CN106577540A - 一种诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食及其诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食及其诱导方法。本发明可以量化每个动物每天摄入高脂高糖的数量，并且无口感变化造成动物摄入量不足的担忧，能定时定量的摄入高脂高糖，从而大大加快了高脂血症模型的诱导过程。本发明制作的高脂血症灵长类动物模型具有啮齿动物诱发的高脂血脂模型无法比拟的优势，可用于各种类型降脂药类药物，特别是啮齿类动物模型不适合的生物技术类药物的研发及评价。
Description
技术领域：
本发明属于高脂血症研究领域，具体涉及一种诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食及其诱导方法。
背景技术：
随着社会的进步和物质生活水平的提高，人类膳食结构发生了较大的改变，从以素食为主逐渐过渡到以高脂、高糖为主的膳食结构。由于物质生活水平的提高，高脂高糖的大量摄入，疾病也随之发生了明显的增长，最常见的疾病为高脂血症和动脉粥样硬化。高脂血症分为高胆固醇血症、高甘油三酯血症和混合型高脂血症，高脂血症早期并无明显临床表现，起病隐匿，待发现时往往已经进入疾病的下一个阶段——动脉粥样硬化。高血脂以及动脉粥样硬化症已经成为威胁人类疾病的重要疾病，由于发病率居高不下，疾病后期致死率高，降血脂药物一直都是药物研发热点区域之一。众所周知，良好药物的研发离不开良好的疾病动物模型，目前用于高血脂药物研发的动物模型主要为化学物质法诱发的大鼠、小鼠、兔、猪、鹌鹑等高血脂模型模型，其次为先天性模型(大鼠)和转基因动物模型(小鼠)，上述模型为以往的降血脂药物和抗动脉粥样硬化药物的研发做出了重要的贡献，但上述模型与人类高血脂和动脉粥样硬化的致病原理不一致，人类高脂血症、动脉粥样硬化通常伴随高血液、糖尿病等疾病，其疾病的形成为复合因素。在生物技术突飞猛进的今天，由于药物的特异性(如生物技术类药物具有动物种属的高度选择特异性)上述模型已经不能完全满足药物研发的需求。啮齿类动物疾病动物模型的应用领域正逐渐转向降血脂药物的筛选方面。因此，建立与人类高血脂症和/或动脉粥样硬化症发病相似的灵长类动物模型对新型降脂类药物的研发具有非常重要的意义。
高脂高糖膳食，指的是通过人工的行为，将人类饮食结构中最常见的脂肪和糖类按一定比例混合所得的混合物。
通过高脂高糖饲料诱发灵长类动物糖尿病模型已有报道，但其制作方法为将高脂高糖加入到猴饲料中，猴通过摄入饲料而将高脂高糖成分摄入体内，日久成模。该法的不足之处为未考虑到灵长类动物喜爱用饲料玩耍的生活习性，在饲养过程中，多数的饲料被其玩耍丢弃而浪费，不能准确的计算每个动物每天摄入高脂高糖的数量，无法量化。且由于饲料含热量较高，且饲料本身的口感发生了较大的变化，动物在摄入一定量的饲料后会有饱涨感，出于自我保护的作用，动物会停止摄入更大量的饲料，导致高脂高糖的摄入量会相对减少，从而使得造模时间大大延长。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种能量化，快速诱导出高胆固醇血脂、和高胆固醇和高甘油三酯复合型高脂血症的高脂高糖半流质膳食。
本发明的诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食，其特征在于，是通过以下方法制备的：按质量比将蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0进行混合，加热搅拌均匀乳化制备成半流质状膳食，即为诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食。按照各成分的最大质量比配制的高糖高脂其流动性已达极限，即再增加各成分的质量所配制的膳食将不具备流动特性，难以通过灌胃器具送达动物的胃部。按照低于各成分最小质量比配制的高糖高脂膳食流动性较好，长期将其灌胃给予灵长类动物理论上可复制2型糖尿病灵长类动物造模，但需要耗费的时间也将会明显延长。
本发明的第二个目的是提供一种高脂血症灵长类动物模型诱导方法，其特征在于，将上述诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食灌入灵长类动物的胃部，诱导灵长类动物产生高脂血症，而得到高脂血症灵长类动物模型。
优选，是将诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食按照9.2-17.2g/kg灵长类动物的体重的量通过鼻饲管灌胃给予，每天一次，每周6天，连续给予5个月可诱导出稳定的高胆固醇血症食蟹猴模型，连续给予13月可诱导高甘油三酯合并高胆固醇血症。
优选，所述的灵长类动物优选为食蟹猴。
本发明的第三个目的是提供一种用于筛选和评价抗高脂血症药物筛选和评价研究的方法，其特征在于，根据候选药物的特点，按照一定的剂量和频率给予上述高脂血症灵长类动物模型，根据效果评价候选药物是否具有抗高脂血症的作用，从而为候选药物提供筛选和/或评价研究结果。
本发明诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食中使用的糖类和脂肪分别为人类日常生活中摄入量比较大的蔗糖、猪油、胆固醇和胆酸盐，将上述四种物质按一定的比例混合，制备成半流质膳食，将其通过鼻饲管将其灌入灵长类动物胃部，这样就可以使得灵长类动物按照体重、被动地按照一定的时间和频率精准的摄入上述高脂高糖混合物，模拟人类因物质生活条件提高而导致的饮食失节而产生的高脂血症。
本发明可以量化每个动物每天摄入高脂高糖的数量，并且无口感变化造成动物摄入量不足的担忧，能定时定量的摄入高脂高糖，从而大大加快了高脂血症模型的诱导过程。本发明制作的高脂血症灵长类动物模型具有啮齿动物诱发的高脂血脂模型无法比拟的优势，可用于各种类型降脂药类药物，特别是啮齿类动物模型不适合的生物技术类药物的研发及评价。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1.实验材料
1.1蔗糖：500g/瓶，分析纯，西陇化工。
