CN106615692A - 一种鲶鱼饲料复合酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鲶鱼饲料复合酶及其制备方法，以鲶鱼营养需求、水体环境为基础，结合其消化特性，优化原料配方，科学复配具有强大营养性、生物活性和抗氧化性等功能特性的酿酒酵母培养物；可有效补充钙、铁及可溶性纤维、具有强大包埋作用、延长饲料复合酶保质期的钙果提取物；可显著提高饲料复合酶抗冻效果和稳定性，提高鲶鱼饲料耐水性和光泽性，降低饲料含粉率的蒿草籽粉；可大幅提高饲料适口性和消化率的适口剂；可提供丰富营养物质、生物活性物质和植物酶源的小麦芽粉；最终提供一种可显著提高鲶鱼消化率和生产性能、降低饲料系数，防止水体污染、维持优良水质的鲶鱼饲料复合酶。

Description

一种鲶鱼饲料复合酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及饲料复合酶，具体涉及一种鲶鱼饲料复合酶及其制备方法。

背景技术

鲶鱼是动物食性鱼类，是淡水鱼中的优良品种，其营养丰富，每100克鱼肉中含水分64.1克、蛋白质14.4克，并含有多种矿物质和微量元素，特别适合体弱虚损、营养不良之人食用。除鲶鱼的鱼子有杂味不宜食用以外，全身是宝，鲶鱼是名贵的营养佳品，早在史书中就有记载，可以和鱼翅、野生甲鱼相媲美，为鱼中珍品。它的食疗作用和药用价值是其它鱼类所不具备的，强精壮骨和益寿作用是它独具的特点。同时鲶鱼是催乳的佳品，其味甘性温，并有滋阴养血、补中气、开胃、利尿的作用，适合一般人食用，尤其以老、幼、妇女产后及消化功能不佳的人最为适用，具有广阔的市场前景和发展潜力，成为近几年养殖户关注的热点。

鲶鱼和其它鱼类一样，鲶鱼作为一种动物食性鱼种，不需要维持恒定的体温，生长所需能量低，可摄食天然饵料，通过鳃、皮肤吸收无机盐，并不费力地排除废物，导致人工饲料相对节省矿物质；鲶鱼消化器官分化简单且短，消化道与体长之比要比陆生动物小许多，消化腺不发达能力差，不能分泌纤维素酶，基本不能消化粗纤维；蛋白酶、淀粉酶分泌不足，对蛋白质、碳水化合物利用能力差；虽然对脂肪利用能力强，但主要需要不饱和脂肪酸；对蛋白质要求高，钙磷比例1:1-1.5,维生素(B族维生素尤其B₁，B₂、维生素C，维生素A)需要量大等等，相对于畜禽饲料复合酶的复配比较复杂。

在鲶鱼饲料中添加功能性饲料复合酶可：1)降解在鲶鱼饲料中存在的抗营养因子。这些物质不能被鲶鱼内源酶降解，从而干扰鲶鱼的正常代谢，导致鲶鱼消化不良，生产性能下降。2)提高淀粉、蛋白质和矿物质的利用率。这些物质或者被富含纤维的细胞壁包围，或者以某些不能被鲶鱼消化的结构形式存在(例如在植物饲料原料中，大量的磷以植酸磷的形式存在)。3)在原料中降解某些特定的化学键。这些化学键不能被鲶鱼自身的酶所降解，加入外源酶以后可以释放更多的营养物。4)由于幼龄鲶鱼自身消化系统还不成熟，内源酶不足添加外源酶可以提高饲料消化率，防止出现消化不良症状。除了可以提高日粮的利用率以外，加酶还可以减少饲料原料之间的差异，提高饲料配方的精确性，同时还可以提高鲶鱼生长的整齐性，减少管理成本，提高经济效益。使用酶制剂还可以保护环境。由于饲料的利用率提高了，相应的粪便排放量下降了。在效果比较明显的情况下，粪便的排放量可以减少20％左右。对于植酸磷，可以大幅度减少磷对水体环境的污染。

中国专利CN 106071399 A公开了一种鲶鱼饲料，包括：大豆粉、黄豆粉、黑豆粉、小麦粉、小米粉、黄米粉、江米粉、玉米粉、米糠粉、燕麦粉、芝麻粉、亚麻仁粉、蛋壳、蟹壳、鸡胸肉、葵花籽、油菜籽、鱼油、胡萝卜、复合微量元素、柠檬酸、乳酸、牡蛎粉、鱼粉、谷胱甘肽、磷脂、维生素C、维生素E、维生素A、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌、乙酸、DHA、植物酶和褐藻胶。该发明公开的鱼饲料营养丰富，富含多种氨基酸、蛋白质和微量元素，同时富含多种有机酸和酶，不仅提高了鱼的成活率，而且能有效改善的鱼的肉质。

中国专利CN 103202408 B公开了一种环保营养型鮻鱼复合饲料，旨在提供一种提高鮻鱼的生长性能和饲料利用率，降低养殖废弃物对养殖环境的污染的复合饲料；其技术方案是：该饲料由下述组分构成：鱼粉3～10％、大豆粕10～25％、棉仁粕5～15％、菜粕5～15％、面粉15～25％、啤酒酵母5～15％、乌贼膏1～5％、干白酒糟10～25％、洗米糠5～15％、大豆磷脂油2～10％、诱食剂0.4～1％、复合维生素0.2～0.5％、复合矿物质1～3％、磷酸二氢钙1～3％、食盐0.05～0.15％、防霉剂0.02～0.06％、氯化胆碱0.1～0.5％、维生素C醋酸酯0.2～0.5％、β-葡聚糖0.01～0.05％、维生素E 0.01～0.05％、耐高温植酸酶0.01～0.05％；属于鱼饲料技术领域。

中国专利CN 104543450 A公开了一种发酵鲶鱼饲料，由下列重量份的原料制成：黄豆面80-90、葵花粕20-25、玉米蛋白粉6-8、红枣粉10-14、牡蛎肉10-15、鱿鱼片5-10、豆腐乳13-17、桃仁5-7、玉米茎叶10-12、柠檬13-16、人参花1-2、棕榈叶2-3、韭菜花2-3、蛋黄粉7-9、黄油3-4、酵母菌2-3、诱食剂3-4、水适量；该发明的发酵鲶鱼饲料，添加的牡蛎肉、鱿鱼片富含蛋白质、钙等多种矿物质等多种营养成分。添加的柠檬可以起到抗菌、清热、促食欲的作用。制得的鲶鱼饲料富含鲶鱼所需各种蛋白质、脂肪、维生素和矿物质，配比合适，加快鲶鱼的生长，提高机体免疫力以及组织代谢能力。

