CN106619175A - 一种基因重组超氧化物歧化酶面膜 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因重组超氧化物歧化酶面膜，该面膜由基因重组超氧化物歧化酶冻干粉和溶媒组成，其中基因重组超氧化物歧化酶冻干粉是以毕赤酵母为宿主菌，通过大规模发酵、表达、纯化，将所得基因重组超氧化物歧化酶在无菌条件下溶于含甘露醇的磷酸盐缓冲液中并冻干制成，溶媒是将透明质酸钠、三甲基甘氨酸、乳酸钠、甘油、山梨醇、羟乙基纤维素、EDTA‑2Na溶于磷酸钠缓冲液中制成。本发明面膜使用时将基因重组超氧化物歧化酶冻干粉与溶媒混匀后浸湿面膜纸即可，使用方便，成本较低，能促进皮肤对营养的吸收，并能够更长时间的保持超氧化物歧化酶的活性，且具有抗氧化作用，从而起美白防晒、防止皮肤衰老、抗皱、抗炎的效果。
Description
技术领域
本发明属于日用化妆品技术领域，具体涉及一种面膜，特别是涉及一种基因重组超氧化物歧化酶面膜。
背景技术
面膜是一种特殊的美容化妆品，涂敷于面部皮肤形成一层薄膜，将皮肤与外界隔离开，面膜中的有效成分可渗入皮肤，起滋润皮肤、增加营养、促进皮肤技能和新陈代谢作用，从而使面部皮肤洁白、柔软、舒爽，保持青春活力。目前，市售的面膜制品按其形态分为膏状、液体状、啫胶和粉状。从组成成分看，中药面膜居多，而活性蛋白面膜较为少见。
超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase，SOD)是生物体防御氧化损伤的一种十分重要的生物酶。由于SOD具有清除体内氧自由基的能力，能较好地抵御氧自由基和基他氧化物自由基对细胞质膜的毒性，在机体保护方面起重要作用。国内外已用SOD治疗氧中毒、老年性白内障、糖尿病、心血管疾病、各种炎症等多种疾病；SOD还可作为辐射防护剂，用于辅助放疗与化疗以及肾、肝、心脏等器官的保护和移植，以降低大剂量辐射所引起的副作用。加入SOD的化妆品，在皮肤表层能抑制氧自由基的强氧化作用，有效的清除自由基，从而起美白防晒、防止皮肤衰老、祛斑、去粉刺、抗皱、抗炎的效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对目前市场上的面膜以中药面膜居多，活性蛋白面膜较少，且效果不理想的问题，提供了一种可美白防晒抗衰老的基因重组超氧化物歧化酶面膜。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：该面膜由基因重组超氧化物歧化酶冻干粉和溶媒组成，使用时将基因重组超氧化物歧化酶冻干粉完全溶解于溶媒后浸湿面膜纸即可。
上述的基因重组超氧化物歧化酶冻干粉是在无菌条件下将基因重组超氧化物歧化酶溶于含甘露醇的磷酸盐缓冲液中并冻干制备而成，基因重组超氧化物歧化酶与含甘露醇的磷酸盐缓冲液的质量-体积比为0.04g～0.06g:1mL，其中所述的基因重组超氧化物歧化酶的氨基酸序列为：ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。
上述的溶媒的组成是：每100mL溶媒包含0.02～0.06g分子量为120～150万道尔顿的透明质酸钠、0.035～0.05g分子量为20～40万道尔顿的透明质酸钠、0.1～0.3g羟乙基纤维素、0.4～0.6g三甲基甘氨酸、4～6mL乳酸钠、3～5mL甘油、2～4mL山梨醇、0.04～0.06gEDTA-2Na，其余为磷酸钠缓冲液。
本发明面膜使用时优选将基因重组超氧化物歧化酶与溶媒按质量-体积比为0.30g～0.45g:100mL混合均匀后浸湿面膜纸。
上述含甘露醇的磷酸盐缓冲液的pH值是6.5～7.2，其中磷酸盐的浓度是4.5～6.0mmol/L、甘露醇的浓度为2～5g/100mL，优选pH值是7.0、磷酸盐的浓度是5mmol/L、甘露醇的浓度为3g/100mL。
上述溶媒的组成进一步优选：每100mL溶媒包含0.04g分子量为120～150万道尔顿的透明质酸钠、0.045g分子量为20～40万道尔顿的透明质酸钠、0.18g羟乙基纤维素、0.5g三甲基甘氨酸、5mL乳酸钠、4mL甘油、3mL山梨醇、0.05g EDTA-2Na，其余为磷酸钠缓冲液，所述磷酸钠缓冲液的pH值是6.5～7.2、浓度是4.5～6.0mmol/L，优选磷酸钠缓冲液的pH值是7.0、浓度是5mmol/L。