1.2猪油：15kg/桶，食品级，海南省鼎升食品有限公司。
1.3胆固醇：500g/瓶，分析纯，上海博奥生物科技有限公司。
1.4胆酸盐：500g/瓶，分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司。
1.5葡萄糖：500g/瓶，分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司。
1.6食蟹猴：4-7岁10只，8-20岁，26只雄性，普通级，从广东蓝岛生物技术有限公司购入。
1.7甘油三酯测定试剂盒，浙江伊利康生物技术有限公司。
1.8胆固醇测定试剂盒，浙江伊利康生物技术有限公司。
1.9高密度脂蛋白测定试剂盒：浙江伊利康生物技术有限公司。
1.10低密度脂蛋白测定试剂盒：浙江伊利康生物技术有限公司。
2.主要仪器
2.1 7020生化分析仪：7020型，日本日立公司。
3.实验方法
3.1半流质高脂高糖膳食的制备：蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐按质量百分比为下述比例混合：猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸盐＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0进行混合，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化，即制备成半流质状膳食，即为本发明的诱导高胆固醇血症灵长类动物模型、高胆固醇和高甘油三酯复合型高脂血症模型的高脂高糖半流质膳食。
3.2选取正常的8-20岁的雄性中老年食蟹猴26只，按体重随机分为5组，分别为低脂低糖、低脂高糖、高脂低糖组、高脂高糖组，每组6-7只，另外选用10只年龄为4-7岁的成年雄性猴，5只为阴性对照组，5只为高脂高糖成年组。高脂高糖组膳食质量比配方为：猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸盐＝10：10：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为17.2g/kg；低脂高糖组膳食质量比配方为：猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸盐＝5：10：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为13.2g/kg；高脂低糖组膳食质量比配方为：猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸盐＝10：5：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为13.2g/kg；低脂低糖组膳食质量比配方为：猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸盐＝5：5：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为9.2g/kg；各试验组动物分组后按照设定的方案灌胃给予高脂高糖膳食，每天一次，每周6天，连续25个月。按要求测定食蟹猴空腹胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度素质蛋白(LDL-C)等指标。
血脂测定方法：食蟹猴使用氯胺酮麻醉后，从头静脉和/或隐静脉采血约2.0ml，离心后取血清，用日立7020生化分析仪测定。
4.实验结果
4.1胆固醇研究结果表明(具体见表1)：与阴性对照组相比，造模1月，各实验组胆固醇水平均有一定程度的升高，其中低脂低糖组中老年组、高脂低糖组中老年组、高脂高糖中老年组组还具有统计学差异(P<0.05或0.01)，但无生物学意义。造模3月后高脂高糖成年猴组、高脂低糖组中老年组、高脂高糖中老年组胆固醇含量明显升高，有统计学意义(P<0.05或0.01)和生物学意义。造模5月后除低脂低糖中老年组外(13月后TC明显升高有生物学意义)其他各实验组猴血浆胆固醇均明显升高，有统计学意义和生物学意义。
表1-1食蟹猴血浆胆固醇含量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
表1-2食蟹猴血浆胆固醇含量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
4.2甘油三酯研究结果表明(具体见表2)：与阴性对照组相比，高脂高糖成年组造模第7月至造模13月血浆甘油三酯含量均明显升高，有统计学意义(P<0.05或0.01)。低脂低糖中老年组造模第9月至13月血浆甘油三酯升高有统计学差异(P<0.05或0.01)。高脂低糖中老年组造模第11月至13月血浆甘油三酯水平升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。低脂高糖中老年组造模第7月至13月，血浆甘油三酯含量明显升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。高脂高糖中老年组造模第9月至13月血浆甘油三酯水平明显升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。
表2-1食蟹猴血浆甘油三酯含量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
表2-2食蟹猴血浆甘油三酯含量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
4.3高密度脂蛋白胆固醇研究结果(具体见表3)：与阴性对照组相比，高脂高糖成年组造模3月至13月HDL-C明显升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。低脂低糖中老年组造模7月至13月HDL-C明显升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。高脂低糖中老年组和高糖低脂造模造模9月至13月HDLL-C明显升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。高脂高糖中老年组造模第7月至13月HDL-C明显升高，有统计学差异(P<0.01)。
