CN106591353A - 一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法 - Google Patents

一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，通过对CcARF18基因的克隆、生物信息学分析、不同激素处理下转录水平表达量测定、亚细胞定位和维管束形成相关基因转录水平表达分析，确定了CcARF18基因在山核桃嫁接成活中以转录因子的形式起到抑制下游基因表达的作用，同时有助于进一步揭示CcARF家族影响山核桃嫁接成活的作用机制和山核桃嫁接过程生长素信号传导机制。为提高嫁接成活率奠定基础，有助于解决山核桃园艺化栽培困难的问题。

Description

一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法
【技术领域】
本发明涉及山核桃嫁接的技术领域，特别涉及一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法。
【背景技术】
植物嫁接是无性繁殖的重要途径，是有性繁殖不能维持品种特性的如苹果、梨、桃等树种的一种重要补充。植物嫁接实质是砧、穗愈伤组织的产生、对接、愈合、维管束桥的形成与维管束的分化。愈伤组织连接后，在一定部位形成维管束桥，这是嫁接是否成活的必要条件之一。同时，生长素是在植物嫁接过程中一种非常重要的激素，它在植物生长发育的各个阶段都起作用，生长素是维管束形成的关键因子。生长素通过与受体结合，活化生长素响应因子ARF等转录因子，从而促进生长素下游功能基因的表达。根据转录因子的不同，生长素基因分为两类，早期基因与晚期基因。早期基因包括Aux/IAA、GH3和SAUR等，而ARF会调节早期生长素基因的表达，它通过与早期基因启动子中的TGTCTC生长素响应元件相结合，从而调控基因的转录活化或抑制。
前期，在拟南芥中鉴定出23个ARF基因具有重要的功能，其中AtARF1、AtARF2、AtARF 3、AtARF 4、AtARF 5、AtARF 7和AtARF 19参与叶片的发育，AtARF1和AtARF2与叶形和叶片的寿命有关。AtARF3、AtARF7和AtARF19与叶的展开模式有关，AtARF10和AtARF16参与根和茎的分化。但是，在山核桃等木本植物中未见有关ARF的研究报道。山核桃是重要的经济植物，营养期长，树体高大，园艺化栽培困难。因此有必要通过克隆山核桃嫁接相关基因CcARF18的全长，并对其功能进行初步分析，进一步了解其对山核桃嫁接成活的调控机理，为提高嫁接成活率奠定基础。
【发明内容】
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其旨在解决现有技术中园艺化栽培困难，嫁接难度大，且目前对山核桃等木本植物中生长素响应因子ARF了解较少的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出了一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，包括以下步骤：
A)材料准备：采用两种不同的激素：IAA 4mg/kg，NPA 0.3μg/l来处理山核桃嫁接苗，对照组采用清水处理，在嫁接后0d，3d，7d，14d采样，共36个不同样品，每个样品5个重复，取自不同组织，取样后立即用锡纸包好放入液氮灌，-70℃存放备用；
B)CcARF18基因克隆：
b1)山核桃叶片总RNA提取：利用CTAB+Trizol法提取山核桃叶片总RNA；
b2)cDNA合成：利用M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链；
b3)CcARF18基因引物设计：根据前期转录组已测序获得的538bp CcARF18片段，设计三个扩增引物ARF18Rev、ARF18(5-1)和ARF18(5-2)；
b4)RACE扩增：PCR反应体系：UPM3μl，特异性引物3μl，Primer STARMax DNA聚合酶25μl，双蒸水16.5μl，3’RACE-Ready cDNA 3μl；RACE扩增的条件为：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃2min30s，共35个循环；最后72℃延伸5min，琼脂糖电泳检测，胶回收纯化获得约2000bp目的片段，测序验证；
C)CcARF18基因生物信息学分析：应用生物信息学软件对山核桃CcARF18基因进行理化性质的分析，对蛋白二级结构和三级结构进行预测，将山核桃CcARF18与拟南芥ARF家族和其他物种ARF基因进行进化树构建，对山核桃CcARF18基因进化多序列确定其结构域比对并取ARF三个结构域中的MR区域，进行氨基酸含量分析；