上述公开的鱼饲料中添加的酶制剂为单酶，并复配了酿酒酵母，但消化率和饲料利用率仍不很理想。

中国专利CN 105581024 A公开了一种鱼饲料，包括下述重量份数的原料组成的：麦麸100-200、豆粕50-100、玉米淀粉10-50、酵母3-6、海藻粉20-30、复合维生素1-5、矿物元素1-5、复合酶制剂1-3；各成分功能互补，协同配合，可满足鱼苗饲养和生长的营养需求，其中，利用麦麸和豆粕作为主要原料，成本较低，并利用海藻粉提高饲料蛋白含量，可海藻粉内富集微量元素，与复合维生素、矿物元素、复合酶制剂协同作用，可补充更多蛋白质，提高鱼肉品质，提高机质和机体的免疫力，预防疾病的发生，提高鱼的生长速度，降低饲养成本，所述复合酶制剂为木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶，按比例1:1:1:1制成。

上述公开的鱼饲料中添加的复合酶单酶种类不全面，且酵母菌功能性差，分泌的酶系单一，饲料消化利用率仍不理想。

因此，结合鲶鱼消化特性、营养需求和水体环境等因素，制备一种饲料系数低、消化率高、生产性能好的鲶鱼饲料复合酶势在必行。

发明内容

本发明所解决的技术问题是克服现有鲶鱼饲料复合酶的缺陷，以鲶鱼营养需求、水体环境为基础，结合其消化特性，优化原料配方，科学复配具有强大营养性、生物活性和抗氧化性等功能特性的酿酒酵母培养物；可有效补充钙、铁及可溶性纤维、具有强大包埋作用、延长饲料复合酶保质期的钙果提取物；可显著提高饲料复合酶抗冻效果和稳定性，提高鲶鱼饲料耐水性和光泽性，降低饲料含粉率的蒿草籽粉；可大幅提高饲料适口性和消化率的适口剂；可提供丰富营养物质、生物活性物质和植物酶源的小麦芽粉；最终提供一种可有效降解鲶鱼饲料中的抗营养因子，促进淀粉、蛋白质和矿物质等营养物质的利用率，提高鲶鱼的蛋白质水平、机体抗氧化活性和消化吸收率，显著提高鲶鱼消化率和生产性能、降低饲料系数，防止水体污染、维持优良水质的鲶鱼饲料复合酶。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鲶鱼饲料复合酶，主要由以下重量份数的原料制备：

酵母培养物20-40份，钙果提取物15-30份，小麦芽粉10-20份，酸性木聚糖酶10-20份，酸性蛋白酶10-20份，植酸酶10-20份，β-葡聚糖酶6-10份，纤维素酶5-9份，淀粉酶5-9份，β-甘露聚糖酶3-7份，果胶酶3-7份，脂肪酶2-6份，磷酸酯酶2-6份，适口剂1-5份，蒿草籽粉1-3份；

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷酸酯酶均为食品级酶制剂；

进一步地，所述酵母培养物是以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)tlj2016为出发菌经逐级扩培、发酵而制备；

优选地，所述酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：取1环活化后的酿酒酵母tlj2016斜面菌种，接种至装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，在28～30℃、摇床转速150～200r/min条件下培养25～30h，得到一级种子液；将一级种子液按5～10％(v/v)的接种量，接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中进行发酵培养，发酵时间25～30h，温度28～30℃，摇床转速150～200r/min，得到二级种子液；将二级种子液以5～10％(v/v)接种量接入到装3L发酵培养基的5L发酵罐恒温发酵，温度28～30℃，通风量4～6L/min，转速150～200r/min，发酵全程调节发酵液pH值为6.0～6.5，当发酵至25～30h时，以每升发酵液25～30mmol的添加量向发酵液中一次性添加L-半胱氨酸，继续发酵20-30h得到最终发酵液；最终发酵液减压浓缩至固形物含量为18-26％，冷冻干燥即得酵母培养物；

所述最终发酵液中GSH终浓度达到3268-3308mg/L；

所述酵母培养物中活菌含量为：7×10¹²-9×10¹²cfu/g；

所述种子培养基的质量组成为：(NH₄)₂SO₄ 6g/L，葡萄糖35g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，酵母粉11g/L，MnSO₄ 0.1g/L，KCL 0.1g/L，FeSO₄ 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，余量为水，pH 6.0；

所述发酵培养基的质量组成为：(NH₄)₂SO₄ 10g/L，糖蜜150g/L，K₂HPO₄·3H₂O 8g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，酵母粉5g/L，玉米浆10g/L，MnSO₄ 0.1g/L，KCL 0.1g/L，FeSO₄ 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L,余量为水，pH 6.0。

所述酿酒酵母具体为酿酒酵母tlj2016，该菌株已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12789，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；

所述酿酒酵母tlj2016具有以下特性：1)对葡萄糖的耐受能力达到300g/L，利于其在高浓度葡萄糖条件下生产GSH；2)在5L发酵罐中发酵生产GSH终浓度达到3308mg/L；3)耐受L-半胱氨酸的能力特强，在5mmol/L L-半胱氨酸作用下仍能缓慢生长，在40mmol/L L-半胱氨酸作用下仍能保持GSH大量合成；4)耐盐能力达到18％，有利于扩展其应用领域。

进一步地，所述钙果提取物是以钙、铁和膳食纤维含量较高的钙果茎、钙果叶和菊粉为原料，经超声清洗、生物酶酶解、微波干燥、挤压膨化、超微粉碎而制得；其可溶性纤维素含量高、生物活性强、对鲶鱼体内益生菌群有重要的、积极作用的纤维，特别是可补充钙铁、延长饲料的保质期，与普通膳食纤维相比，其功能性、生物活性更强大；

优选地，所述钙果提取物的制备方法，包括如下步骤：将钙果茎、钙果叶和菊粉按质量比5-9:3-6:1-3均匀混合，置于超声波清洗机中于200W、30KHz清洗3-5min，沥干，破碎至粒径0.3-0.7mm，加入破碎物质量0.5-1.5倍的水，调节pH值为5-7，加入混合物质量0.1-0.3％的生物酶，于50-60℃酶解10-15min；酶解液减压浓缩至固形物含量为40-60％，放入微波干燥机于2000W、130-150℃进行间歇式干燥，使之水分达到4-6％，然后粉碎至粒径0.4-0.6mm，加入粉碎物质量0.2-0.4％的碳酸氢钠，均匀混合，调整混合物水分含量为12-14％，室温、密封静置2-4h，于螺杆转速105-115r/min、温度140-160℃条件挤压膨化，然后超微粉碎至粒径0.1-0.3mm即得钙果提取物；

所述生物酶为纤维素酶、漆酶、葡聚糖酶、甘露糖酶、果胶酶按质量比2-4:1-3:1-3:0.5-1.5:0.4-1均匀混合。

进一步地，所述小麦芽粉的制备方法，包括如下步骤：将小麦放在温度为10-18℃、pH值为6-8的浸泡液中浸泡20-40min,浸泡液含有质量百分比浓度为0.1-0.3％的碳酸氢钠和0.2-0.4％的复配酶，然后以3-5℃/min的速率升温至28-32℃，继续浸泡3-5h,最后以5-7℃/min的速率升温至50-60℃浸泡5-8min,整个浸泡过程每隔15-20min通风一次，通风压力0.13-0.15MPa，同时于电场强度3-5kV/cm，脉冲时间100-300μs,脉冲频率60-80Hz条件进行高压脉冲电场处理，直至小麦水分含量为40-45％；浸泡后的小麦沥干，在发芽室内进行暗发芽，暗发芽温度保持20-24℃，暗发芽时间为20-24h，经发芽后的小麦干燥至水分含量为5-8％，低温粉碎，过60-80目筛即得小麦芽粉；

