治疗组为异长春花苷内酰胺3mg /kg给药组；STR(6)治疗组为异长春花苷内酰胺6mg /kg给药组。

实施例1.蛛网膜下腔出血大鼠模型的制作及给药方案

采用颈内动脉穿刺法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型，取清洁级、健康成年雄性SD大鼠，体重为250-300g。用10% 水合氯醛 (3.5ml/kg) 腹腔注射麻醉后仰卧固定。固定头部及四肢，颈前部备皮、消毒，取颈部正中切口，钝性分离暴露右侧颈总动脉(common carotidartery,CCA)、颈外动脉(externalcarotidartery,ECA)和颈内动脉(internal carotidartery,ICA)结扎切断ECA和ICA之间的吻合支，将ECA结扎并切断拉直，使其与ICA成一直线。取3-0单股尼龙线（直径0.261mm）将头端锐化，于线端20mm和22mm处作标记，将尼龙线从颈外动脉置入颈内动脉的颅内段，插入深度为20mm左右，当感觉有阻力时再前进2mm刺破血管，造成蛛网膜下腔出血，大约10秒后迅速将尼龙线拔出，用丝线结扎颈外动脉残端，恢复血流，缝合颈部切口。术中维持体温37℃。除sham组（假手术组）不刺破血管壁外，其余各组操作均与SAH组（模型组）一致。麻醉未清醒前给予电热毯保暖，术后大鼠单笼饲养，注意保暖。

然后采用异长春花苷内酰胺（Strictosamide, STR）（纯度95.3%，中检所标准品）在对大鼠进行蛛网膜下腔出血造模后0.5h和24h进行尾静脉注射给药，使用剂量分别为STR3mg/kg组（STR (3)治疗组）和STR 6mg/kg组（STR (6)治疗组）。sham组和SAH组给予等量生理盐水。

实施例2.对脑水肿程度检测

按照实施例1中模型制备方法及给药方案治疗，各组大鼠于造模后48h用10 %水合氯醛麻醉，开颅取全脑，切取全脑迅速放入预先称好重量的锡箔上称重，此重量减去锡箔重量即为湿重W1，随后放入烤箱中在110℃条件下烘72h后再次称重，此重量减去锡箔重量即为干重W2，脑水肿指数即可用下述公式求得。脑水肿指数=[(W1-W2)/ W1]×100%。

实验结果如图1所示，四组脑水肿程度（Brain water content）平均值±标准差比较，右半脑（R.H.）即患侧的SAH组与sham组相比，脑组织含水量存在显著差异，（**P<0.01）；STR(3)治疗组和STR(6)治疗组分别与SAH组比较，脑组织含水量均存在显著差异（##P<0.01）。左半脑（L.H.）和小脑（C）的SAH组与sham组相比脑水肿变化程度不显著但STR(3)治疗组和STR(6)治疗组与SAH组比较存在显著差异（*P<0.05）。说明异长春花苷内酰胺能够显著减轻蛛网膜下腔出血后脑水肿的程度。

实施例3.各组蛛网膜下腔残留血量比较

按照实施例1中模型制备方法及给药方案治疗，各组大鼠于造模后48 h用10 %水合氯醛麻醉，开颅取全脑拍照，如图2所示，对脑表面Willis环及基底动脉等各分区出血量进行观察，进行评分。基底池被分为六个部分，如图2的A部，各部分根据出血量从0-3分进行评分—0分：下腔未出血；1分：下腔有少量血；2分：在可以辨别的血管上有中等量的血；3分：在整个血管上覆盖着大量的血(如图2的B和C部)。基底池内主动脉的评分制度：对基底动脉(BA)和Willis环构成的大脑前动脉 (ACA)，颈内动脉 (ICA)，从ICA到后交通动脉的近后端脑动脉 (PCA)以及后交通动脉(PcomA)进行评分。大脑中动脉 (MCA)，PCA末梢和小脑上动脉 (SCA)不在评分的范围内。只对基底池上的血管进行评分以保证重现性和一致性。血管的6个部分总评分从0分到18分。依据动物的最终得分将其分为三类：0-7分：轻微SAH；8-12分：中等SAH；13-18分：严重SAH。实验采用双盲法。假手术组动物未见出血，总得分为0分。