D)亚细胞定位：根据CcARF18基因全长序列，设计亚细胞定位引物，以Primer Star高保真酶体系PCR扩增，PCR后的产物和pCAMBIA1300-GFP质粒使用Kpn I和Xba I进行双酶切，分别回收小片段和大片段，使用T4-DNA连接酶连接，由此获得CcARF18-GFP融合表达载体，使用电击法转化入农杆菌，最后使用下表皮注射将农杆菌注射入烟草叶片中，通过LSM510共聚焦激光扫描显微镜观察绿色荧光蛋白的信号；
E)不同激素处理下CcARF18基因和维管束形成相关基因转录水平表达分析：分别提取步骤A)中不同组织和不同嫁接时期取样的山核桃总RNA，并反转录合成cDNA第一链，根据CcARF18基因序列，利用Premier 3在线软件设计实时定量PCR引物，同时从山核桃cDNA数据库中，筛选了纤维素合成酶CesA3基因、H+ATPase形成关键基因AHA3、原形成层维管束标记基因HB8、细胞壁形成基因IRX5设计引物，进行荧光定量RT-PCR，将qRT-PCR结果制作成热图，采用2-ΔΔCt法计算平均值和标准差，对不同激素处理下CcARF18基因和维管束形成相关基因转录水平表达进行分析。
作为优选，所述的步骤b3)中扩增引物ARF18Rev序列为CGCTCCATACCACCTTCACAAT，ARF18(5-1)序列为CGGCGAAAGAAAGTGTTTTGGTGAA，ARF18(5-2)序列为ACAAGTACCAGCGAGGAACTCAGACA。
作为优选，所述的步骤b4)中特异性引物为步骤b3)中的扩增引物ARF18Rev、ARF18(5-1)和ARF18(5-2)，ARF18Rev、ARF18(5-1)和ARF18(5-2)扩增引物各1μl。
作为优选，所述的步骤C)中对山核桃CcARF18基因进行理化性质的分析采用ProtParam工具；对蛋白二级结构和三级结构进行预测采用PSIPRED和SWISSMODEL软件；将山核桃CcARF18与拟南芥ARF家族和其他物种ARF基因进行进化树构建采用MEGA6软件分析，并通过Bootstrap作次数为1000次的置信度检验；对山核桃CcARF18基因进化多序列确定其结构域比对并取ARF三个结构域中的MR区域，进行氨基酸含量分析采用DNAMAN软件。
作为优选，所述的拟南芥ARF家族基因包括AtARF1(GI：842268)、AtARF2(GI：836321)、AtARF4(GI：83616)、AtARF6(GI：839913)、AtARF8(GI：833672)、AtARF9(GI：828498)、AtARF10(GI：817382)、AtARF11(GI：819264)、AtARF12(GI：840331)、AtARF13(GI：840316)、AtARF14(GI：840450)、AtARF15(GI：840447)、AtARF16(GI：829131)、AtARF17(GI：844120)、AtARF18(GI：825356)、AtARF19(GI：838505)、AtARF20(GI：840413)、AtARF21(GI：840344)、AtARF22(GI：840341)和AtARF23(GI:840994)，所述的其他物种ARF基因包括TcARF18(GI：18613961)、PeARF18(GI：105135274)、MdARF18(GI：103450052)和GhARF18(GI：107944087)。
作为优选，所述的步骤D)中亚细胞定位引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物序列为GGGGTACCATGATTACGGTGATGG ATTC，下游引物序列为TGCTCTAGAAGTCTGATTAACAGCACCTAC。
作为优选，所述的步骤D)中电击法的电击转化条件为电压1.5kv，电阻300Ω，电容2.5μF。
作为优选，所述的步骤D)中激光波长为488nm。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明提供的一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，利用RACE技术，克隆了山核桃生长素响应因子CcARF18，该基因开放阅读框序列1989bp，生物信息学分析表明该基因编码662个氨基酸，同源比对发现该基因与拟南芥AtARF16基因具有高度的同源性，属抑制型ARF，荧光定量RT-PCR分析表明，CcARF18基因在茎中表达量最低，其次是雄花序，根，果实，而在叶中表达量最高。通过不同激素处理下CcARF18基因和维管束形成相关基因转录水平表达分析，表明外源生长素对维管束形成基因的调节功能可能不是通过CcARF18基因，而是通过其它促进型ARF基因的表达，从而促进维管束形成。本发明进一步揭示了CcARF家族在调控山核桃嫁接成活的作用机制和山核桃嫁接过程生长素信号传导机制中起到了重要作用，为提高嫁接成活率奠定基础，有助于解决山核桃园艺化栽培困难的问题。