所述复配酶为纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶按质量比2-4:2-4:1-3:1-2均匀混合。

进一步地，所述适口剂是科学复配羊血和蚯蚓，经高压脉冲电场、复合酶分段酶解、超滤、分段反应、冷冻干燥等低温加工技术而制备的兼有羊血和蚯蚓风味的复合风味呈味肽，不仅可大大提高鲶鱼饲料的适口性,提高饲料利用率，而且具有较强抗氧化效果，消除自由基；

优选地，所述适口剂的制备方法，包括如下步骤：按质量比1-3:2-8称取新鲜羊血和蚯蚓，混匀、绞碎得混合料，加入其质量2-5倍的离子溶液，混匀，调节pH值为6-8，于室温下在电场强度25-35kV/cm，脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理20-30min；然后加入混合料质量0.04-0.08％的复合酶，于50-60℃酶解30-50min，然后降温至35-45℃酶解40-60min，90℃灭酶10min，降至室温，除菌过滤得酶解液，酶解液通过1000Da和5000Da的超滤膜过滤，取两膜之间的透过液，减压浓缩至固形物含量为18-22％得酶解浓缩液；加入酶解浓缩液质量5-7％的还原糖，依次于112-118℃反应30-50min和135-145℃反应45-65min后；将反应液通过1000Da和5000Da的超滤膜过滤，取两膜之间的透过液，减压浓缩至固形物含量为26-30％得反应浓缩液；向反应浓缩液中加入其质量0.2-0.4％的丝胶肽，混匀，冷冻干燥即得适口剂。

优选地，所述离子溶液为含有钠离子17-22mg/L、锌离子15-20mg/L、钾离子12-14mg/L、钙离子9-11mg/L和镁离子6-10mg/L的水溶液；

优选地，所述复合酶为蚯蚓丝氨酸蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、脂肪酶按质量比4-6:2-4:0.2-0.4:0.1-0.3均匀混合；

优选地，所述还原糖为木糖、核糖、葡萄糖、果糖、半乳糖中的一种或几种；

更优选地，所述还原糖的质量组成为：木糖:核糖:葡萄糖:果糖:半乳糖＝3-5:2-4:1-3:1-3:1-2。

进一步地，所述蒿草籽粉是以蒿草籽为原料，经高压静电、高压脉冲电场辅助水杨酸浸泡、冷藏冷冻处理后粉碎、冻干而制得；

优选地，所述蒿草籽粉的制备方法，包括如下步骤：将蒿草籽装盘，首先于电场强度1-3kV/cm高压静电处理5-7min；接着在浓度为3-5mg/L的水杨酸溶液中室温浸泡2-5h，同时在电场强度2-6kV/cm，脉冲时间50-100μs,脉冲频率100-150Hz条件下进行高压脉冲电场处理；漂洗、沥干，于3-5℃静置18-24h,然后依次在1-3℃冷藏2-4d,-3--5℃冷冻1-3d、-15--18℃冷冻10-15h,立即放在室外自然光照2-4h后立即进行粉碎，冻干，加入冻干粉质量3-8％的小苏打，均匀混合，过80-100目筛即得蒿草籽粉。

本发明另一目的是提供上述鲶鱼饲料复合酶的制备方法：包括如下步骤：按照配方，首先依次将蒿草籽粉、适口剂、磷酸酯酶、脂肪酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麦芽粉、酵母培养物、钙果提取物质量的10-30％加入V型混合罐均匀混合15-25min,搅拌转速20-40r/min,然后加入剩余钙果提取物均匀混合20-40min,搅拌转速40-60r/min,无菌灌装、密封、包装即得鲶鱼饲料复合酶。

有益效果：

本发明鲶鱼饲料复合酶以鲶鱼营养需求、水体环境为基础，结合其消化特性，优化原料配方，科学复配具有强大营养性、生物活性和抗氧化性等功能特性的酿酒酵母培养物；可有效补充钙、铁及可溶性纤维、具有强大包埋作用、延长饲料复合酶保质期的钙果提取物；可显著提高饲料复合酶抗冻效果和稳定性，提高鲶鱼饲料耐水性和光泽性，降低饲料含粉率的蒿草籽粉；可大幅提高饲料适口性和消化率的适口剂；可提供丰富营养物质、生物活性物质和植物酶源的小麦芽粉；最终提供一种可有效降解鲶鱼饲料中的抗营养因子，促进淀粉、蛋白质和矿物质等营养物质的利用率，提高鲶鱼的蛋白质水平、机体抗氧化活性和消化吸收率，显著提高鲶鱼消化率和生产性能、降低饲料系数，防止水体污染、维持优良水质的饲料复合酶。1)饲喂试验表明：以同样的饲喂及驯化方法，同样的日常管理，同样的鱼塘条件和同样的土鲶鱼鱼种及投放量等情况下饲喂鲶鱼，以相同的添加量添加本发明制备的鲶鱼饲料复合酶的饲料适口性强，成鱼规格差距小，整齐，进而鲶鱼撕咬、竞争觅食情况轻微，死亡率低仅为3％，比对照组市售饲料复合酶降低75％；抗病性强，发病率仅为3％，比对照组市售饲料复合酶降低66.67％；消化率高，尾均增重强，比对照组市售饲料复合酶提高55.74％；饲料系数低，料肉比低，比对照组市售饲料复合酶降低36.09％；养殖效益显著，同样投放量情况下产量提高59.58％，大大降低了养殖成本，具有较好的实用性和先进性。2)稳定性试验表明：在-12℃和40℃条件下储存12个月，本发明鲶鱼饲料复合酶与市售饲料复合酶相比，其蛋白酶酶活损失分别降低43％和18.9％，具有优良的温度储存性，酶活力非常稳定，同时也说明本发明鲶鱼饲料复合酶中含有的其它生物活性物质的损失率极低，具有较好的抗冻、抗热性能，产品质量稳定，保质期长。具体技术效果见实施例7-11；具体技术原理如下：

