CN103623001B

CN103623001B - 表皮细胞的富集应用

Info

Publication number: CN103623001B
Application number: CN201310611230.7A
Authority: CN
Inventors: 韩春茂; 胡信雷; 鲁建国; 韩杨
Original assignee: SHAOXING ZHENDE SURGICAL DRESSING CO Ltd
Current assignee: Vibration medical supplies Limited by Share Ltd
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: CN103623001A

Abstract

本发明涉及一种表皮细胞的富集应用，属于生物细胞技术领域。包括预处理、消化和喷涂，取表皮，制成若干块表皮片，将表皮片置于消化容器中，加入消化酶，进行动态消化，得细胞悬液；将消化所得细胞悬液与蛋白凝胶混合，混合均匀后喷涂在创面上。将本发明应用于创面修复，具有培养效率高、操作便捷、皮源利用率高等优点。

Description

表皮细胞的富集应用

技术领域

本发明涉及一种表皮细胞的富集及应用，属于生物细胞技术领域。

背景技术

我国烧伤的发病率为总人口的2～10‰，每年发生烧伤者近千万人，需住院治疗的达数十万之多，而且，严重烧伤者死亡率很高。烧伤治愈后常遗留大量疤痕，对患者的外貌、体形以及功能、心理方面都会造成负面影响。其中，大面积烧伤造成严重的皮肤缺失，是导致患者死亡的一个重要因素，皮源的解决问题的关键。

为了克服皮源的问题，通常是采用尽早关闭烧伤创面的方法，烧伤创面的早期关闭不仅可以挽救患者生命，也是减轻疤痕的重要手段，现有的技术中主要是通过微粒皮技术、培养表皮细胞以及Recell技术来实现的。

（1）微粒皮技术需先从患者身下未烧伤部位取下健康的皮源，再将这有限的自体皮源使用物理方法进行分散成尽量小的微粒，然后回植到病人的创面上，这种技术可将皮片扩大10～20倍，但该方法采用物理方法将皮片粉碎，然后回植到创面上，移植的皮粒贴附率不高，因此，效果难以保证；

（2）培养表皮细胞的方法需等待的时间较长，且远期疗效不佳；

（3）Recell技术是在静态下通过胰酶将基底层表皮细胞进行消化，然后利用喷雾法将混悬在林格氏液中的液态表皮细胞喷洒在创面，使用该技术可将皮片扩大40～60倍，但缺陷在于，该方法需要消耗大量的高浓度消化酶，处理过程中会采用刮擦等物理方式取样，而刮擦等物理方法会因操作者的技术熟练程度有所不同，细胞会有一定的损害，通过Recell获取的细胞活力仅在70%左右，因此，表皮干细胞的实际获取量难以确认，同时，由于细胞是呈液态喷雾在受损皮肤表面，细胞发生流动，很难保证细胞在创伤面的均匀分布，由此烧伤创面的愈合也无法保证，需要多次喷雾才能最终实现烧伤创面的恢复，延长了治疗流程，且所用的整个喷雾套件目前仍以进口设备为主，单台的价格在1-2万之间，治疗成本相应的也大大提高。

有鉴于此，本发明人对怎么样充分利用有限皮源的问题进行深入研究，开发出一种表皮细胞的富集及应用，本案由此产生。

发明内容

为了克服现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种培养效率高、操作便捷、皮源利用率高的表皮细胞的富集及应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

