CN103614295B - 一种表皮细胞富集仪及其动态富集方法 - Google Patents

一种表皮细胞富集仪及其动态富集方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种表皮细胞富集仪及其动态富集方法，属于医疗领域。所述表皮细胞富集仪，包括底座，以及设置在底座上的控制面板、消化容器、过滤容器、混合容器、控制单元、加热器、振动器、传感器和电源等，通过动态富集消化方法，一方面可以快速离散表皮，得到高密度的表皮细胞悬液，另一方面，可以使消化酶的使用浓度和使用量大幅度降低，同时可缩短消化时间，有利于细胞活性的保持，减少细胞损耗，最终配液所得的已经分化的表皮细胞喷涂在创面上，表皮细胞在创面通过逆分化形成表皮干细胞，促进伤口愈合，皮源得到充分合理的利用，扩增倍数达到100-120倍。

Description

一种表皮细胞富集仪及其动态富集方法
技术领域
本发明涉及一种细胞富集仪及其富集方法，特别是涉及一种表皮细胞富集仪及其动态富集方法。
背景技术
近年来，我国烧伤的发病率为总人口的2‰～10‰，每年发生烧伤者近千万人，需要住院治疗的达数十万人之多，烧伤治愈后常遗留大量疤痕，对患者的外貌、体型，以及功能、心理方面造成负面影响。
目前，利用有限的皮源对较大面积的烧伤创面进行治疗，主要有两种：
1、微粒皮技术：将有限的自体皮源使用物理方法进行分散成尽量小的微粒，然后回植到病人的创面上，这种技术可将皮片扩大10～20倍，但使用该物理方法一方面很难将皮片进一步扩大，另一方面表皮贴附率低，难以保证疗效；
2、RECELL技术：因为创面的关闭是通过表皮干细胞的增殖完成，RECELL技术是将基底层表皮细胞进行静态消化，然后利用喷雾法将表皮细胞喷洒于创面，使用该技术理论上可将皮片扩大40～80倍，表皮干细胞主要存在于基底层中，因此，这种技术主要是利用表皮干细胞来修复创面。采用静态消化主要存在如下缺陷：消化酶与底物之间混合欠佳，消化时间长，且消化不均匀。
有鉴于此，本发明人对此进行研究，专门开发出一种表皮细胞富集仪及其动态富集方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的是提供一种表皮细胞富集仪及其动态富集方法，采用动态消化方式取得高密度、有活力的表皮细胞，且整个过程消化时间短，消化均匀。
为了实现上述目的，本发明的解决方案是：
一种表皮细胞富集仪，包括底座，以及设置在底座上的控制面板、消化容器、过滤容器、混合容器、控制单元、加热器、振动器、温度传感器和电源等，其中，控制面板包括显示屏和按键，振动器安装在消化容器的底部，使消化容器产生一定频率的振动；加热器安装在消化容器的外表面上，用于加热消化容器内的液体，温度传感器安装在消化容器上，用于监测消化容器的加热温度，上述加热器、振动器分别与控制单元的输出端相连，控制面板和温度传感器分别与控制单元的输入端相连，电源分别为控制面板、控制单元、加热器和振动器供电。
上述消化容器的侧壁上设有一通孔，用于安装温度传感器。
上述过滤容器的上端设有滤网，用于过滤动态消化后的溶液，滤网的目数为20-60。
上述消化容器、过滤容器和混合容器的入口部以及控制面板分别安装在底座的上表面上。
上述底座上表面上进一步设有一操作台，用于表皮消化前的剪切等预处理。
所述振动器采用振动电机。
控制单元、电源和振动器分别安装在底座的下表面上，振动器的顶部与消化容器的底部相接触。
一种表皮细胞动态富集方法，包括预处理、消化、过滤和配液，具体步骤为：
（1）预处理：取表皮，在表皮细胞富集仪的操作台上制成若干块表皮片；
（2）消化：启动表皮细胞富集仪电源，取步骤（1）所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，通过控制单元控制振动器和加热器，进行动态消化，得细胞悬液；
（3）过滤：将步骤（2）所得细胞悬液滴入过滤容器进行过滤，去除表皮残渣，下层的细胞液用于配液；
（4）配液：将过滤所得细胞液滴入混合容器，与蛋白凝胶混合，混合均匀完成配液。
作为优选，上述步骤（1）中，所取的表皮为断层皮片，断层皮片为厚度为0.3-0.6mm的中厚皮片，制得的每块表皮片的粒径在1-5mm。