实验结果如图3所示，图3左部为造模后48h各组蛛网膜下腔残留血量直观图；图3右部为各组蛛网膜下腔残留血量（SAH Grade）的评分结果：SAH组与sham组相比，蛛网膜下腔血量存在显著差异（***P<0.001）; STR(3)治疗组与SAH组相比，蛛网膜下腔血量显著减少，存在显著差异（###P<0.001）；STR(6)治疗组与SAH组比较，蛛网膜下腔血量显著减少，也存在显著差异（###P<0.001）。说明异长春花苷内酰胺能够减少蛛网膜下腔出血残留血量，从而减少血红蛋白等对脑组织的炎症刺激等不良的相关反应。

实例4.大鼠行为学-神经功能评分

按照实施例1中模型制备方法及给药方案治疗，如图4所示，参照Sugawara标准于术后24h对各组动物进行行为学神经功能评分(Neurological score)，最低分：3分，最高分：18分。分值越低则说明动物的神经功能缺陷越严重。

(1)自发性活动：大鼠置于笼中观察5分钟，根据对笼子四壁的接触评分。3分：可以自由的运动，能触到笼子至少3侧面；2分：能触及笼子侧壁，但不到3个侧面；1分：仅仅

可以移动位置；0分：不能运动。

(2)四肢运动对称：将大鼠提尾置于空中观测其四肢的运动对称性。3分：四肢对称，与蛛网膜出血前无明显差异；2分：肢体无力或运动迟缓；1分：肢体极度无力，仅仅有轻微活动；0分：肢体不能运动。

(3)前脚伸展：将大鼠提尾至桌子的边缘，让其靠前肢前行，观测当接近桌面时前肢的伸展情况。3分：双前肢伸展同蛛网膜下腔出血前；2分：前腿伸展较正常差；1分：前腿仅仅有轻度的伸展；0分：前腿无动作。

(4)攀登：将大鼠置于竖直的10cm×100cm金属网上，正常时大鼠四肢上爬，提尾使大鼠离开笼子，观测大鼠四肢力量。3分：爬行容易，紧抓金属网有力；2分：攀爬困难；1分：不能攀爬。

(5)对双侧躯干的触碰反应：用钝头木棒刺激大鼠一侧身体，观测其对刺激的反应。3分：大鼠迅速转头，双侧对称；2分：仅仅有轻微的反应；1分：对躯干的触碰无反应。

(6)触须反应：钝头木棒刺激一侧胡须，木棒从背后触及胡须避免大鼠看见木棒。3分：双侧对称反应；2分：轻微反应；1分：无反应。

结果如图4所示，SAH组与sham相比，行为学神经功能评分存在显著差异（**P<0.01）; STR(3)治疗组和STR(6)治疗组分别与SAH组比较，行为学评分均显著提高，都存在显著差异（#P<0.05和##P<0.01）。说明异长春花苷内酰胺能够显著提高蛛网膜下腔出血后动物的行为能力，减少神经功能的损伤。

实例5.血脑屏障通透性测定

按照实施例1中模型制备方法及给药方案治疗，然后按照下列步骤对血脑屏障通透性进行检测（EB content）如图5所示：

1） 建立标准曲线：配制0.1 mg/ml EB溶液为初始浓度液体，进行倍比稀释，形成梯度

溶液0.1、0.05、0.025、0.0125、0.0063的EB标准浓度，应用紫外分光光度仪620nm进行比色，甲酰胺溶液做空白，进行回归分析求得标准曲线。

（2）大鼠麻醉后经股静脉注射 2% EB (5 ml/kg)，1h 后处死，为了清除血液中染料，向左心室灌注生理盐水直至右心室流出透明液体为止，断头后取脑，分为左脑、右脑及小脑三个部分，称重后按10ml/g浸入甲酰胺溶液中，在60℃恒温水浴箱中孵育24h，甲酰胺溶液呈现深浅不同的蓝色，脑组织呈现无色透明状，然后应用紫外分光光度仪进行比色，波长设定 620nm。根据标准曲线计算出 EB 含量。

如图5所示，在L.H(左半脑)、R.H(右半脑)和C(小脑)三个不同脑区中，SAH组与sham组相比，脑组织中EB含量显著高于sham组（**P<0.01）；STR(3)治疗组和STR(6)治疗组分别与SAH组比较，脑组织中EB含量显著低于SAH组（#P<0.05和##P<0.01）。这些实验数据说明，异长春花苷内酰胺能够显著降低血脑屏障的破坏，保护血脑屏障的完整性，对脑组织起到保护作用。

