实施例1:对系列不同考布他汀A4脂肪酸酯进行体内外的对比评价
国际专利(WO 2007059118 A1),所记载的脂肪酸碳链长短在C2~C21的范围内,基本上涵盖了所有常见的脂肪酸,但未明确记载相应的实质性效果。为此,在平行对比试验中,我们在该范围内随机设计合成10个不同脂肪酸碳链的考布他汀A4酯,即考布他汀A4乙酸酯、丁酸酯、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、油酸酯,其中包括饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的考布他汀A4酯,对其进行体内外对比评价。
(一)系列不同考布他汀A4脂肪酸酯的制备
1、考布他汀A4乙酸酯的制备
在反应容器中加250mg的考布他汀A4,加入10ml无水三氯甲烷溶解,再加入122.56μl的N,N-二异丙基乙胺,在冰浴条件下搅拌5分钟,缓慢滴加74.44μl的乙酰氯,冰浴条件下继续反应10分钟,再在室温下反应3小时,纯化反应物,得到淡黄色油状液体考布他汀A4乙酸酯278.64mg,收率98.35%。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.10(dd,1H,J=8.5,2.0Hz,Ar-H),6.97(d,1H,J=2.5Hz,Ar-H),6.83(d,1H,J=8.6Hz,Ar-H),6.51(s,2H,Ar-H),6.46(d,1H,J=12.28Hz,C=CH),6.44(d,1H,J=12.28Hz,CH=C),3.84(s,3H,OCH3),3.77(s,3H,OCH3),3.68(s,6H,2×OCH3),0.87(s,3H,J=8.6Hz,CH3).
MS(ESI-)m/z:359(M+H+)
化学结构式如下:
2、考布他汀A4丁酸酯的制备
在反应容器中加250mg的考布他汀A4,加入20ml无水二氯甲烷溶解,再加入95.96μl的三乙胺,在冰浴条件下搅拌15分钟,缓慢滴加101.15μl的丁酰氯,冰浴条件下继续反应15分钟,再在室温下反应2小时,纯化反应物,得到淡黄色油状液体考布他汀A4丁酸酯301.50mg,收率98.73%。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.09(dd,1H,J=8.6,2.2Hz,Ar-H),6.99(d,1H,J=2.5Hz,Ar-H),6.81(d,1H,J=8.6Hz,Ar-H),6.49(s,2H,Ar-H),6.45(d,1H,J=12.28Hz,C=CH),6.43(d,1H,J=12.28Hz,CH=C),3.82(s,3H,OCH3),3.79(s,3H,OCH3),3.69(s,6H,2×OCH3),1.70-1.74(m,2H,CH2),1.30-1.36(m,2H,CH2),0.87(t,3H,J=8.6Hz,CH3).
MS(ESI-)m/z:404(M+NH4 +)
化学结构式如下:
3、考布他汀A4己酸酯的制备
在反应容器中加250mg的考布他汀A4,加入20ml无水二氯甲烷溶解,再加入95.96μl的三乙胺,在冰浴条件下搅拌15分钟,缓慢滴加127.65μl的己酰氯,冰浴条件下继续反应15分钟,再在室温下反应4小时,纯化反应物,得到淡黄色油状液体考布他汀A4己酸酯320.60mg,收率97.88%。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.12(dd,1H,J=8.5,2.2Hz,Ar-H),6.98(d,1H,J=2.4Hz,Ar-H),6.83(d,1H,J=8.5Hz,Ar-H),6.49(s,2H,Ar-H),6.45(d,1H,J=12.30Hz,C=CH),6.43(d,1H,J=12.30Hz,CH=C),3.82(s,3H,OCH3),3.79(s,3H,OCH3),3.69(s,6H,2×OCH3),2.01-1.87(m,2H,CH2),1.05-1.46(m,6H,3×CH2),0.87(t,3H,J=8.6Hz,CH3).