作为优选，上述步骤（2）中，消化酶的添加比例为：每1-2 cm2 断层皮片加4-6ml的消化酶，所述消化酶由胰酶和EDTA配制而成，其中，胰酶在消化酶中的质量浓度为0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的质量浓度为0.01-0.05%；动态消化前先静置5-7分钟（也可称为静态消化），再启动振动器，进行动态消化3-7分钟后，再静置5-7分钟，再启动振动器，恒温下循环2-5次，整个过程加热器将温度控制在36.8-37.5℃，循环结束后进行细胞冲刷；细胞冲刷采用的试剂为PBS、标准生理盐水或格林氏液中的任一种，以细胞完全冲出消化容器为止。
作为优选，在步骤（4）中，下层细胞液在蛋白凝胶混合前，先添加抑制剂形成细胞悬液，抑制剂优选为自体血清或大豆胰蛋白酶，每5-15ml下层细胞液中自体血清添加1-3滴（每15滴为1ml），大豆胰蛋白酶的添加量为下层细胞液的0.8-3倍。
作为优选，在步骤（4）中，蛋白凝胶为纤维蛋白胶，混合过程为：分别将细胞悬液与促凝剂、纤维蛋白胶混合。较优的，促凝剂和纤维蛋白胶先进行预混合，再将细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶灌入双筒注射器的不同筒中，在同样压力作用下，细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶同时挤出，混合均匀完成配液，纤维蛋白胶与促凝剂的总量和细胞悬液等量。
与现有技术相比，上述表皮细胞富集仪及其动态富集方法采用动态消化方式，一方面可以快速离散表皮，得到高密度的表皮细胞悬液，另一方面，可以使消化酶的使用浓度和使用量大幅度降低，消化更均匀，同时可缩短消化时间，有利于细胞活性的保持，减少细胞损耗，最终配液所得的已经分化的表皮细胞喷涂在创面上，表皮细胞在创面通过逆分化形成表皮干细胞，促进伤口愈合，皮源得到充分合理的利用，扩增倍数达到100-120倍。
以下结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细描述。
附图说明
图1为本实施例的表皮细胞富集仪俯视图；
图2为本实施例的表皮细胞富集仪立体结构示意图；
图3为本实施例的表皮细胞富集仪控制模块图；
图4为采用本发明所得细胞应用于裸鼠背部创面后第2周的染色结果对照（100倍显微镜下）；
图5为采用本发明所得细胞应用于裸鼠背部创面后第3周的染色结果对照（100倍显微镜下）；
图6为采用本发明所得细胞应用于裸鼠背部创面后第4周的染色结果对照（100倍显微镜下）；
图7为显微镜下静态消化获得的活的表皮细胞得到富集（100倍相差显微镜下）；
图8为显微镜下动态消化获得的成纤维细胞得到富集（100倍相差显微镜下）。
标号说明：
底座1；底座上表面11；底座下表面12；操作台13；
控制面板2；显示屏21；按键22；
消化容器3；
过滤容器4； 
混合容器5；控制单元6；加热器7；振动器8；温度传感器9；电源10。
具体实施方式
实施例1
如图1-3所示，一种表皮细胞富集仪，包括底座1，以及设置在底座1上的控制面板2、消化容器3、过滤容器4、混合容器5、控制单元6、加热器7、振动器8、温度传感器9和电源10等，其中，控制面板2包括显示屏21和按键22，在本实施例中，上述显示屏21采用数码管显示，主要用于显示温度、振动频率、循环时间等参数，按键22包括电源启动按键和振动开启按键。振动器8安装在消化容器3的底部，使消化容器3产生一定频率的振动；在本实施例中，所述振动器8采用振动电机，振动电机的转速范围为1100-2500rpm。振动器8也可以采用其他类似部件替代，只要能是消化容器3内的溶液产生一定频率的震动或晃动就行，如采用摇床替代振动器8，摇床转速一般控制在60-300rpm。加热器7安装在消化容器3的外表面上，用于加热消化容器3，使消化容器3内的溶液保持在36.8-37.5℃之间，温度传感器9安装在消化容器3侧壁的通孔上，温度传感器的探头伸入溶液内，实时监测消化容器3的加热温度，温度传感器9可以采用多种型号的温度传感器，目的在于能精确感应到消化容器3内溶液的温度。