1.本发明酿酒酵母培养物中的活菌含量高达7×10¹²-9×10¹²cfu/g，最终发酵液中GSH终浓度达到3268-3308mg/L，不仅提高了鲶鱼饲料的蛋白质水平和酶活性，而且提高了鲶鱼饲料的生物活性和抗氧化性，极大地显现了饲料复合酶的功能特性，酿酒酵母tlj2016除具备普通酵母的益生性外还具有以下功能特性：1)对葡萄糖的耐受能力达到300g/L，利于其在高浓度葡萄糖条件下生产GSH；2)在5L发酵罐中发酵生产GSH终浓度达到3308mg/L；3)耐受L-半胱氨酸的能力特强，在5mmol/L L-半胱氨酸作用下仍能缓慢生长，在40mmol/L L-半胱氨酸作用下仍能保持GSH大量合成；4)耐盐能力达到18％；将其科学复配于鲶鱼饲料中可进一步：(1)清除自由基、过氧化物、重金属及黄曲霉毒素等毒物；(2)参与氨基酸(谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中性氨基酸)的转运；(3)利于铁的吸收、硒的吸收、钙的吸收，谷胱甘肽还可以使饲料中的过氧化脂肪酸在吸收时或吸收后恢复为正常的脂肪；(4)保护胃肠道黏膜上皮，防止因炎症、局部缺血、氧化物质等对肠黏膜的损伤；(5)贮存并提供其组成氨基酸(尤其是半胱氨酸)；(6)参与蛋白质和DNA的合成；(7)作为还原物质，利于维生素E、维生素C的还原，维持巯基酶活性。

2.本发明制备的蒿草籽粉在提供丰富营养物质的同时具有较强的粘结性，非常适合制备鲶鱼颗粒饲料，将其加入鲶鱼饲料中可大大提高颗粒饲料的成粒性和完整性，制备的鲶鱼饲料耐水性好，光泽性强，含粉率低，饲料利用率高；同时蒿草耐寒性强，(蒿草籽)蒿草种子富含抗冻蛋白，经高压静电处理、高压脉冲电场辅助水杨酸诱导、低温分段胁迫处理和自然光照有机结合，使得本身含有抗冻基质的活性种子在外界环境的胁迫和诱导下，抗冻基质成分得到了最全面、最丰富的合成和积累，提高了抗冻蛋白的含量，进而提高了饲料复合酶的抗冻效果和稳定性，延长了饲料复合酶的保质期。与钙果提取物、适口剂等其它原料科学复配，效果更佳。

3.本发明制备的钙果提取物是以含钙、铁和膳食纤维含量较高的钙果茎、钙果叶和菊粉为原料，经超声清洗、生物酶酶解、微波干燥、挤压膨化、超微粉碎而制得；其可溶性纤维素含量高、生物活性强、对鲶鱼体内益生菌群有重要的、积极作用的纤维，特别是可补充钙铁、延长饲料的保质期，与普通膳食纤维相比，其功能性、生物活性更强大；同时经超微粉碎后，加入一定量的碳酸氢钠，经调整水分后密封静置，可显著增强膳食纤维的膨化度和可溶性膳食纤维的含量，提高了膳食纤维的功能性，所得钙果提取物增稠性更强，比单一方法制备的改性膳食纤维提高40-50％，且不受酸、碱、盐的影响，显著提高了饲料的耐水性；可溶性纤维素含量高，比单一方法制备的改性膳食纤维提高20-40％，更容易被乳酸菌利用，提高乳酸菌在动物体肠道的生长及繁殖能力，增加益生菌菌群的种类和数量，降低动物体肠道pH值，改善动物体肠道微生态环境；吸附能力强，经改性后，纤维素的比表面积增大，网格结构丰富，吸附力增强，螯合、吸附胆固醇和胆汁酸类的有机分子能力更强、抑制动物体对他们的吸收；离子交换能力增强，对金属元素，特别是重金属元素吸附效果更强，有效防止了动物体重金属中毒；调节和维持肠道菌群的定植时间，增强肠道的消化和吸收能力，提高机体免疫力；有效促进胃肠蠕动，减缓并消除胃胀、腹胀等不良反应；强大的包埋作用可防止环境(氧气、温度、光照、水分活度等)因素对饲料复合酶质量的影响，进一步稳定了饲料复合酶的生物活性和稳定性，延长了饲料复合酶的保质期。

4.本发明制备的适口剂是科学复配羊血和蚯蚓，经高压脉冲电场、复合酶分段酶解、超滤、分段反应、冷冻干燥等低温加工技术而制备的兼有羊血和蚯蚓风味的复合风味呈味肽，呈味物质丰富，特别适合鲶鱼口味，不仅可以改善鲶鱼饲料的适口性，而且还可以全面促进鲶鱼饲料营养成分的消化和吸收，提高饲料利用率，从而大大减少排泄物中的有机物、氮磷等营养物质的排出量，减少饲料中未消化物质对水环境的污染。全程采用低温加工技术，避免了因高温而造成的蛋白变性和其它生物活性物质及香味物质损失，采用高压脉冲电场技术，不仅可防止提取过程杂菌污染，而且大大疏松了羊血和蚯蚓蛋白及组织间的结构，增加了组织的通透性，有利于后续复合酶的渗入和接触，提高了酶解效率和风味肽的收得率，同时也可直接增加可溶性风味肽的溶出，相对于现有高温预处理更高效、更环保；采用分段酶解和分段美拉德反应，进一步提高了复合风味适口剂的收率；离子溶液和复合酶的科学复配进一步提高了复合酶的活性，提高了酶解效率，降低了酶制剂的使用量，最大限度地提高了复合风味肽的获取；采用冷冻干燥，特别向反应液科学复配了具有优良抗冻效果的丝胶肽，大大减少了适口剂的氧化损失和冷冻损失，提高了适口剂的抗氧化性，最终制得一种不仅可大大提高鲶鱼饲料的适口性,提高饲料利用率，而且具有较强抗氧化效果，消除自由基的适口剂。

5.本发明制备的小麦芽粉对浸泡过程的小麦进行高压脉冲电场处理有效防止了浸泡液污染杂菌，避免了产生臭味渗透到小麦芽粉产品中，同时，可有效增强谷物种皮细胞壁和细胞膜的相对透性、提高全谷物种子的吸水率，促进种子提前萌发，提高超氧阴离子自由基的产生速率及三磷酸腺苷(ATP)含量，促进发芽前期小麦种子多种生物酶的激活和释放、胚乳溶解及功能性营养成分、生物活性成分、抗氧化成分的合成，促进了种子的呼吸代谢作用，加快了营养及功能性物质、生物活性成分、抗氧化成分的富集进程，缩短了富集时间，提高了营养及功能性物质、生物活性成分、抗氧化成分的含量，与分段浸泡、急速升温、生物酶解工艺有机结合，可进一步降解种皮纤维素及半纤维素结构，增加种皮通透性，激活各种生物活性物质(内源酶等)活力最强，富集量更大，可溶性纤维素含量随之增大，为小麦芽粉中的鲶鱼饲料提供了营养因子，效果更佳显著；将分段浸泡、高压脉冲电场技术和生物酶解有机结合，缩短了浸泡时间，提高了发芽率和发芽均一度；可最大限度保持小麦芽粉热敏性物质含量，尤其是抗氧化物质(谷胱甘肽、六磷酸肌醇、维生素C、多酚等)，最大限度地保证小麦芽粉的天然色泽、口感和风味，同时还可起到杀菌作用；特别是经高温短时适度杀胚后，在不影响小麦芽种子的生物活性的情况下，随着水分的吸收，小麦芽胚被抑制但不影响各项酶及生物活性物质的增长和胚乳的溶解，芽生长很短，呼吸作用弱，发芽损失低，提高了小麦芽粉的产量和质量，显著提高了饲料复合酶的功能特性、消化特性和适口性。