MS(ESI-)m/z:432(M+NH4 +)
化学结构式如下:
4、考布他汀A4辛酸酯的制备
在反应容器中加250mg的考布他汀A4,加入30ml的无水二氯甲烷与N,N-二甲基乙酰胺的混合溶剂溶解,加入的122.56μlN,N-二异丙基乙胺,在冰浴条件下搅拌20分钟,缓慢滴加154.33μl的辛酰氯,冰浴条件下继续反应30分钟,再在室温下反应10小时。纯化反应物,得到淡黄色油状液体考布他汀A4辛酸酯332.78mg,收率97.74%。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.15(dd,1H,J=8.5,2.0Hz,Ar-H),7.01(d,1H,J=2.5Hz,Ar-H),6.89(d,1H,J=8.6Hz,Ar-H),6.55(s,2H,Ar-H),6.51(d,1H,J=12.30Hz,C=CH),6.43(d,1H,J=12.30Hz,CH=C),3.82(s,3H,OCH3),3.79(s,3H,OCH3),3.69(s,6H,2×OCH3),1.69-1.74(m,2H,CH2),1.26-1.30(m,10H,5×CH2),0.87(t,3H,J=8.6Hz,CH3).
MS(ESI-)m/z:423(M+H+)
化学结构式如下:
5、考布他汀A4癸酸酯的制备
在反应容器中加250mg的考布他汀A4,加入20ml无水N,N-二甲基甲酰胺溶解,再加入365.69mg的4-二甲氨基吡啶,在冰浴条件下搅拌15分钟,缓慢滴加226.07μl癸酰氯,冰浴条件下反应20分钟,再在室温下反应6小时,纯化反应物,得到淡黄色油状液体考布他汀A4癸酸酯358.74mg,收率99.42%。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.07(dd,1H,J=8.3,2.2Hz,Ar-H),6.90(d,1H,J=2.6Hz,Ar-H),6.83(d,1H,J=8.6Hz,Ar-H),6.46(s,2H,Ar-H),6.40(d,1H,J=12.29Hz,C=CH),6.38(d,1H,J=12.29Hz,CH=C),3.82(s,3H,OCH3),3.80(s,3H,OCH3),3.72(s,6H,2×OCH3),1.65-1.76(m,2H,CH2),1.26-1.30(m,14H,7×CH2),0.87(t,3H,J=8.6Hz,CH3).
MS(ESI-)m/z:471(M+H+)
化学结构式如下:
6、考布他汀A4月桂酸酯的制备
在反应容器中加250mg的考布他汀A4,加入15ml无水二氯甲烷溶解,再加入93.73μl的吡啶,在冰浴条件下搅拌20分钟,缓慢滴加207.48μl的月桂酰氯,冰浴条件下继续反应30分钟,再在室温下反应6小时,纯化反应物,得到淡黄色考布他汀A4月桂酸酯378.62mg,收率98.70%。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.10(dd,1H,J=8.5,2.0Hz,Ar-H),6.99(d,1H,J=2.5Hz,Ar-H),6.83(d,1H,J=8.6Hz,Ar-H),6.49(s,2H,Ar-H),6.45(d,1H,J=12.30Hz,C=CH),6.43(d,1H,J=12.30Hz,CH=C),3.82(s,3H,OCH3),3.79(s,3H,OCH3),3.69(s,6H,2×OCH3),1.69-1.74(m,2H,CH2),1.26-1.30(m,18H,9×CH2),0.87(t,3H,J=8.6Hz,CH3).