上述加热器7、振动器8分别与控制单元6的输出端相连，控制面板2和温度传感器9分别与控制单元6的输入端相连，电源10分别为控制面板2、控制单元6、加热器7和振动器8供电。在本实施例中，上述控制单元6采用微处理器芯片，可以选择多个型号的微处理器，只要能实现上述控制功能就行。
过滤容器4的上端设有60目的过滤网。
上述消化容器3、过滤容器5和混合容器6的入口部以及控制面板2分别安装在底座1的上表面11上。消化容器3、过滤容器5和混合容器6的容量一般为10-20ml。
上述底座上表面11上进一步设有一操作台13，用于表皮消化前，剪切等预处理。
控制单元6、电源10和振动器8分别安装在底座1的下表面12上，振动器8的顶部与消化容器3的底部相接触。
一种表皮细胞动态富集方法，包括预处理、消化、过滤和配液，具体步骤为，
（1）预处理：取表皮，在表皮细胞富集仪的操作台13上制成若干块表皮片，所取的表皮为断层皮片，所述断层皮片为厚度为0.3mm的中厚皮片，制得的每块表皮片的粒径在1mm；
（2）消化：启动表皮细胞富集仪电源10，取步骤（1）所得表皮片置于消化容器3中，加入消化酶，通过控制单元6控制振动器8和加热器7，进行动态消化，得细胞悬液；在本实施例中，每1 cm2 断层皮片加4ml的消化酶，所述消化酶由胰酶和EDTA配制而成，其中，胰酶在消化酶中的质量浓度为0.25%，EDTA在消化酶中的质量浓度为0.01%；动态消化前要先静置5分钟（也可称为静态消化），然后再启动振动器8，进行动态消化3分钟后，再静置5分钟，再启动振动器8，在36.8℃的恒温下循环2次，振动电机的转速为1100rmp，循环结束后进行细胞冲刷；细胞冲刷采用的试剂为PBS，以细胞完全冲出消化容器3为止；
（3）过滤：将步骤（2）所得细胞悬液滴入过滤容器4进行过滤，去除表皮残渣，下层的细胞液用于配液，在本实施例中，所述过滤网为60目；
（4）配液：将过滤所得细胞液滴入混合容器5，与蛋白凝胶混合，混合均匀完成配液，在本实施例中，下层细胞液中添加抑制剂形成细胞悬液，抑制剂为自体血清，每5ml下层细胞液中添加自体血清1滴（每15滴为1ml）；蛋白凝胶为纤维蛋白胶，混合过程为：分别将细胞悬液与促凝剂、纤维蛋白胶混合。可以促凝剂和纤维蛋白胶先进行预混合，再将细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶灌入双筒注射器的不同筒中，在同样压力作用下，细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶同时挤出，混合均匀完成配液，纤维蛋白胶与促凝剂的总量和细胞悬液等量。
实施例2
一种表皮细胞富集仪其结构同实施例1，主要区别在于过滤网为50目。
一种表皮细胞动态富集方法，包括预处理、消化、过滤和配液，具体步骤为：
（1）预处理：取表皮，在表皮细胞富集仪的操作台13上制成若干块表皮片；所取的表皮为断层皮片，制得的每块表皮片的粒径在3mm，断层皮片的厚度为0.5mm的中厚皮片；
（2）消化：启动表皮细胞富集仪电源10，取步骤（1）所得表皮片置于消化容器3中，加入消化酶，通过控制单元6控制振动器8和加热器7，进行动态消化，得细胞悬液；在本实施例中，每1.5 cm2 断层皮片加5ml的消化酶，所述消化酶由胰酶和EDTA配制而成，其中，胰酶在消化酶中的质量浓度为0.4%，EDTA在消化酶中的质量浓度为0.03%；动态消化前要先静置6分钟（也可称为静态消化），然后再启动振动器8，进行动态消化5分钟后，再静置6分钟，再启动振动器8，37℃恒温下循环4次，振动电机的转速为2000rmp，循环结束后进行细胞冲刷；细胞冲刷采用的试剂为标准生理盐水，以细胞完全冲出消化容器为止。
（3）过滤：将步骤（2）所得细胞悬液滴入过滤容器4进行过滤，去除表皮残渣，下层的细胞液用于配液；在本实施例中，所述过滤网为50目；
（4）配液：将过滤所得细胞液滴入混合容器5，与蛋白凝胶混合，混合均匀完成配液。在本实施例中，下层细胞液中添加抑制剂形成细胞悬液，抑制剂大豆胰蛋白酶，大豆胰蛋白酶则以等摩尔量添加。蛋白凝胶为纤维蛋白胶，混合过程为：分别将细胞悬液与促凝剂、纤维蛋白胶混合。较优的，促凝剂和纤维蛋白胶先进行预混合，再将细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶灌入双筒注射器的不同筒中，在同样压力作用下，细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶同时挤出，混合均匀完成配液，纤维蛋白胶与促凝剂的总量和细胞悬液等量。