本发明的基因重组超氧化物歧化酶面膜的制备方法为：
1、制备基因重组超氧化物歧化酶冻干粉
在无菌条件下，将基因重组超氧化物歧化酶完全溶解于含甘露醇的磷酸盐缓冲液中，采用孔径为0.22μm的水相过滤器过滤后灭菌、分装、冻干，得到基因重组超氧化物歧化酶冻干粉。
2、制备溶媒
将透明质酸钠、低分子透明质酸钠、羟乙基纤维素加入磷酸钠缓冲液中，在50～70℃搅拌均匀，向所得混合液中加入三甲基甘氨酸、乳酸钠、甘油、山梨醇、EDTA-2Na，搅拌均匀，分装后121℃灭菌30分钟，得到溶媒。
相对于现有技术，本发明基因重组超氧化物歧化酶面膜具有如下优点：
1、本发明采用生物工程技术改造毕赤酵母，通过大规模发酵、表达及纯化制备成基因重组超氧化物歧化酶，其纯度高、活性高、完全性好且成本较低。
2、本发明将基因重组超氧化物歧化酶制备成冻干粉，与溶媒分开保存，保证了基因重组超氧化物歧化酶的活性，克服了活性蛋白在水溶液中长时间保存易于降解失活的不足，且不含防腐剂。采用含甘露醇的磷酸盐缓冲液可以起到保护超氧化物歧化酶活性的作用，同时冻干后，可以使冻干粉中超氧化物歧化酶均匀分散，均一性高。
3、本发明采用的溶媒各组分之间具有协同效果，在溶解基因重组超氧化物歧化酶冻干粉时更有利于分散溶解，制成面膜之后，在使用时能促进皮肤对营养的吸收，并能够更长时间的保持超氧化物歧化酶的活性。
4、本发明采用的基因重组超氧化物歧化酶与人体内的超氧化物歧化酶是一致的，其生物同源性、生物相容性、生物安全性均较好，且具有抗氧化作用，在皮肤表层能抑制氧自由基的强氧化作用，有效的清除自由基，从而起防止皮肤衰老、抗皱、抗炎的效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
下面实施例中所用基因重组超氧化物歧化酶的制备方法为：根据毕赤酵母密码子偏好性，全基因合成超氧化物歧化酶融合蛋白并在其两端添加限制性内切酶酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ，其核苷酸序列为：CTCGAGAAAAGAGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGAAGGTGTGGGGAAGCATTAAAGGACTGACTGAAGGCCTGCATGGATTCCATGTTCATGAGTTTGGAGATAATACAGCAGGCTGTACCAGTGCAGGTCCTCACTTTAATCCTCTATCCAGAAAACACGGTGGGCCAAAGGATGAAGAGAGGCATGTTGGAGACTTGGGCAATGTGACTGCTGACAAAGATGGTGTGGCCGATGTGTCTATTGAAGATTCTGTGATCTCACTCTCAGGAGACCATTGCATCATTGGCCGCACACTGGTGGTCCATGAAAAAGCAGATGACTTGGGCAAAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGACAGGAAACGCTGGAAGTCGTTTGGCTTGTGGTGTAATTGGGATCGCCCAATAAGAATTC，命名为HE-SOD；对载体pPIC9K(载体购于美国Invitrogen公司)、HE-SOD进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接pPIC9K与HE-SOD，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-HE-SOD，经内切酶线性化，与制备好的毕赤酵母感受态细胞混匀，电击转化，经MD板筛选、G418板筛选，获得高表达阳性克隆，经过进一步摇瓶试验筛选出基因重组超氧化物歧化酶高表达菌株作为种子，经过大罐发酵生产，发酵液经分离纯化后得到有活性的基因重组超氧化物歧化酶，其氨基酸序列为：ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。