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
图1是本发明实施例的山核桃CcARF18基因全长RACE扩增结果图；
图2是本发明实施例的山核桃CcARF18蛋白功能域预测图；
图3是本发明实施例的山核桃CcARF18蛋白质3D结构预测图；
图4是本发明实施例的山核桃CcARF18蛋白质二级结构预测图；
图5是本发明实施例的山核桃CcARF18与其他植物的生长素响应因子蛋白氨基酸序列同源性比对树状图；
图6是本发明实施例的山核桃CcARF18与其它植物ARF蛋白的同源比对图；
图7是本发明实施例的嫁接过程中维管束形成基因和生长素相关基因热图；
图8是本发明实施例的山核桃CcARF18蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位结果图。
【具体实施方式】
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
本发明实施例提供一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，包括以下步骤：
A)材料准备：采用两种不同的激素：IAA 4mg/kg，NPA 0.3μg/l来处理山核桃嫁接苗，对照组采用清水处理，在嫁接后0d，3d，7d，14d采样，共36个不同样品，每个样品5个重复，取自不同组织，取样后立即用锡纸包好放入液氮灌，-70℃存放备用。
B)CcARF18基因克隆：
b1)山核桃叶片总RNA提取：利用CTAB+Trizol法提取山核桃叶片总RNA。
b2)cDNA合成：利用M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链。
b3)CcARF18基因引物设计：根据前期转录组已测序获得的538bp CcARF18片段，设计三个扩增引物ARF18Rev(CGCTCCATACCACCTTCACAAT)、ARF18(5-1)(CGGCGAAAGAAAGTGTTTTGGTGA)和ARF18(5-2)(ACAAGTACCAGCGAGGAACTCAGACA)。
b4)RACE扩增：PCR反应体系：UPM3μl，特异性引物3μl，Primer STARMax DNA聚合酶25μl，双蒸水16.5μl，3’RACE-Ready cDNA 3μl；RACE扩增的条件为：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃2min30s，共35个循环；最后72℃延伸5min，琼脂糖电泳检测，胶回收纯化获得约2000bp目的片段，测序验证。
其中，特异性引物为步骤b3)中的扩增引物ARF18Rev、ARF18(5-1)和ARF18(5-2)，ARF18Rev、ARF18(5-1)和ARF18(5-2)扩增引物各1μl。
C)CcARF18基因生物信息学分析：应用ProtParam工具对山核桃CcARF18基因进行理化性质的分析，并使用PSIPRED和SWISSMODEL实现对蛋白二级结构和三级结构的预测，采用MEGA6软件分析，通过Bootstrap作次数为1000次的置信度检验，将山核桃CcARF18与拟南芥ARF家族和其他物种ARF基因进行进化树构建，同时使用DNAMAN软件对山核桃CcARF18基因进化多序列确定其结构域比对并取ARF三个结构域中的MR区域，进行氨基酸含量分析。
具体地，拟南芥ARF家族基因包括AtARF1(GI：842268)、AtARF2(GI：836321)、AtARF4(GI：83616)、AtARF6(GI：839913)、AtARF8(GI：833672)、AtARF9(GI：828498)、AtARF10(GI：817382)、AtARF11(GI：819264)、AtARF12(GI：840331)、AtARF13(GI：840316)、AtARF14(GI：840450)、AtARF15(GI：840447)、AtARF16(GI：829131)、AtARF17(GI：844120)、AtARF18(GI：825356)、AtARF19(GI：838505)、AtARF20(GI：840413)、AtARF21(GI：840344)、AtARF22(GI：840341)和AtARF23(GI:840994)，所述的其他物种ARF基因包括TcARF18(GI：18613961)、PeARF18(GI：105135274)、MdARF18(GI：103450052)和GhARF18(GI：107944087)。