实施例3
一种表皮细胞富集仪其结构同实施例1，主要区别在于过滤网为20目。
一种表皮细胞动态富集方法，包括预处理、消化、过滤和配液，具体步骤为，
（1）预处理：取表皮，在表皮细胞富集仪的操作台13上制成若干块表皮片；所取的表皮为断层皮片，制得的每块表皮片的粒径在5mm。断层皮片的厚度为0.6mm的中厚皮片；
（2）消化：启动表皮细胞富集仪电源，取步骤（1）所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，通过控制单元10控制振动器8和加热器7，进行动态消化，得细胞悬液；在本实施例中，每2 cm2 断层皮片加6ml的消化酶，所述消化酶由胰酶和EDTA配制而成，其中，胰酶在消化酶中的质量浓度为0.5%，EDTA在消化酶中的质量浓度为0.05%；动态消化前要先静置7分钟（也可称为静态消化），然后再启动振动器8，进行动态消化7分钟后，再静置7分钟，再启动振动器8，37.5℃恒温下循环5次，振动电机的转速为2500rmp，循环结束后进行细胞冲刷，细胞冲刷采用的试剂为格林氏液，以细胞完全冲出消化容器为止；
（3）过滤：将步骤（2）所得细胞悬液滴入过滤容器4进行过滤，去除表皮残渣，下层的细胞液用于配液，在本实施例中，所述过滤网为20目；
（4）配液：将过滤所得细胞液滴入混合容器5，与蛋白凝胶混合，混合均匀完成配液。在本实施例中，下层细胞液中添加抑制剂形成细胞悬液，抑制剂优选为自体血清，每15ml下层细胞液中添加自体血清3滴（每15滴为1ml）。蛋白凝胶为纤维蛋白胶，混合过程为：分别将细胞悬液与促凝剂、纤维蛋白胶混合。促凝剂和纤维蛋白胶先进行预混合，再将细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶灌入双筒注射器的不同筒中，在同样压力作用下，细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶同时挤出，混合均匀完成配液，纤维蛋白胶与促凝剂的总量和细胞悬液等量。
上述3个实施例中，根据表皮处理量的增加，选用的消化酶中胰酶、EDTA等的浓度也逐渐增加，以适应处理能力，抑制剂的添加量与待处理的表皮量相对应。
以下以应用于烧伤裸鼠背部创面时的测试结果为例，进行本发明技术方案的具体阐述。
图4、图5和图6为采用实施例2技术方案后，创面的染色结果对照，其中图4为第二周HE染色结果，A为微载体培养表皮细胞，可见表皮已经形成，并且较厚，但是欠均匀，复层化明显，B为未经培养的表皮细胞悬液，同样形成较厚的表皮层，有明显的复层化，C为原代培养表皮细胞也已经形成表皮层，有明显的复层化，D为单纯纤维蛋白胶，无明显表皮层形成，创面有大量成纤维细胞；图5为第三周动物实验组织学检测，HE染色结果：A为微载体培养表皮细胞，有较厚的但不均匀的表皮层形成，B为未经培养的表皮细胞悬液，有较厚的表皮层形成，且比较均匀，C为原代培养表皮细胞，有较薄的均匀的表皮层形成，D为单纯纤维蛋白胶，无明显表皮层形成；图6为第四周动物实验组织学检测，HE染色结果：A为微载体培养表皮细胞，有较厚的但不均匀的表皮层形成，B为未经培养的表皮细胞悬液，有较厚的表皮层形成，且比较均匀，C为原代培养表皮细胞，表皮层较薄，D为单纯纤维蛋白胶，无表皮层形成。
从在图7和图8中可以明显看出：通过动态消化获得的细胞（图8）明显多于静态消化所获得的细胞（图7），通过台盼蓝染色后，动态消化的细胞仍然维持较高的细胞活力（图8）。
表皮细胞中除表皮干细胞外，其他细胞同样具有增殖的功能，有助于创面愈合，因此，本发明所提供的上述方案中，将全部的断层皮片作为表皮细胞来源；在进行动态消化过程中，在一定温度下采用振动方式提供动态消化条件，一方面可获得更大、更多的细胞量，同时，消化酶的使用浓度和使用量也可以大大降低，同时可缩短消化时间，有利于细胞活性的保持，减少细胞损耗，采用本发明中的动态消化方法获得表皮细胞是一种可靠的方法，已经分化的表皮细胞可以在创面通过逆分化，形成表皮干细胞，促进伤口愈合，皮源得到充分合理的利用，扩增倍数达到100-120倍。