实施例1
1、制备基因重组超氧化物歧化酶冻干粉
将3g甘露醇加入100mL pH值是7.0、浓度是5mmol/L的磷酸盐缓冲液中，然后在无菌条件下，加入5g基因重组超氧化物歧化酶中，采用孔径为0.22μm的水相过滤器进行过滤，滤液在121℃下灭菌30分钟，然后分装到无菌的西林瓶中，每瓶1mL，整个操作过程在超净台中无菌完成，分装完毕后用冻干机依次在-40℃下预冻2h、-20℃冷冻干燥8h、-10℃冷冻干燥8h、0℃冷冻干燥8h，然后在10℃干燥8h、20℃干燥8h，得到基因重组超氧化物歧化酶冻干粉。
2、制备溶媒
将0.05g分子量为120万道尔顿的透明质酸钠、0.04g分子量为20万道尔顿的透明质酸钠、0.15g羟乙基纤维素加入100mL pH值是7.0、浓度是5mmol/L的磷酸钠缓冲液中，在60℃搅拌均匀，向所得混合液中加入0.45g三甲基甘氨酸、4.5mL乳酸钠、5mL甘油、3.5mL山梨醇、0.045g EDTA-2Na，搅拌均匀，分装后121℃灭菌30分钟，得到溶媒，分装于15mL西林瓶中，每瓶13.5mL，121℃灭菌30分钟。
使用时，取基因重组超氧化物酶冻干粉一支、溶媒一瓶，用注射器吸取溶媒加入冻干粉中，使冻干粉完全溶解，然后再用注射器全部吸出，注射到面膜纸上，浸湿面膜纸即可。
实施例2
1、制备基因重组超氧化物歧化酶冻干粉
将3g甘露醇加入100mL pH值是7.0、浓度是5mmol/L的磷酸盐缓冲液中，然后在无菌条件下，加入4g基因重组超氧化物歧化酶中，采用孔径为0.22μm的水相过滤器进行过滤，滤液在121℃下灭菌30分钟，然后分装到无菌的西林瓶中，每瓶1mL，整个操作过程在超净台中无菌完成，分装完毕后用冻干机依次在在-40℃下预冻2h、-20℃冷冻干燥8h、-10℃冷冻干燥8h、0℃冷冻干燥8h，然后在10℃干燥8h、20℃干燥8h，得到基因重组超氧化物歧化酶冻干粉。
2、制备溶媒
将0.04g分子量为130万道尔顿的透明质酸钠、0.045g分子量为20万道尔顿的透明质酸钠、0.18g羟乙基纤维素加入100mLpH值是7.0、浓度是5mmol/L的磷酸钠缓冲液中，在60℃搅拌均匀，向所得混合液中加入0.5g三甲基甘氨酸、5mL乳酸钠、4mL甘油、3mL山梨醇、0.05g EDTA-2Na，搅拌均匀，分装后121℃灭菌30分钟，得到溶媒，分装于15mL西林瓶中，每瓶13.5mL，121℃灭菌30分钟。
使用时，取基因重组超氧化物酶冻干粉一支、溶媒一瓶，用注射器吸取溶媒加入冻干粉中，使冻干粉完全溶解，然后再用注射器全部吸出，注射到面膜纸上，浸湿面膜纸即可。
核苷酸或氨基酸序列表
[0001]
序列表
<110> 陕西慧康生物科技有限责任公司
<120>一种基因重组超氧化物歧化酶面膜
<160> 2
<210> 1
<211> 480
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
CTCGAGAAAA GAGCGACGAA GGCCGTGTGC GTGCTGAAGG GCGACGGCCC 50
AGTGCAGGGC ATCATCAATT TCGAGCAGAA GGAAAGTAAT GGACCAGTGA 100
AGGTGTGGGG AAGCATTAAA GGACTGACTG AAGGCCTGCA TGGATTCCAT 150
GTTCATGAGT TTGGAGATAA TACAGCAGGC TGTACCAGTG CAGGTCCTCA 200
CTTTAATCCT CTATCCAGAA AACACGGTGG GCCAAAGGAT GAAGAGAGGC 250
ATGTTGGAGA CTTGGGCAAT GTGACTGCTG ACAAAGATGG TGTGGCCGAT 300
GTGTCTATTG AAGATTCTGT GATCTCACTC TCAGGAGACC ATTGCATCAT 350
TGGCCGCACA CTGGTGGTCC ATGAAAAAGC AGATGACTTG GGCAAAGGTG 400
GAAATGAAGA AAGTACAAAG ACAGGAAACG CTGGAAGTCG TTTGGCTTGT 450