D)亚细胞定位：根据CcARF18基因全长序列，设计亚细胞定位引物(上游引物：GGGGTACCATGATTACGGTGATGGATTC；下游引物：TGCTCTAGAAGTCTGATTAACAGCACCTAC)，以Primer Star高保真酶体系PCR扩增，PCR后的产物和pCAMBIA1300-GFP质粒使用Kpn I和XbaI进行双酶切，分别回收小片段和大片段，使用T4-DNA连接酶连接，由此获得CcARF18-GFP融合表达载体，使用电击法转化入农杆菌，电击转化条件为电压1.5kv，电阻300Ω，电容2.5μF，最后使用下表皮注射将农杆菌注射入烟草叶片中，通过LSM510共聚焦激光扫描显微镜观察绿色荧光蛋白的信号，激光波长为488nm。
E)不同激素处理下CcARF18基因和维管束形成相关基因转录水平表达分析：分别提取步骤A)中不同组织和不同嫁接时期取样的山核桃总RNA，并反转录合成cDNA第一链，根据CcARF18基因序列，利用Premier 3在线软件设计实时定量PCR引物，同时从山核桃cDNA数据库中，筛选了纤维素合成酶CesA3基因、H+ATPase形成关键基因AHA3、原形成层维管束标记基因HB8、细胞壁形成基因IRX5设计引物，进行荧光定量RT-PCR，将qRT-PCR结果制作成热图，采用2-ΔΔCt法计算平均值和标准差，对不同激素处理下CcARF18基因和维管束形成相关基因转录水平表达进行分析。
结果分析：
一、山核桃CcARF18基因全长克隆与序列分析
对前期转录组测序获得的538bp CcARF18片段的生物信息学分析发现，该片段已经存在起始密码子，通过RACE技术获得一条约1989bp的山核桃生长素响应因子CcARF18基因全长cDNA序列，与预期大小相同，参阅图1。
在线工具ProtParam预测该蛋白的分子式为C3212H5003N915O969S25，共编码662个蛋白，预测分子量为72.74KD，理论等电点7.61，共由20种氨基酸组成，其中丝氨酸含量最高10.1％，半胱氨酸含量最低1.7％，CcARF18基因不稳定系数为50.99，为不稳定蛋白，脂肪族氨基酸指数为75.50，亲水系数为-0.398。
二、山核桃CcARF18蛋白结构预测
通过蛋白质一级结构在线软件Interproscan(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析，发现了山核桃CcARF18蛋白具有ARF基因特有的BDB(B3DNA binding domain)区域和MR中间区域，参阅图2。同时，利用蛋白质二级结构在线预测软件PSIPRED(http：//bio inf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)发现山核桃CcARF18蛋白存在5个α螺旋结构和16个β折叠结构，参阅图4。
利用SWISSMODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)在线软件，以拟南芥ARF6蛋白结构为模板，预测了山核桃CcARF18蛋白的3D结构，参阅图3。CcARF18的MR结构域蛋白氨基酸含量分析发现，该区域谷氨酸含量较低，只有3.2％，而脯氨酸和丝氨酸含量较高，分别达到了7.5％和15.1％，为抑制型生长素响应因子。
三、山核桃CcARF18进化树构建及同源性分析
在NCBI中查找其他物种ARF的氨基酸序列，并利用MEGA6将CcARF18构建系统发育树，参阅图5，发现该CcARF18基因与拟南芥AtARF16、苹果MdARF18和棉花GhARF18聚在同一分支，而与AtARF18距离较远。
参阅图6，CcARF18与MdARF18、GhARF18和AtARF16蛋白质序列进行同源比对发现，其一致性分别为61.08％、66.59％和56.80％，在多序列比对结果中，存在3个保守度较高的区域，包括BDB区域和MR中间区域，而与AtARF23蛋白比对发现，CcARF18还存在一个CTD区域，表明该基因蛋白结构完整。
四、不同激素处理下CcARF18和维管束形成相关基因转录水平表达分析
通过山核桃生长素响应因子CcARF18基因在山核桃不同组织的表达分析，结果表明山核桃CcARF18在茎中表达量最低，其次是雄花序，根，果实，表达量最高的是叶。在对照中，山核桃嫁接前后，CcARF18基因的表达量在山核桃嫁接前砧木和接穗中都有强烈表达，但在嫁接后7d砧木中急剧下降，在嫁接后3d接穗中急剧下降，之后逐渐上升。
同时，参阅图7，通过维管束形成相关基因转录水平表达分析发现，维管束形成相关基因中只有CcAHA3基因在嫁接后表达量在砧木和接穗中表达量升高。CcHB8、CcIRX5、CcCesA3基因在嫁接后3d和7d在砧木和接穗中的表达量都较低，而在14d表达逐渐上升，表明山核桃CcARF18的功能可能是抑制CcAHA3基因表达。与对照相比，在IAA处理中，嫁接后前期3-7d CcARF18基因的表达明显受到抑制，嫁接后14d CcARF18基因的表达有所增加。NPA处理中，CcARF18基因被明显激活，尤其在接穗中，嫁接后所有时期CcARF18表达量均高于0d。但是CcAHA3、CcHB8、CcIRX5、CcCesA3的表达量在IAA处理后，表达量均高于对照组，而在NPA处理后，这些基因大部分时间段的表达量低于对照组。表明外源生长素对维管束形成基因的调节功能可能不是通过CcARF18基因，而是通过其它促进型ARF基因的表达，从而促进维管束形成。