实例6.大鼠脑血管痉挛的检测

按照实施例1中模型制备方法及给药方案治疗，然后按照下列方法进行实验：

一、取材：实验大鼠经左侧开胸，剪开心包膜暴露心脏，在膈肌上胸腔内夹闭胸主动脉及下腔静脉，以27G留置针于心尖处穿刺，并将留置针置升主动脉，然后剪开右心耳，先以含肝素（20 U/ml）的生理盐水冲洗，量约150-200ml，排除血管内血液，然后而以 4%多聚甲醛心脏灌注，速度先快后慢，灌注时间约 10min～15min，量约250-300ml，此过程中可发现，大鼠颈部逐渐变硬，大鼠双上肢或四肢抽搐。灌注结束后，开颅取脑，观察脑基底池及Willis动脉环周围积血情况，然后将组织标本浸泡于4% 多聚甲醛中过夜。

二、 HE染色：主要显示基底动脉的一般形态结构。

染色步骤如下：

（1）石蜡切片入二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10 min；

（2）无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3 min，梯度酒精95%、90%、85%、80%、70%各5s，蒸馏水洗；

（3）苏木素染色 4 min；

（4）1%盐酸酒精分色 2s，显微镜下观察掌握分色程度；

（5）自来水洗20min，蓝化；

（5）浸入伊红染色液 (0.5%) 1分钟；

（8）梯度酒精90%、95%各 1min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各 5min；

（9）二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各 5min；

（10）中性树胶封片。

三、测量：取每只大鼠基底动脉HE染色切片，Nikon光学显微镜下拍照，参照文献法 [3]通过测量基底动脉管腔面积确定血管痉挛程度。采用Image Pro Plus图像分析系

统计算管腔面积和总面积比，最后应用SPSS 17.0进行统计分析。

实验结果如图6所示，图6A部：各组基底动脉形态变化（HE，200）；图6B部：各组血管痉

挛程度统计比较： SAH组与sham组比较，血管痉挛程度存在极显著差异（***P<0.0001）； STR(3)治疗组和STR(6)治疗组分别与SAH组比较，血管痉挛程度均显著低于SAH组（###P<0.001）。实验结果说明，异长春花苷内酰胺能够有效的预防脑基底动脉血管痉挛的发生。

综上所述，本发明通过大量的动物体内实验证实，异长春花苷内酰胺能够有效改善蛛网膜下腔出血后多项生理指标，在蛛网膜下腔出血的早期脑损伤的治疗中有确切的治疗效果。

Claims (8)

1.异长春花苷内酰胺的应用，其特征在于：异长春花苷内酰胺在制备治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的异长春花苷内酰胺的应用，其特征在于：所述的异长春花苷内酰胺，是从含有该成分的植物、中药材或者中药饮片中提取得到，或采用化学合成的产品。

3.根据权利要求2所述的异长春花苷内酰胺的应用，其特征在于：所述植物和中药材包括乌檀、钩藤、长春花、蛇根木、短小蛇根草、黄长春花、风箱树、鸡仔木、蛇根木。

4.根据权利要求2所述的异长春花苷内酰胺的应用，其特征在于：所述的异长春花苷内酰胺是从茜草科乌檀属植物的枝、干、皮或叶中提取得到。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的异长春花苷内酰胺的应用，其特征在于：所述的异长春花苷内酰胺是纯的异长春花苷内酰胺化合物单体或异长春花苷内酰胺单体含量在95%以上的异长春花苷内酰胺提取物。

6.根据权利要求1至4任意一项所述的异长春花苷内酰胺的应用，其特征在于：所述的异长春花苷内酰胺作为药效成分单独或与制药可接受的赋形剂结合使用，制成肌肉注射给药或静脉给药剂型的药物制剂。

7.根据权利要求6所述的异长春花苷内酰胺的应用，其特征在于：所述的异长春花苷内酰胺是纯的异长春花苷内酰胺化合物单体或异长春花苷内酰胺单体含量在95%以上的异长春花苷内酰胺提取物。

8.根据权利要求1所述的异长春花苷内酰胺的应用，其特征在于：所述的蛛网膜下腔出血包括先天性颅内动脉瘤和脑血管动静脉畸形引发的蛛网膜下腔出血，还包括外伤、高血压、脑动脉硬化、颅内肿瘤、血液病、脑底异常血管网症、动脉炎、脑炎、抗凝治疗并发症及脑膜炎诱发的蛛网膜下腔出血。