6.本发明鲶鱼饲料复合酶的制备方法工艺简单，对设备要求低，将具有强大包埋作用的钙果提取物分两次添加、混合，可将其它酶制剂及生物活性物质完全包埋其中，最大限度地降低了饲料复合酶在鲶鱼饲料制粒、贮藏过程中的损失，提高了饲料复合酶的生物活性和质量稳定性，有效延长了饲料复合酶的保质期。

需要说明的是本发明鲶鱼饲料复合酶及其制备方法的技术效果是各组分技术特征和方法特征相互协同、相互作用的结果，并非简单的技术特征(组分功能)的叠加，各组分技术特征的有机结合和协同产生的效果远远超过各单一技术特征功能和效果的叠加，具有较好的先进性和实用性。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1原料制备

1.酵母培养物的制备

所述酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：取1环活化后的酿酒酵母tlj2016斜面菌种，接种至装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，在30℃、摇床转速150r/min条件下培养28h，得到一级种子液；将一级种子液按8％(v/v)的接种量，接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中进行发酵培养，发酵时间28h，温度30℃，摇床转速180r/min，得到二级种子液；将二级种子液以8％(v/v)接种量接入到装3L发酵培养基的5L发酵罐恒温发酵，温度30℃，通风量5L/min，转速200r/min，发酵全程调节发酵液pH值为6.0～6.5，当发酵至30h时，以每升发酵液28mmol的添加量向发酵液中一次性添加L-半胱氨酸，继续发酵25h得到最终发酵液；最终发酵液减压浓缩至固形物含量为22％，冷冻干燥即得酵母培养物；

所述最终发酵液中GSH终浓度达到3308mg/L；

所述酵母培养物中活菌含量为：9×10¹²cfu/g；

所述种子培养基的质量组成为：(NH₄)₂SO₄ 6g/L，葡萄糖35g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，酵母粉11g/L，MnSO₄ 0.1g/L，KCL 0.1g/L，FeSO₄ 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，余量为水，pH 6.0；

所述发酵培养基的质量组成为：(NH₄)₂SO₄ 10g/L，糖蜜150g/L，K₂HPO₄·3H₂O 8g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，酵母粉5g/L，玉米浆10g/L，MnSO₄ 0.1g/L，KCL 0.1g/L，FeSO₄ 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L,余量为水，pH 6.0。

2.小麦芽粉的制备

所述小麦芽粉的制备方法，包括如下步骤：将小麦放在温度为15℃、pH值为7的浸泡液中浸泡30min,浸泡液含有质量百分比浓度为0.2％的碳酸氢钠和0.3％的复配酶，然后以4℃/min的速率升温至30℃，继续浸泡4h,最后以6℃/min的速率升温至55℃浸泡7min,整个浸泡过程每隔18min通风一次，通风压力0.14MPa，同时于电场强度4kV/cm，脉冲时间200μs,脉冲频率70Hz条件进行高压脉冲电场处理，直至小麦水分含量为42％；浸泡后的小麦沥干，在发芽室内进行暗发芽，暗发芽温度保持22℃，暗发芽时间为22h，经发芽后的小麦干燥至水分含量为6％，低温粉碎，过80目筛即得小麦芽粉；

所述复配酶为纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶按质量比3:3:2:1.5均匀混合。

3.钙果提取物的制备

所述钙果提取物的制备方法，包括如下步骤：将钙果茎、钙果叶和菊粉按质量比7:5:2均匀混合，置于超声波清洗机中于200W、30KHz清洗4min，沥干，破碎至粒径0.5mm，加入破碎物质量1倍的水，调节pH值为6，加入混合物质量0.2％的生物酶，于55℃酶解12min；酶解液减压浓缩至固形物含量为50％，放入微波干燥机于2000W、140℃进行间歇式干燥，使之水分达到5％，然后粉碎至粒径0.5mm，加入粉碎物质量0.3％的碳酸氢钠，均匀混合，调整混合物水分含量为13％，室温、密封静置3h，于螺杆转速110r/min、温度150℃条件挤压膨化，然后超微粉碎至粒径0.2mm即得钙果提取物；

所述生物酶为纤维素酶、漆酶、葡聚糖酶、甘露糖酶、果胶酶按质量比3:2:2:1:0.7均匀混合。

4.适口剂的制备

所述适口剂的制备方法，包括如下步骤：按质量比2:5称取新鲜羊血和蚯蚓，混匀、绞碎得混合料，加入其质量4倍的离子溶液，混匀，调节pH值为7，于室温下在电场强度30kV/cm，脉冲时间400μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场处理25min；然后加入混合料质量0.06％的复合酶，于55℃酶解40min，然后降温至40℃酶解50min，90℃灭酶10min，降至室温，除菌过滤得酶解液，酶解液通过1000Da和5000Da的超滤膜过滤，取两膜之间的透过液，减压浓缩至固形物含量为20％得酶解浓缩液；加入酶解浓缩液质量6％的还原糖，依次于115℃反应40min和140℃反应55min后；将反应液通过1000Da和5000Da的超滤膜过滤，取两膜之间的透过液，减压浓缩至固形物含量为28％得反应浓缩液；向反应浓缩液中加入其质量0.3％的丝胶肽，混匀，冷冻干燥即得适口剂。

所述离子溶液为含有钠离子20mg/L、锌离子18mg/L、钾离子13mg/L、钙离子10mg/L和镁离子8mg/L的水溶液；

所述复合酶为蚯蚓丝氨酸蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、脂肪酶按质量比5:3:0.3:0.2均匀混合；

所述还原糖的质量组成为：木糖:核糖:葡萄糖:果糖:半乳糖＝4:3:2:2:1.5。

5.蒿草籽粉的制备

所述蒿草籽粉的制备方法，包括如下步骤：将蒿草籽装盘，首先于电场强度2kV/cm高压静电处理6min；接着在浓度为4mg/L的水杨酸溶液中室温浸泡4h，同时在电场强度4kV/cm，脉冲时间80μs,脉冲频率120Hz条件下进行高压脉冲电场处理；漂洗、沥干，于4℃静置21h,然后依次在2℃冷藏3d,-4℃冷冻2d、-16℃冷冻12h,立即放在室外自然光照3h后立即进行粉碎，冻干，加入冻干粉质量5％的小苏打，均匀混合，过80目筛即得蒿草籽粉。

以下实施例2-6所使用的酵母培养物、小麦芽粉、钙果提取物、适口剂、蒿草籽粉均为实施例1制备，其它原料均为市购。

实施例2

一种鲶鱼饲料复合酶，主要由以下重量份数的原料制备：

酵母培养物30份，钙果提取物22份，小麦芽粉15份，酸性木聚糖酶15份，酸性蛋白酶15份，植酸酶15份，β-葡聚糖酶8份，纤维素酶7份，淀粉酶7份，β-甘露聚糖酶5份，果胶酶5份，脂肪酶4份，磷酸酯酶4份，适口剂3份，蒿草籽粉2份；