上述实施例和图式并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。

Claims (9)

1.一种表皮细胞富集仪，其特征在于：包括底座，以及设置在底座上的控制面板、消化容器、过滤容器、混合容器、控制单元、加热器、振动器、温度传感器和电源，其中，控制面板包括显示屏和按键，振动器安装在消化容器的底部，使消化容器产生一定频率的振动；加热器安装在消化容器的外表面上，用于加热消化容器内的液体，温度传感器安装在消化容器上，用于监测消化容器的加热温度，上述加热器、振动器分别与控制单元的输出端相连，控制面板和温度传感器分别与控制单元的输入端相连，电源分别为控制面板、控制单元、加热器和振动器供电；上述过滤容器的上端设有滤网，用于过滤动态消化后的溶液，滤网的目数为20-60。
2.如权利要求1所述的一种表皮细胞富集仪，其特征在于：上述消化容器的侧壁上设有一通孔，用于安装温度传感器。
3.如权利要求1所述的一种表皮细胞富集仪，其特征在于：上述消化容器、过滤容器和混合容器的入口部以及控制面板分别安装在底座的上表面上；上述底座上表面上进一步设有一操作台。
4.如权利要求1所述的一种表皮细胞富集仪，其特征在于：控制单元、电源和振动器分别安装在底座的下表面上，振动器的顶部与消化容器的底部相接触；所述振动器采用振动电机。
5.利用如权利要求3所述的一种表皮细胞富集仪进行表皮细胞动态富集的方法，其特征在于：包括预处理、消化、过滤和配液，具体步骤为：
（1）预处理：取表皮，在表皮细胞富集仪的操作台上制成若干块表皮片；
（2）消化：启动表皮细胞富集仪电源，取步骤（1）所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，通过控制单元控制振动器和加热器，进行动态消化，得细胞悬液；
（3）过滤：将步骤（2）所得细胞悬液滴入过滤容器进行过滤，去除表皮残渣，下层的细胞液用于配液；
（4）配液：将过滤所得细胞液滴入混合容器，与蛋白凝胶混合，混合均匀完成配液。
6.如权利要求5所述的一种表皮细胞动态富集方法，其特征在于：上述步骤（1）中，所取的表皮为断层皮片，断层皮片为厚度为0.3-0.6mm的中厚皮片，制得的每块表皮片的粒径在1-5mm。
7.如权利要求5或6所述的一种表皮细胞动态富集方法，其特征在于：上述步骤（2）中，1-2 cm2 断层皮片加4-6ml的消化酶，所述消化酶由胰酶和EDTA配制而成，其中，胰酶在消化酶中的质量浓度为0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的质量浓度为0.01-0.05%；动态消化前先静置5-7分钟，再启动振动器，进行动态消化3-7分钟后，再静置5-7分钟，再启动振动器，恒温下循环2-5次，整个过程加热器将温度控制在36.8-37.5℃，循环结束后进行细胞冲刷；细胞冲刷采用的试剂为PBS、标准生理盐水或格林氏液中的任一种，以细胞完全冲出消化容器为止。
8.如权利要求5所述的一种表皮细胞动态富集方法，其特征在于：在步骤（4）中，下层细胞液在蛋白凝胶混合前，先添加抑制剂形成细胞悬液，抑制剂为自体血清或大豆胰蛋白酶，每5-15ml下层细胞液中自体血清添加1-3滴，大豆胰蛋白酶的添加量为下层细胞液的0.8-3倍。
9.如权利要求8所述的一种表皮细胞动态富集方法，其特征在于：在步骤（4）中，蛋白凝胶为纤维蛋白胶，混合过程为分别将细胞悬液与促凝剂、纤维蛋白胶混合：促凝剂和纤维蛋白胶先进行预混合，再将细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶灌入双筒注射器的不同筒中，在同样压力作用下，细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶同时挤出，混合均匀完成配液，纤维蛋白胶与促凝剂的总量和细胞悬液等量。
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