MS(ESI-)m/z:499(M+H+)
化学结构式如下:
7、考布他汀A4肉豆蔻酸酯的制备
在反应容器中加250mg的考布他汀A4,加入30ml的无水二氯甲烷与N,N-二甲基乙酰胺的混合溶剂溶解,加入的122.56μl N,N-二异丙基乙胺,在冰浴条件下搅拌20分钟,缓慢滴加234.06μl的肉豆蔻酰氯,冰浴条件下继续反应30分钟,再在室温下反应12小时。反应物在石油醚中重结晶,分离得到白色蜡状固体考布他汀A4肉豆蔻酸酯398.72mg,收率98.41%。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.10(dd,1H,J=8.5,2.1Hz,Ar-H),6.97(d,1H,J=2.5Hz,Ar-H),6.83(d,1H,J=8.6Hz,Ar-H),6.49(s,2H,Ar-H),6.45(d,1H,J=12.30Hz,C=CH),6.43(d,1H,J=12.30Hz,CH=C),3.82(s,3H,OCH3),3.79(s,3H,OCH3),3.69(s,6H,2×OCH3),1.69-1.74(m,2H,CH2),1.26-1.30(m,22H,11×CH2),0.87(t,3H,J=8.6Hz,CH3).
MS(ESI-)m/z:527(M+H+)
化学结构式如下:
8、考布他汀A4棕榈酸酯的制备
在反应容器中加500mg的考布他汀A4,加入15ml无水二氯甲烷溶解,再加入187.47μl的吡啶,在冰浴条件下搅拌20分钟,缓慢滴加651.66μl的棕榈酰氯,冰浴条件下继续反应30分钟,再在室温下反应12小时,反应物在石油醚中重结晶,分离得到白色粉状固体考布他汀A4棕榈酸酯854.64mg,收率99.31%。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.14(dd,1H,J=8.5,2.0Hz,Ar-H),6.95(d,1H,J=2.5Hz,Ar-H),6.83(d,1H,J=8.6Hz,Ar-H),6.47(s,2H,Ar-H),6.43(d,1H,J=12.30Hz,C=CH),6.40(d,1H,J=12.30Hz,CH=C),3.82(s,3H,OCH3),3.79(s,3H,OCH3),3.69(s,6H,2×OCH3),1.60-1.75(m,2H,CH2),1.32-1.40(m,26H,13×CH2),0.88(t,3H,J=8.6Hz,CH3).
MS(ESI-)m/z:555(M+H+)
化学结构式如下:
9、考布他汀A4硬脂酸酯的制备
在反应容器中加500mg的考布他汀A4,加入20ml无水二氯甲烷溶解,再加入306.41μl的N,N-二异丙基乙胺,在冰浴条件下搅拌20分钟,缓慢滴加718.17μl的硬脂酰氯,冰浴条件下继续反应15分钟,再在室温下反应3小时,反应物在环己烷中重结晶,分离得到白色粉状固体考布他汀A4硬脂酸酯880.98mg,收率97.96%。
该物质的1HNMR和MS(ESI)数据如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.10(dd,1H,J=8.6,2.0Hz,Ar-H),6.99(d,1H,J=2.4Hz,Ar-H),6.83(d,1H,J=8.6Hz,Ar-H),6.49(s,2H,Ar-H),6.45(d,1H,J=12.29Hz,C=CH),6.43(d,1H,J=12.30Hz,CH=C),3.82(s,3H,OCH3),3.79(s,3H,OCH3),3.69(s,6H,2×OCH3),1.69-1.74(m,2H,CH2),1.26-1.30(m,30H,15×CH2),0.87(t,3H,J=8.6Hz,CH3)
MS(ESI-)m/z:583(M+H+)
化学结构式如下:
10、考布他汀A4油酸酯的制备
在反应容器中加250mg的考布他汀A4,加入20ml无水二氯甲烷溶解,再加入122.56μl的N,N-二异丙基乙胺,在冰浴条件下搅拌20分钟,缓慢滴加356.70μl的油酸酰氯,冰浴条件下继续反应15分钟,再在室温下反应10小时,纯化反应物,得到淡黄色油状液体考布他汀A4油酸酯778.43mg,收率98.50%。
该物质的1HNMR数据如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.17(dd,1H,J=8.6,2.2Hz,Ar-H),7.03(d,1H,J=2.2Hz,Ar-H),6.98(d,1H,J=8.6Hz,Ar-H),6.75(s,2H,Ar-H),6.46(d,1H,J=12.28Hz,C=CH),6.44(d,1H,J=12.28Hz,CH=C),5.56-5.87(m,2H,CH=CH),3.83(s,3H,OCH3),3.71(s,3H,OCH3),3.68(s,6H,2×OCH3),1.84-1.96(m,6H,3×CH2),1.33-1.52(m,18H,9×CH2),0.87(s,3H,J=8.6Hz,CH3).