五、亚细胞定位分析
参阅图8，通过CcARF18亚细胞定位分析，发现对照组中烟草细胞膜和细胞核上均有绿色荧光，而在带有CcARF18基因的农杆菌侵染后绿色荧光只在烟草细胞核上分布，表明CcARF18蛋白定位在细胞核。
综上分析结果，得出以下结论：①根据结构域不同，ARF可分为促进型和抑制型，ARF存在三个结构域，分别DBD区域、CTD区域和非保守的MR中间区域。如果MR区域丝氨酸(Ser)和脯氨酸(Pro)含量较高，则该蛋白为抑制型蛋白，MR区域谷氨酸(Glu)含量较高，则该蛋白为促进型蛋白。分析发现CcARF18蛋白的MR区域谷氨酸含量较低，只有3.2％，而脯氨酸和丝氨酸含量较高，分别达到了7.5％和15.1％，因此为抑制型生长素响应因子。②进化树构建发现，CcARF18与AtARF16聚在同一分支，具有较近的进化关系，而与AtARF18有较远的进化关系，表明CcARF18基因在功能上可能与AtARF16具有相似的生物学功能。③亚细胞定位结果显示，CcARF18蛋白仅存在于细胞核中，这与ARF是一类调控生长素响应基因表达的转录因子是相一致的。山核桃CcARF18基因在山核桃各个组织有均有表达，其中在茎中表达量最低，其次是雄花序，根，果实，表达量最高的是叶，表明该基因可能在花发育和维管束形成以及根的重力感应中起到重要作用。④由不同激素处理下CcARF18表达分析发现，CcARF18基因作为抑制型生长素响应因子，在嫁接中的功能可能是在山核桃嫁接后3-7d由于嫁接部位的高生长素浓度，抑制了CcARF18表达量，从而减少其对CcAHA3基因表达的抑制，促进CcAHA3基因的激活。但纤维素合成酶CcCesA3基因、原形成层维管束标记基因CcHB8、细胞壁形成基因CcIRX5的表达量在IAA处理后表达量有所升高，可能是受到山核桃ARF基因家族中其它促进型ARF表达的影响，从而促进砧木和接穗产生的愈伤组织细胞突破了隔离层，互相嵌合，产生次生胞间连丝之后恢复了接穗对砧木的生长素运输，促进了维管束桥的形成和嫁接成活。
本发明一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，通过对CcARF18基因的克隆、生物信息学分析、不同激素处理下转录水平表达量测定、亚细胞定位和维管束形成相关基因转录水平表达分析，确定了CcARF18基因在山核桃嫁接成活中以转录因子的形式起到抑制下游基因表达的作用，同时有助于进一步揭示CcARF家族影响山核桃嫁接成活的作用机制和山核桃嫁接过程生长素信号传导机制。为提高嫁接成活率奠定基础，有助于解决山核桃园艺化栽培困难的问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其特征在于：包括以下步骤：
A)材料准备：采用两种不同的激素：IAA 4mg/kg，NPA 0.3μg/l来处理山核桃嫁接苗，对照组采用清水处理，在嫁接后0d，3d，7d，14d采样，共36个不同样品，每个样品5个重复，取自不同组织，取样后立即用锡纸包好放入液氮灌，-70℃存放备用；
B)CcARF18基因克隆：
b1)山核桃叶片总RNA提取：利用CTAB+Trizol法提取山核桃叶片总RNA；
b2)cDNA合成：利用M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链；
b3)CcARF18基因引物设计：根据前期转录组已测序获得的538bp CcARF18片段，设计三个扩增引物ARF18Rev、ARF18(5-1)和ARF18(5-2)；
b4)RACE扩增：PCR反应体系：UPM3μl，特异性引物3μl，Primer STAR Max DNA聚合酶25μl，双蒸水16.5μl，3’RACE-Ready cDNA 3μl；RACE扩增的条件为：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃2min30s，共35个循环；最后72℃延伸5min，琼脂糖电泳检测，胶回收纯化获得约2000bp目的片段，测序验证；
C)CcARF18基因生物信息学分析：应用生物信息学软件对山核桃CcARF18基因进行理化性质的分析，对蛋白二级结构和三级结构进行预测，将山核桃CcARF18与拟南芥ARF家族和其他物种ARF基因进行进化树构建，对山核桃CcARF18基因进化多序列确定其结构域比对并取ARF三个结构域中的MR区域，进行氨基酸含量分析；