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷酸酯酶均为食品级酶制剂；

制备方法：包括如下步骤：按照配方，首先依次将蒿草籽粉、适口剂、磷酸酯酶、脂肪酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麦芽粉、酵母培养物、钙果提取物质量的20％加入V型混合罐均匀混合20min,搅拌转速30r/min,然后加入剩余钙果提取物均匀混合30min,搅拌转速50r/min,无菌灌装、密封、包装即得鲶鱼饲料复合酶。

实施例3

一种鲶鱼饲料复合酶，主要由以下重量份数的原料制备：

酵母培养物20份，钙果提取物15份，小麦芽粉10份，酸性木聚糖酶10份，酸性蛋白酶10份，植酸酶10份，β-葡聚糖酶6份，纤维素酶5份，淀粉酶5份，β-甘露聚糖酶3份，果胶酶3份，脂肪酶2份，磷酸酯酶2份，适口剂1份，蒿草籽粉1份；

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷酸酯酶均为食品级酶制剂；

制备方法：包括如下步骤：按照配方，首先依次将蒿草籽粉、适口剂、磷酸酯酶、脂肪酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麦芽粉、酵母培养物、钙果提取物质量的10％加入V型混合罐均匀混合15min,搅拌转速20r/min,然后加入剩余钙果提取物均匀混合20min,搅拌转速40r/min,无菌灌装、密封、包装即得鲶鱼饲料复合酶。

实施例4

一种鲶鱼饲料复合酶，主要由以下重量份数的原料制备：

酵母培养物40份，钙果提取物30份，小麦芽粉20份，酸性木聚糖酶20份，酸性蛋白酶20份，植酸酶20份，β-葡聚糖酶10份，纤维素酶9份，淀粉酶9份，β-甘露聚糖酶7份，果胶酶7份，脂肪酶6份，磷酸酯酶6份，适口剂5份，蒿草籽粉3份；

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷酸酯酶均为食品级酶制剂；

制备方法：包括如下步骤：按照配方，首先依次将蒿草籽粉、适口剂、磷酸酯酶、脂肪酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麦芽粉、酵母培养物、钙果提取物质量的30％加入V型混合罐均匀混合25min,搅拌转速40r/min,然后加入剩余钙果提取物均匀混合40min,搅拌转速60r/min,无菌灌装、密封、包装即得鲶鱼饲料复合酶。

实施例5

一种鲶鱼饲料复合酶，主要由以下重量份数的原料制备：

酵母培养物20份，钙果提取物30份，小麦芽粉10份，酸性木聚糖酶20份，酸性蛋白酶10份，植酸酶20份，β-葡聚糖酶6份，纤维素酶9份，淀粉酶5份，β-甘露聚糖酶7份，果胶酶3份，脂肪酶6份，磷酸酯酶2份，适口剂5份，蒿草籽粉1份；

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷酸酯酶均为食品级酶制剂；

制备方法：包括如下步骤：按照配方，首先依次将蒿草籽粉、适口剂、磷酸酯酶、脂肪酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麦芽粉、酵母培养物、钙果提取物质量的30％加入V型混合罐均匀混合15min,搅拌转速40r/min,然后加入剩余钙果提取物均匀混合20min,搅拌转速60r/min,无菌灌装、密封、包装即得鲶鱼饲料复合酶。

实施例6

一种鲶鱼饲料复合酶，主要由以下重量份数的原料制备：

酵母培养物40份，钙果提取物15份，小麦芽粉20份，酸性木聚糖酶10份，酸性蛋白酶20份，植酸酶10份，β-葡聚糖酶10份，纤维素酶5份，淀粉酶9份，β-甘露聚糖酶3份，果胶酶7份，脂肪酶2份，磷酸酯酶6份，适口剂1份，蒿草籽粉3份；

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷酸酯酶均为食品级酶制剂；

制备方法：包括如下步骤：按照配方，首先依次将蒿草籽粉、适口剂、磷酸酯酶、脂肪酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麦芽粉、酵母培养物、钙果提取物质量的10％加入V型混合罐均匀混合25min,搅拌转速20r/min,然后加入剩余钙果提取物均匀混合40min,搅拌转速40r/min,无菌灌装、密封、包装即得鲶鱼饲料复合酶。

实施例7本发明鲶鱼饲料复合酶的养殖效果试验

1.鱼种及其来源：购于某水产养殖基地的土鲶鱼；

2.试验鱼塘的选择：在某鲶鱼养殖场选了两口鱼塘分别为实验组和对照组，鱼塘面积均为3亩，养殖水深为2.0-2.5米。试验鱼塘的养殖水源丰富，水质清新无污染。鱼塘设独立的进排水系统，进水闸阀室设三道闸槽，外槽安装粗滤网，内槽安装锥形网，排水槽安装防逃网。

3.试验周期：2015.3.18-2015.11.18

4.养殖方法：试验组和对照组均采用下列养殖方法：

(1)池塘准备工作

①池塘的清整：包括干塘、清淤和晒池。

②药物消毒：鱼种放养前7日，用生石灰100～130千克/亩化水泼洒清塘消毒，要求泼洒均匀，池塘不留死角。

③池塘注水：鱼种放养前5日注水，注水水位在鱼种放养前1.2米即可，鱼种放养后再逐渐注水至最高水位。

(2)鱼种放养：试验养殖鱼种投放日期为2015年3月20日，选择鱼种时，要求鱼种体表光滑、无伤残，鱼种入池前用5％的食盐水浸洗消毒3～5分钟。随机投放至试验组和对照组鱼塘，投放情况见表1。

表1土鲶投放情况

鱼塘	品种	规格(g/尾)	总尾数	平均亩尾数	亩量(Kg)	总量(Kg)
							试验组	土鲶鱼	50-100	9453	3151	236.33	708.98
对照组	土鲶鱼	50-100	9450	3150	236.25	708.75

(3)驯化：在鱼池中坐北朝南方向，离池岸2.5米距离，距池底60厘米，用石棉瓦搭设3～5个食台。鱼种入池的当天即开始驯化投喂，人在投饵前发出响声，使鱼类产生条件反射，声音停顿时，在饵料台附近以小把投喂颗粒饵料。每日2次，每次30～40分钟，每次投饵间隔10秒钟左右，这样坚持驯化7～10天，鱼种摄食颗粒饵料数量由少到多，摄食强度由弱到强转变，直至驯化成功。

(4)饲养：试验组和对照组饲喂的饲料中分别添加本发明实施例2制备的鲶鱼饲料复合酶和市售同类型、同规格、同生产日期的鲶鱼饲料复合酶，添加量为饲料质量的0.4％，每天投喂2次，以9:00―10:00、15:00―16:00各投喂一次。待鱼类驯化后饵料应投在食台上。鱼类的投饵率为2％～6％，日投饵量应视养殖具体情况灵活掌握，每次以1小时内吃完为度。投喂时还应遵循“四定”原则。