化学结构式如下:
(二)系列不同考布他汀A4脂肪酸酯的性状对比
将上述合成的不同脂肪酸考布他汀A4酯置于室温下观察其性状,结果如下表所示:
化合物名称 |
碳链长短 |
脂肪酸饱和度 |
性状 |
考布他汀A4乙酸酯 |
C2 |
饱和脂肪酸 |
淡黄色油状液体 |
考布他汀A4丁酸酯 |
C4 |
饱和脂肪酸 |
淡黄色油状液体 |
考布他汀A4己酸酯 |
C6 |
饱和脂肪酸 |
淡黄色油状液体 |
考布他汀A4辛酸酯 |
C8 |
饱和脂肪酸 |
淡黄色油状液体 |
考布他汀A4癸酸酯 |
C10 |
饱和脂肪酸 |
淡黄色油状液体 |
考布他汀A4月桂酸酯 |
C12 |
饱和脂肪酸 |
淡黄色油状液体 |
考布他汀A4肉豆蔻酸酯 |
C14 |
饱和脂肪酸 |
白色蜡状固体 |
考布他汀A4棕榈酸酯 |
C16 |
饱和脂肪酸 |
白色固体粉末 |
考布他汀A4硬脂酸酯 |
C18 |
饱和脂肪酸 |
白色固体粉末 |
考布他汀A4油酸酯 |
C18 |
不饱和脂肪酸 |
淡黄色油状液体 |
结果分析:
试验表明,只有考布他汀A4棕榈酸酯(C16)与考布他汀A4硬脂酸酯(C18)呈白色粉末状,其余均呈蜡状或油状液体。通常油状化合物中的杂质以及有机溶剂不易去除,不利于质量控制,而固体粉末则可以通过重结晶等方式除去杂质,较易得到高质量的化合物,安全性可得到保障。
(三)系列不同考布他汀A4脂肪酸酯纳米制剂的成药性对比
1、纳米制剂的制备方法
在相同的处方工艺条件下,制备不同考布他汀A4脂肪酸酯的纳米制剂。称取考布他汀A4脂肪酸酯适量(按考布他汀A4计约300mg)、氢化大豆磷脂(HSPC)0.3g、DSPE-PEG20000.3g,用2mL无水乙醇使溶解,得有机相;称取海藻糖3g、甘露醇7g,置于适量注射用水中,搅拌溶解,得水相;将有机相在搅拌条件下注入加热至65℃的水相中,混匀,用注射用水定容至100ml。用枸橼酸或氢氧化钠调节pH值至5.0左右;然后将料液过0.22μm除菌;分装、冻干、封口,即得考布他汀A4脂肪酸酯纳米制剂。
2、纳米制剂的成药性对比
取上述系列考布他汀A4脂肪酸酯纳米制剂,分别用注射用水复溶,使成约3mg/ml(按考布他汀A4计)。在室温下考察复溶液的外观、平均粒径,并在室温环境下放置5小时后观察复溶液的状态,结果如下表所示:
名称 |
外观 |
平均粒径 |
5小时放置外观 |
考布他汀A4乙酸酯纳米制剂 |
呈半透明乳浊液 |
90.53nm |
未见明显变化 |
考布他汀A4丁酸酯纳米制剂 |
呈半透明乳浊液 |
110.3nm |
未见明显变化 |
考布他汀A4己酸酯纳米制剂 |
呈半透明乳浊液 |
91.4nm |
未见明显变化 |
考布他汀A4辛酸酯纳米制剂 |
呈半透明乳浊液 |
89.2nm |
未见明显变化 |
考布他汀A4癸酸酯纳米制剂 |
呈半透明乳浊液 |
96.3nm |
未见明显变化 |
考布他汀A4月桂酸酯纳米制剂 |
呈半透明乳浊液 |
110.7nm |
未见明显变化 |