表皮细胞的富集及应用，包括预处理、消化和喷涂，具体步骤为，

（1）预处理：取表皮，制成若干块表皮片；

（2）消化：取步骤（1）所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，进行动态消化，得细胞悬液；

（3）喷涂：将消化所得细胞悬液与蛋白凝胶混合，混合均匀后，喷涂在创面上。

为实现更好的使用效果，上述技术方案的进一步设置如下：

步骤（1）中，所取的表皮为断层皮片，每块样表皮的粒径在1-5mm。

步骤（2）中，每1-2cm²断层皮片添加4-6ml的消化酶，所述的消化酶中主要作用成分为胰酶和EDTA，其中，胰酶在消化酶中的质量浓度为0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的质量浓度为0.01-0.05%；动态消化是在恒温条件下进行的，由交替进行的静置和动态两种状态组成，即先静置5-7分钟（也可称为静态消化），然后进入动态，动态保持3-7分钟后，再静置5-7分钟后，进入动态，温度控制在35-38℃，优选为36.8-37.5℃，静置-动态-静置-动态构成一个循环，每个动态消化过程包含2-5次该循环，动态消化完成后进行细胞冲刷。较优的，断层皮片的厚度为0.3-0.6mm的中厚皮片；动态时确保消化容器内物质的转速为60-300rpm，优选转速为180-300rpm，细胞冲刷采用的试剂为PBS、标准生理盐水或格林氏液中的任一种，以细胞完全冲出消化容器为止。

在步骤（3）之前，采用目数为20-60条件下进行过滤，去除表皮残渣，而下层的细胞液用于配液。较优的，下层细胞液中添加抑制剂形成细胞悬液，抑制剂优选为自体血清或大豆胰蛋白酶，每5-15ml下层细胞液中自体血清的添加1-3滴（每15滴为1ml），大豆胰蛋白酶添加量为下层细胞液量的0.8-3倍。

步骤（3）中，蛋白凝胶优选为纤维蛋白胶，混合过程为：蛋白凝胶优选为纤维蛋白胶，混合过程为：分别将细胞悬液与促凝剂、纤维蛋白胶混合。较优的，促凝剂和纤维蛋白胶先进行预混合，再将细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶灌入双筒注射器的不同筒中，在同样压力作用下，细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶同时挤出，均匀混合在烧伤创面上，每5-10ml纤维蛋白胶中加入1-3滴（每15滴为1ml）促凝剂，纤维蛋白胶与促凝剂的总量和细胞悬液等量。

为使烧伤创面可以更好地愈合，在步骤（3）的喷涂后包扎敷料，敷料选用保湿类敷料中的胶原膜片。

上述技术方案中，所述的预处理和消化是在表皮动态消化仪或生物培养用摇床上进行的，表皮细胞动态消化仪包括底座，以及设置在底座上的控制面板、消化容器、过滤容器、混合容器、控制单元、加热器、振动器、传感器和电源，其中，控制面板包括显示屏和按键，振动器安装在消化容器的底部，使消化容器产生一定频率的振动；加热器安装在消化容器的外表面上，用于加热消化容器内的液体，温度传感器安装在消化容器上，用于监测消化容器的加热温度，上述加热器、振动器分别与控制单元的输出端相连，控制面板和传感器器分别与控制单元的输入端相连，电源分别为控制面板、控制单元、加热器和振动器供电。

由于表皮细胞中除表皮干细胞外，其他细胞同样具有增殖的功能，有助于创面愈合，因此，本发明的上述方案中，将全部的断层皮片作为表皮细胞来源；整个动态消化过程是在35-38℃恒温条件下，采用生物摇床（实验过程中可选用常规的生物实验室培养用摇床，如型号为HS-100C的）、振动器（振动器作用与生物实验室培养用药创相同，结构不同，因而转速也存在差异，通常需要转换）等方式提供动态条件，一方面可获得更大、更多的细胞量，同时，消化酶的使用浓度和使用量也可以大大降低，消化过程在十几分钟内即可完成，与常规的过夜消化方式相比，缩短了消化时间，更有利于细胞活性的保持，减少细胞损耗，采用本发明中的动态消化技术获得表皮细胞是一种可靠的方法，配液所得的已经分化的表皮细胞喷涂在创面上，表皮细胞在创面通过逆分化形成表皮干细胞，促进伤口愈合，皮源得到充分合理的利用，扩增倍数达到100-120倍。