(5)日常管理

①水质调控：鱼种放养前池塘水位在1.2米左右，鱼种放养后每隔5～7天加注新水一次。每次加水10～15厘米。7―9月的高温养殖季节池水加至2.0～2.5米，并经常使用EM原露改良水质，水体透明度为30～40厘米。

②巡塘：每日巡塘应遵循早、中、晚巡塘制度。检查鱼的吃食情况、水质变化情况等，发现问题及时采取措施。特别是天气闷热或有浮头预兆的情况要及时开启增氧机，保持池水溶氧5毫克/升以上。

③鱼病防治：鱼病防治按照“预防为主、防治结合”的方针。做到无病先防，在养殖期间经常使用二氧化氯或生石灰消毒水体。

5.试验项目及结果：

整个试验周期内观察、检测鲶鱼发病情况、死亡情况并作记录，统计实验组及对照组鱼塘发病率及死亡率；出塘时统计实验组及对照组产量(尾数、尾重、总重、尾均增重等)；结果如表2：

表2：土鲶鱼饲喂试验结果

以上试验结果表明：以同样的饲喂及驯化方法，同样的日常管理，同样的鱼塘条件和同样的土鲶鱼鱼种及投放量等情况下饲喂鲶鱼，以相同的添加量添加本发明制备的鲶鱼饲料复合酶的饲料适口性强，成鱼规格差距小，整齐，进而鲶鱼撕咬、竞争觅食情况轻微，死亡率低仅为3％，比对照组市售饲料复合酶降低75％；抗病性强，发病率仅为3％，比对照组市售饲料复合酶降低66.67％；消化率高，尾均增重强，比对照组市售饲料复合酶提高55.74％；饲料系数低，料肉比低，比对照组市售饲料复合酶降低36.09％；养殖效益显著，同样投放量情况下产量提高59.58％，大大降低了养殖成本，具有较好的实用性和先进性。

需要说明的是：本发明实施例3-6制备的鲶鱼饲料复合酶同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大。

实施例8本发明鲶鱼饲料复合酶的生物活性(稳定性)试验

将本发明实施例2制备的鲶鱼饲料复合酶与市售相同生产日期的粉状饲料复合酶分别于-12℃和40℃条件下储存12个月，采用《GB/T23527-2009中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂》中检测方法测定蛋白酶的酶活力，计算酶活损失率，酶活损失率是指实际检测的酶活力与产品标注酶活力的差值占标注酶活力的百分率，结果如表3

表3储存期酶活力损失率

以上结果表明，在-12℃和40℃条件下储存12个月，本发明鲶鱼饲料复合酶与市售饲料复合酶相比，其蛋白酶酶活损失分别降低43％和18.9％，具有优良的温度储存性，酶活力非常稳定，同时也说明本发明鲶鱼饲料复合酶中含有的其它生物活性物质的损失率极低，具有较好的抗冻、抗热性能，产品质量稳定，保质期长。

需要说明的是：本发明实施例3-6制备的鲶鱼饲料复合酶同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大。

实施例9高糖条件下酿酒酵母tlj2016发酵产GSH能力实验

(1)摇瓶培养

取tlj2016斜面菌种一环，接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h得种子液；

所述摇瓶培养基质量组成为：(NH4)₂SO₄ 6g/L，葡萄糖35g/L，K₂HPO4·3H₂O 3g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，酵母粉11g/L，MnSO₄ 0.1g/L，KCL 0.1g/L，FeSO₄ 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，余量为水，pH 6.0；

(2)5L发酵罐培养

将种子液按10％接种量，接入装有3L发酵培养基的发酵罐中，30℃,通气量6L/min,罐压0.03MPa，500rpm,恒pH6.0条件下进行发酵培养，发酵至30h时，一次性添加终浓度为25mmol/L的L-半胱氨酸，总发酵时间为50h；

所述发酵培养基质量组成为：(NH₄)₂SO₄ 10g/L，葡萄糖100g/L，K₂HPO₄·3H₂O 8g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，酵母粉11g/L，MnSO₄ 0.1g/L，KCL 0.1g/L，FeSO4 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，余量为水，pH6.0；

发酵结束后，测定发酵液中GSH的含量为3308mg/L.

实施例10酿酒酵母tlj2016L-半胱氨酸耐受力实验

将出发菌株以及tlj2016斜面菌种各一环，分别接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养进行培养，在培养至12h时，向摇瓶中加入不同终浓度的L-半胱氨酸，再培养10h，测定细胞干重，结果表4、5；

摇瓶培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6、葡萄糖20、K₂HPO₄·3H₂O 3、KH₂PO₄ 0.5、酵母粉11、MnSO₄ 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO₄·7H₂O 0.1，pH6.0；

表4：出发菌株L-半胱氨酸耐受力

L-半胱氨酸浓度mmol/L	0	5	10	15	20	40
							出发菌株干重g/L	22.6	15.7	10.2	4.3	2.2	0.8
GSH浓度(mg/L)	35.6	46.7	43.2	40.7	37.9	25.3

表5tlj2016L-半胱氨酸耐受力

L-半胱氨酸浓度mmol/L	0	5	10	15	20	40
							tlj2016干重g/L	25.7	28.5	23.6	21.2	20.6	18.7
GSH浓度(mg/L)	73.2	98.3	113.5	121.7	127.5	135.8

从表4、5的结果可以看出，对于出发菌株，培养基中添加L-半胱氨酸，细胞停止生长，并且开始自溶，导致GSH增长率随着L-半胱氨酸浓度的升高而降低；而低浓度L-半胱氨酸下，tlj2016仍能够缓慢生长，随着L-半胱氨酸浓度的提高，tlj2016菌株的细胞干重缓慢下降，而GSH浓度持续增长，这一结果将有利于GSH生产过程中通过添加前体氨基酸-L-半胱氨酸提促进GSH的生产。

实施例11酿酒酵母tlj2016耐盐能力实验

取tlj2016菌液1mL接种菌种于含有不同NaCl浓度的(含量梯度为0％、2％、5％、10％、15％、18％)的10mL YPD液体培养基(pH＝6.5)，置于30℃下分别培养24h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于YPD固体平板中涂布，于30℃生化培养箱中倒置培养36小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表6，可知该菌的耐盐浓度为18％，说明酿酒酵母tlj2016不仅可以在常规环境中生存，在高盐条件下依然具有活力，可应用于酱油、腌制品等高盐食品加工过程中耗糖产谷胱甘肽。

表6耐盐能力检测(×10⁷cfu/ml)

Claims (10)

1.一种鲶鱼饲料复合酶，主要由以下重量份数的原料制备：酵母培养物20-40份，钙果提取物15-30份，小麦芽粉10-20份，酸性木聚糖酶10-20份，酸性蛋白酶10-20份，植酸酶10-20份，β-葡聚糖酶6-10份，纤维素酶5-9份，淀粉酶5-9份，β-甘露聚糖酶3-7份，果胶酶3-7份，脂肪酶2-6份，磷酸酯酶2-6份，适口剂1-5份，蒿草籽粉1-3份。