D)亚细胞定位：根据CcARF18基因全长序列，设计亚细胞定位引物，以Primer Star高保真酶体系PCR扩增，PCR后的产物和pCAMBIA1300-GFP质粒使用Kpn I和Xba I进行双酶切，分别回收小片段和大片段，使用T4-DNA连接酶连接，由此获得CcARF18-GFP融合表达载体，使用电击法转化入农杆菌，最后使用下表皮注射将农杆菌注射入烟草叶片中，通过LSM510共聚焦激光扫描显微镜观察绿色荧光蛋白的信号；
E)不同激素处理下CcARF18基因和维管束形成相关基因转录水平表达分析：分别提取步骤A)中不同组织和不同嫁接时期取样的山核桃总RNA，并反转录合成cDNA第一链，根据CcARF18基因序列，利用Premier 3在线软件设计实时定量PCR引物，同时从山核桃cDNA数据库中，筛选了纤维素合成酶CesA3基因、H+ATPase形成关键基因AHA3、原形成层维管束标记基因HB8、细胞壁形成基因IRX5设计引物，进行荧光定量RT-PCR，将qRT-PCR结果制作成热图，采用2-ΔΔCt法计算平均值和标准差，对不同激素处理下CcARF18基因和维管束形成相关基因转录水平表达进行分析。
2.如权利要求1所述的一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其特征在于：所述的步骤b3)中扩增引物ARF18Rev序列为CGCTCCATA CCACCTTCACAAT，ARF18(5-1)序列为CGGCGAAAGAAAGTGTTTTGGTG AA，ARF18(5-2)序列为ACAAGTAC CAGCGAGGAACTCAGACA。
3.如权利要求1所述的一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其特征在于：所述的步骤b4)中特异性引物为步骤b3)中的扩增引物ARF18Rev、ARF18(5-1)和ARF18(5-2)，ARF18Rev、ARF18(5-1)和ARF18(5-2)扩增引物各1μl。
4.如权利要求1所述的一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其特征在于：所述的步骤C)中对山核桃CcARF18基因进行理化性质的分析采用ProtParam工具；对蛋白二级结构和三级结构进行预测采用PSIPRED和SWISSMODEL软件；将山核桃CcARF18与拟南芥ARF家族和其他物种ARF基因进行进化树构建采用MEGA6软件分析，并通过Bootstrap作次数为1000次的置信度检验；对山核桃CcARF18基因进化多序列确定其结构域比对并取ARF三个结构域中的MR区域，进行氨基酸含量分析采用DNAMAN软件。
5.如权利要求4所述的一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其特征在于：所述的拟南芥ARF家族基因包括AtARF1(GI：842268)、AtARF2(GI：836321)、AtARF4(GI：83616)、AtARF6(GI：839913)、AtARF8(GI：833672)、AtARF9(GI：828498)、AtARF10(GI：817382)、AtARF11(GI：819264)、AtARF12(GI：840331)、AtARF13(GI：840316)、AtARF14(GI：840450)、AtARF15(GI：840447)、AtARF16(GI：829131)、AtARF17(GI：844120)、AtARF18(GI：825356)、AtARF19(GI：838505)、AtARF20(GI：840413)、AtARF21(GI：840344)、AtARF22(GI：840341)和AtARF23(GI:840994)，所述的其他物种ARF基因包括TcARF18(GI：18613961)、PeARF18(GI：105135274)、MdARF18(GI：103450052)和GhARF18(GI：107944087)。
6.如权利要求1所述的一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其特征在于：所述的步骤D)中亚细胞定位引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物序列为GGGGTACCATGATTACGGTGATGG ATTC，下游引物序列为TGCTCTAGAAGTCTGATTAACAGCACCTAC。
7.如权利要求1所述的一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其特征在于：所述的步骤D)中电击法的电击转化条件为电压1.5kv，电阻300Ω，电容2.5μF。
8.如权利要求1所述的一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其特征在于：所述的步骤D)中激光波长为488nm。
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