考布他汀A4肉豆蔻酸酯纳米制剂 |
呈半透明乳浊液 |
97.6nm |
未见明显变化 |
考布他汀A4棕榈酸酯纳米制剂 |
呈半透明乳浊液 |
100.6nm |
未见明显变化 |
考布他汀A4硬脂酸酯纳米制剂 |
呈半透明乳浊液 |
98.5nm |
未见明显变化 |
考布他汀A4油酸酯纳米制剂 |
呈半透明乳浊液 |
103.1nm |
呈浑浊的乳浊液 |
结果分析:
试验表明,所设计的10个考布他汀A4脂肪酸酯,均能将其成功制备成纳米制剂,且复溶后呈半透明乳浊液,粒径基本上分布在100nm左右。室温下放置5小时时,发现只有考布他汀A4油酸酯的纳米溶液由起初的半透明乳浊液变为浑浊的乳浊液,粒径明显增大,可能是油酸属不饱和脂肪酸的原因所致。其他9个脂肪酸酯则稳定性良好,故选用考布他汀A4饱和脂肪酸酯时成药性可能会更大些,也体现了本发明的优越性。故在接下来的体内药效评价时只对剩余的9个饱和脂肪酸酯进行比较。
(四)系列不同考布他汀A4脂肪酸酯对S180荷瘤小鼠肿瘤抑制作用的平行对比
取上述制备的考布他汀A4脂肪酸酯纳米制剂,在相同的制剂类型条件下(纳米制剂)分别对拟设计的9个考布他汀A4脂肪酸酯进行动物体内药效学的对比评价,同时与原研药考布他汀A4磷酸二钠注射剂进行比较。试验方案与结果如下所示:
1、小鼠S180肿瘤模型的建立与给药方案的设计
在温度为37℃与5%CO2环境下,用含有10%血清、1%双抗的DMEM中培养S180细胞。当细胞培养至对数生长期时,活性较好,收集细胞,并用不含血清的DMEM稀释细胞浓度为1×107个/ml,得肿瘤细胞悬液。每只小鼠以腹腔注射的形式接种0.2ml细胞悬液,共接种6只昆明小鼠。接种8天后,抽取腹水,传代至第三代。抽取第三代腹水细胞,用生理盐水稀释到浓度为1×106个/ml,得腹水细胞稀释液。取腹水细胞稀释液0.2ml,分别注射在昆明小鼠的右前肢皮下,得小鼠S180肿瘤模型。
分别设定生理盐水组、原研药考布他汀A4磷酸二钠盐溶液阳性对照组、考布他汀A4脂肪酸酯纳米制剂供试组,每组8只S180肿瘤模型小鼠。其中原研药是将考布他汀A4磷酸二钠原料药直接溶于注射用水中使成3mg/ml(按考布他汀A4计),作为阳性对照制剂;取实施例1第(三)项下制备的系列考布他汀A4脂肪酸酯冻干纳米制剂,用注射用水溶解成3mg/ml(按考布他汀A4计),作为供试制剂。采用小鼠尾静脉注射方式给药,剂量为每次15mg/kg(按考布他汀A4计),每天给药一次,连续给药6天,停药后隔天处死小鼠,剥取肿瘤并称重,计算抑瘤率。由于设计的考布他汀A4脂肪酸酯纳米制剂样品数多达9个,故按上述试验方案,将其分为两次试验予以完成,分别记作对比试验一与对比试验二。
抑瘤率=(生理盐水组瘤重-给药组瘤重)/生理盐水组瘤重×100%
2、对比试验一抗肿瘤效果
对小鼠S180实体瘤的药效学比较结果如下表所示,肿瘤照片见说明书附图中的图1。
组别 |
瘤重(g) |
抑瘤率 |
生理盐水 |
2.47±0.52 |
/ |
考布他汀A4磷酸二钠盐溶液 |