2.如权利要求1所述的鲶鱼饲料复合酶，其特征在于，所述酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：取1环活化后的酿酒酵母tlj2016斜面菌种，接种至装有100m L种子培养基的500mL三角瓶中培养，在28～30℃、摇床转速150～200r/min条件下培养25～30h，得到一级种子液；将一级种子液按5～10％(v/v)的接种量，接种至装有100m L发酵培养基的500m L三角瓶中进行发酵培养，发酵时间25～30h，温度28～30℃，摇床转速150～200r/min，得到二级种子液；将二级种子液以5～10％(v/v)接种量接入到装3L发酵培养基的5L发酵罐恒温发酵，温度28～30℃，通风量4～6L/min，转速150～200r/min，发酵全程调节发酵液pH值为6.0～6.5，当发酵至25～30h时，以每升发酵液25～30mmol的添加量向发酵液中一次性添加L-半胱氨酸，继续发酵20-30h得到最终发酵液；最终发酵液减压浓缩至固形物含量为18-26％，冷冻干燥即得酵母培养物；

所述酿酒酵母tlj2016保藏编号为CGMCC No.12789。

3.如权利要求2所述的鲶鱼饲料复合酶，其特征在于，所述酵母培养物中活菌含量为：7×10¹²-9×10¹²cfu/g。

4.如权利要求2所述的鲶鱼饲料复合酶，其特征在于，所述最终发酵液中GSH终浓度达到3268-3308mg/L。

5.如权利要求2所述的鲶鱼饲料复合酶，其特征在于，所述发酵培养基的质量组成为：(NH₄)₂SO₄ 10g/L，糖蜜150g/L，K₂HPO₄·3H₂O 8g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，酵母粉5g/L，玉米浆10g/L，MnSO₄ 0.1g/L，KCL 0.1g/L，FeSO₄ 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L,余量为水，pH 6.0。

6.如权利要求1所述的鲶鱼饲料复合酶，其特征在于，所述钙果提取物的制备方法，包括如下步骤：将钙果茎、钙果叶和菊粉按质量比5-9:3-6:1-3均匀混合，置于超声波清洗机中于200W、30KHz清洗3-5min，沥干，破碎至粒径0.3-0.7mm，加入破碎物质量0.5-1.5倍的水，调节pH值为5-7，加入混合物质量0.1-0.3％的生物酶，于50-60℃酶解10-15min；酶解液减压浓缩至固形物含量为40-60％，放入微波干燥机于2000W、130-150℃进行间歇式干燥，使之水分达到4-6％，然后粉碎至粒径0.4-0.6mm，加入粉碎物质量0.2-0.4％的碳酸氢钠，均匀混合，调整混合物水分含量为12-14％，室温、密封静置2-4h，于螺杆转速105-115r/min、温度140-160℃条件挤压膨化，然后超微粉碎至粒径0.1-0.3mm即得钙果提取物；

所述生物酶为纤维素酶、漆酶、葡聚糖酶、甘露糖酶、果胶酶按质量比2-4:1-3:1-3:0.5-1.5:0.4-1均匀混合。

7.如权利要求1所述的鲶鱼饲料复合酶，其特征在于，所述小麦芽粉的制备方法，包括如下步骤：将小麦放在温度为10-18℃、pH值为6-8的浸泡液中浸泡20-40min,浸泡液含有质量百分比浓度为0.1-0.3％的碳酸氢钠和0.2-0.4％的复配酶，然后以3-5℃/min的速率升温至28-32℃，继续浸泡3-5h,最后以5-7℃/min的速率升温至50-60℃浸泡5-8min,整个浸泡过程每隔15-20min通风一次，通风压力0.13-0.15MPa，同时于电场强度3-5kV/cm，脉冲时间100-300μs,脉冲频率60-80Hz条件进行高压脉冲电场处理，直至小麦水分含量为40-45％；浸泡后的小麦沥干，在发芽室内进行暗发芽，暗发芽温度保持20-24℃，暗发芽时间为20-24h，经发芽后的小麦干燥至水分含量为5-8％，低温粉碎，过60-80目筛即得小麦芽粉；

所述复配酶为纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶按质量比2-4:2-4:1-3:1-2均匀混合。

8.如权利要求1所述的鲶鱼饲料复合酶，其特征在于，所述适口剂的制备方法，包括如下步骤：按质量比1-3:2-8称取新鲜羊血和蚯蚓，混匀、绞碎得混合料，加入其质量2-5倍的离子溶液，混匀，调节pH值为6-8，于室温下在电场强度25-35kV/cm，脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理20-30min；然后加入混合料质量0.04-0.08％的复合酶，于50-60℃酶解30-50min，然后降温至35-45℃酶解40-60min，90℃灭酶10min，降至室温，除菌过滤得酶解液，酶解液通过1000Da和5000Da的超滤膜过滤，取两膜之间的透过液，减压浓缩至固形物含量为18-22％得酶解浓缩液；加入酶解浓缩液质量5-7％的还原糖，依次于112-118℃反应30-50min和135-145℃反应45-65min后；将反应液通过1000Da和5000Da的超滤膜过滤，取两膜之间的透过液，减压浓缩至固形物含量为26-30％得反应浓缩液；向反应浓缩液中加入其质量0.2-0.4％的丝胶肽，混匀，冷冻干燥即得适口剂；

所述离子溶液为含有钠离子17-22mg/L、锌离子15-20mg/L、钾离子12-14mg/L、钙离子9-11mg/L和镁离子6-10mg/L的水溶液；

所述复合酶为蚯蚓丝氨酸蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、脂肪酶按质量比4-6:2-4:0.2-0.4:0.1-0.3均匀混合；

所述还原糖的质量组成为：木糖:核糖:葡萄糖:果糖:半乳糖＝3-5:2-4:1-3:1-3:1-2。

9.如权利要求1所述的鲶鱼饲料复合酶，其特征在于，所述蒿草籽粉的制备方法，包括如下步骤：将蒿草籽装盘，首先于电场强度1-3kV/cm高压静电处理5-7min；接着在浓度为3-5mg/L的水杨酸溶液中室温浸泡2-5h，同时在电场强度2-6kV/cm，脉冲时间50-100μs,脉冲频率100-150Hz条件下进行高压脉冲电场处理；漂洗、沥干，于3-5℃静置18-24h,然后依次在1-3℃冷藏2-4d,-3--5℃冷冻1-3d、-15--18℃冷冻10-15h,立即放在室外自然光照2-4h后立即进行粉碎，冻干，加入冻干粉质量3-8％的小苏打，均匀混合，过80-100目筛即得蒿草籽粉。

10.如权利要求1-9任一所述鲶鱼饲料复合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：按照配方，首先依次将蒿草籽粉、适口剂、磷酸酯酶、脂肪酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麦芽粉、酵母培养物、钙果提取物质量的10-30％加入V型混合罐均匀混合15-25min,搅拌转速20-40r/min,然后加入剩余钙果提取物均匀混合20-40min,搅拌转速40-60r/min,无菌灌装、密封、包装即得鲶鱼饲料复合酶。