GGTGTAATTG GGATCGCCCA ATAAGAATTC 480
<210> 2
<211> 153
<212> PRT
<213>人工序列
<400>2
Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln 15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys 30
Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe 45
His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala 60
Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys 75
Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp 90
Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser 105
Leu Ser Gly Asp His Cls Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His 120
Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr 135
Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly 150
Ile Ala Gln 153
Claims (7)
1.一种基因重组超氧化物歧化酶面膜，其特征在于：该面膜由基因重组超氧化物歧化酶冻干粉和溶媒组成，使用时将基因重组超氧化物歧化酶冻干粉完全溶解于溶媒后浸湿面膜纸即可；
上述的基因重组超氧化物歧化酶冻干粉是在无菌条件下将基因重组超氧化物歧化酶溶于含甘露醇的磷酸盐缓冲液中并冻干制备而成，基因重组超氧化物歧化酶与含甘露醇的磷酸盐缓冲液的质量-体积比为0.04g～0.06g:1mL，其中所述的基因重组超氧化物歧化酶的氨基酸序列为：ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ；
上述的溶媒的组成是：每100mL溶媒包含0.02～0.06g分子量为120～150万道尔顿的透明质酸钠、0.035～0.05g分子量为20～40万道尔顿的透明质酸钠、0.1～0.3g羟乙基纤维素、0.4～0.6g三甲基甘氨酸、4～6mL乳酸钠、3～5mL甘油、2～4mL山梨醇、0.04～0.06gEDTA-2Na，其余为磷酸钠缓冲液。
2.根据权利要求1所述的基因重组超氧化物歧化酶面膜，其特征在于：使用时将基因重组超氧化物歧化酶与溶媒按质量-体积比为0.30g～0.45g:100mL混合均匀后浸湿面膜纸。
3.根据权利要求1或2所述的基因重组超氧化物歧化酶面膜，其特征在于：所述含甘露醇的磷酸盐缓冲液的pH值是6.5～7.2，其中磷酸盐的浓度是4.5～6.0mmol/L、甘露醇的浓度为2～5g/100mL。
4.根据权利要求1或2所述的基因重组超氧化物歧化酶面膜，其特征在于：所述的含甘露醇的磷酸盐缓冲液的pH值是7.0，其中磷酸盐的浓度是5mmol/L、甘露醇的浓度为3g/100mL。
5.根据权利要求1所述的基因重组超氧化物歧化酶面膜，其特征在于：所述的溶媒的组成是：每100mL溶媒包含0.04g分子量为120～150万道尔顿的透明质酸钠、0.045g分子量为20～40万道尔顿的透明质酸钠、0.18g羟乙基纤维素、0.5g三甲基甘氨酸、5mL乳酸钠、4mL甘油、3mL山梨醇、0.05g EDTA-2Na，其余为磷酸钠缓冲液。
6.根据权利要求1或5所述的基因重组超氧化物歧化酶面膜，其特征在于：所述的磷酸钠缓冲液的pH值是6.5～7.2、浓度是4.5～6.0mmol/L。
7.根据权利要求1或5所述的基因重组超氧化物歧化酶面膜，其特征在于：所述的磷酸钠缓冲液的pH值是7.0、浓度是5mmol/L。
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