0.98±0.41 |
60.32% |
考布他汀A4乙酸酯纳米制剂 |
0.91±0.35 |
63.16% |
考布他汀A4己酸酯纳米制剂 |
0.82±0.29 |
66.80% |
考布他汀A4癸酸酯纳米制剂 |
0.88±0.31 |
64.37% |
考布他汀A4肉豆蔻酸酯纳米制剂 |
0.84±0.42 |
65.99% |
考布他汀A4硬脂酸酯纳米制剂 |
0.22±0.19 |
91.09% |
结果分析:
在相同的剂型以及载药量情况下,对考布他汀A4乙酸酯、己酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯纳米制剂的抗肿瘤效果进行比较。意外的发现,只有考布他汀A4硬脂酸酯纳米制剂的抗肿瘤效果最为突出,抑瘤率高达91.09%,而其他的考布他汀A4脂肪酸酯与原研药(CA4P)的抑瘤率均维持在60%左右,故考布他汀A4硬脂酸酯如此显著的抗肿瘤效果是本发明的核心技术特征。
3、对比试验二抗肿瘤效果
对小鼠S180实体瘤的药效学比较结果如下表所示,肿瘤照片见说明书附图中的图2。
组别 |
瘤重(g) |
抑瘤率 |
生理盐水 |
1.98±0.66 |
/ |
考布他汀A4磷酸二钠盐溶液 |
0.68±0.33 |
65.66% |
考布他汀A4丁酸酯纳米制剂 |
0.71±0.21 |
64.14% |
考布他汀A4辛酸酯纳米制剂 |
0.75±0.31 |
62.12% |
考布他汀A4月桂酸酯纳米制剂 |
0.78±0.39 |
60.61% |
考布他汀A4棕榈酸酯纳米制剂 |
0.63±0.19 |
68.18% |
考布他汀A4硬脂酸酯纳米制剂 |
0.14±0.11 |
92.93% |
结果分析:
在相同的剂型以及载药量情况下,对考布他汀A4丁酸酯、辛酸酯、月桂酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯纳米制剂的抗肿瘤效果进行比较。结果显示,依然只有考布他汀A4硬脂酸酯纳米制剂的抗肿瘤效果最好,抑瘤率高达92.93%,而其他的考布他汀A4脂肪酸酯与原研药(CA4P)的抑瘤率依然维持在60%左右,进一步说明考布他汀A4硬脂酸酯的抗肿瘤活性与与其他脂肪酸酯相比,具有实质性的不同。
终上所述,将考布他汀A4制备成系列考布他汀A4脂肪酸酯后,确实能够解决考布他汀A4脂溶性差的问题,且饱和的考布他汀A4脂肪酸酯所制备的纳米制剂将更加稳定;在国际专利(WO 2007059118 A1)所记载的用C2-C21烷基取代基与考布他汀A4的酚羟基进行酯化反应的范围内,通过同剂型、同载药量、同剂量下对小鼠体内抗肿瘤性进行平行比较,惊奇的发现只有考布他汀A4硬脂酸酯的抗肿瘤活性最为显著,抑瘤率高达90%以上,基本上接近治愈的水平。另外,考布他汀A4硬脂酸酯呈白色固体粉末,质量更易控制。发现考布他汀A4硬脂酸酯独特的抗肿瘤效果,真正意义上挖掘出了考布他汀A4与脂肪酸成酯方案的实际价值,是构成本发明的核心技术特征。