表3-1食蟹猴血浆高密度脂蛋白胆固醇含量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
表3-2食蟹猴血浆高密度脂蛋白胆固醇含量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
4.4低密度脂蛋白胆固醇研究结果(具体见表4)：阴性对照组动物实验期间LDL-C含量未见明显变化。与阴性对照组相比，高脂高糖成年组造模5月至13月LDL-C含量明显升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。低脂低糖中老年组造模9月至13月LDL-C含量明显升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。高脂低糖中老年组造模造模1月至13月LDL-C含量明显升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。低脂高糖中老年组造模5月至13月LDL-C含量明显升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。高脂高糖中老年组造模3月至13月LDL-C含量明显升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)。
表4-1食蟹猴血浆低密度脂蛋白胆固醇含量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
表4-2食蟹猴血浆低密度脂蛋白胆固醇含量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
由此可见，本发明的高脂高糖组、低脂高糖组、高脂低糖组、低脂低糖组都可成功的诱导出高胆固醇血症灵长类动物模型、高胆固醇血症和高甘油三酯血症复合型高脂血症模型。
实施例2：使用多种降低胆固醇、甘油三酯作用机制的药物验证高脂高糖诱发的高胆固醇血脂、高胆固醇和高甘油三酯血症模型及降脂药筛选和评价平台的建立
本发明制备的高胆固醇血症、高胆固醇和高甘油三酯复合型高脂血症食蟹猴模型与人类由于生活条件改善引起的高胆固醇血症、高胆固醇和高甘油三酯复合型高脂血症非常相近，其主要特点为先血浆胆固醇、LDL-C升高，HDL-C代偿性升高。因此，根据其特点，选用了2种作用机制的药物对模型动物进行干预。第一种为三羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂的代表药物辛伐他丁，该类药物作用机制为抑制内源性胆固醇的合成，从而达到降低血浆胆固醇的作用，起效快，对甘油三酯的作用较小；第二类为苯氧芳酸类药的代表性药物非诺贝特，该类药物具有明显降低TC、TG的作用，此外还具有升高HDL-C的作用，其作用机制被认为与激活PPARα有关；第三类为烟酸类药物的代表药氧甲吡嗪，该类药物对甘油三酯的降低作用强于比降低胆固醇强，其作用机制被认为与降低cAMP的水平，使脂肪酶的活性降低，脂肪组织不易分解而达到降低甘油三酯的目的。具体实验方法如下：
挑选造模成功的食蟹猴20只，其中单纯性高胆固醇血症8只(模型1组和辛伐他丁组各6只)、高胆固醇和高甘油三酯复合型高脂血症12只(模型2组、烟酸组、氧甲吡嗪组)。分组后分别进行给药，连续4周。分别测定动物的TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA、ApoA、ApoB、FFA等指标以评价药物的降脂作用，测定时间给药前、给药后1天、7天、14天、28天给药后约1h。
试验结果表明，与相应的模型组相比，辛伐他丁能够明显降低模型猴的血浆胆固醇、LDL-C的含量，对HDL-C和甘油三酯的含量未见明显影响；非诺贝特则能够明显的降低模型猴血浆TC、TG和LDL-C的含量，此外还能明显升高HDL-C的含量。氧甲吡嗪能够明显降低模型猴的甘油三酯含量，也能降低血浆胆固醇、LDL-C的含量，但降低作用明显低于辛伐他丁，对HDL-C的含量均未见明显影响。实验结果与相应药物的作用机制完全一致。
综上所述，本发明通过高脂高糖膳食诱导的高胆固醇血症、高胆固醇和高甘油三酯血症灵长类动物模型研发成功，可用于各类降脂类药物特别是啮齿类动物无法完成的、具有物种选择性的生物技术类降脂类药物的筛选和评价。此外，对模型动物进行远期研究还有助于高脂血症的继发性病变——动脉粥样化、心梗食蟹猴模型的研究。
Claims (2)
1.一种高脂血症灵长类动物模型的诱导方法，其特征在于，将诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食按照9.2-17.2g/kg灵长类动物的体重的量通过鼻饲管灌胃给予，每天一次，每周6天，连续给予5个月可诱导出稳定的高胆固醇血症食蟹猴模型；或连续给予13月可诱导高甘油三酯合并高胆固醇血症，所述的诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食，是通过以下方法制备的：按质量比将蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0进行混合，加热搅拌均匀乳化制备成半流质状膳食，即为诱导高脂血症灵长类动物模型的高脂高糖半流质膳食，所述的灵长类动物为食蟹猴。
2.一种用于筛选和评价抗高脂血症药物筛选和评价研究的方法，其特征在于，根据候选药物的特点，按照一定的剂量和频率给予按照权利要求1所述的诱导方法诱导出的高胆固醇血症食蟹猴模型或高甘油三酯合并高胆固醇血症，根据效果评价候选药物是否具有抗高脂血症的作用，从而为候选药物提供筛选和/或评价研究结果。
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