其中，断层皮片的定义是指皮肤的皮下组织以上的皮肤部分，包括刃厚皮片（厚度在0.3mm左右）和中厚皮片（厚度在0.3-0.6mm左右）。

附图说明

图1为本发明实施例2中所用表皮细胞富集仪的俯视结构示意图；

图2为本发明实施例2中所用表皮细胞富集仪的立体结构示意图；

图3为采用本发明所得细胞应用于裸鼠背部创面后第2周的染色结果对照（100倍显微镜下）；

图4为采用本发明所得细胞应用于裸鼠背部创面后第3周的染色结果对照（100倍显微镜下）；

图5为采用本发明所得细胞应用于裸鼠背部创面后第4周的染色结果对照（100倍显微镜下）；

图6为显微镜下静态消化获得的活的表皮细胞得到富集（100倍相差显微镜下）；

图7为显微镜下动态消化获得的成纤维细胞得到富集（100倍相差显微镜下）。

图中标号：底座1；底座上表面11；底座下表面12；操作台13；控制面板2；显示屏21；按键22；消化容器3；过滤容器4；导流管41；混合容器5；控制单元6；加热器7；振动器8；传感器9；电源10。

具体实施方式

实施例1

本实施例中，表皮细胞的富集应用，包括预处理、消化和配置原液，具体步骤为，

（1）预处理：取2cm²的断层皮片，其中，断层皮层为断层厚度为0.3mm的中厚表皮，将断层皮片制成直径为2-3mm大小的表皮片；

（2）消化：预处理断层皮片的同时，通过控制面板启动表皮细胞富集仪，将表皮细胞富集仪预热5-10分钟，维持温度在36.8-37.5℃，将步骤（1）所得表皮片置于消化容器中，加入5ml的消化酶，其中，消化酶中起催化作用的主要成分为胰酶和EDTA，消化酶中胰酶的含量为0.25%（质量百分数），EDTA的含量为0.01%（质量百分数），静置7分钟后，通过控制面板调整消化容器内的表皮片的转速（其转速的实现可通过生物实验室培养用摇床实现，也可采用图6-），动态开始，动态处理3分钟后再静置7分钟，静置-动态-静置-动态形成一个循环，恒温下循环3次后，采用PBS冲刷细胞，冲刷时长为10-30s，将细胞完全冲刷出消化容器后，终止冲刷，将得到的溶液转移到目数为40目的过滤容器中（本实施例中过滤容器的过滤部件选用尼龙筛网，也可选择同等目数的滤网或起到同样作用的过滤装置）进行过滤，去除表皮残渣后，在过滤所得下层细胞液内添加1-2滴自体血清或15ml大豆蛋白酶抑制剂，得细胞悬液；

（3）喷涂：将消化所得细胞悬液与纤维蛋白胶混合，即：先将促凝剂和纤维蛋白胶进行预混合，促凝剂的添加量为3-4滴，再将细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶灌入双筒注射器的不同筒中，在同样压力作用下，细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶同时挤出，混合均匀并涂覆在烧伤创面上，并在创面表面形成0.5-1mm厚的膜状薄层即可；

（4）包覆：在涂有膜状薄层的创面上包覆一层胶原膜片保湿敷料，可以避免外力对创面恢复造成影响，同时为细胞繁殖创造有利条件，进一步促进创面恢复。

实施例2

本实施例与实施例1的设置和工作原理相同，区别在于：本实施例是在专用设备表皮细胞动态消化仪上进行的，结合图6和图7，包括底座1，以及设置在底座1上的控制面板2、消化容器3、过滤容器4、混合容器5、控制单元6、加热器7、振动器8、传感器9和电源10等，其中，控制面板2包括显示屏21和按键22，在本实施例中，上述显示屏21采用数码管显示，主要用于显示温度、振动频率、循环时间等参数，按键22包括电源启动按键和振动开启按键；振动器8安装在消化容器3的底部，使消化容器3产生一定频率的振动，在本实施例中，所述振动器8采用振动电机，振动电机的转速范围为1100-2500rpm，与实施例1中生物实验室培养用摇床的功能相同，均为使消化容器3内的溶液产生一定频率的震动或晃动；加热器7安装在消化容器3的外表面上，用于加热消化容器3，使消化容器3内的溶液保持在36.8-37.5℃之间；传感器9安装在消化容器3侧壁的通孔上，温度传感器的探头伸入溶液内，实时监测消化容器3的加热温度，温度传感器9可以采用多种型号的温度传感器，目的在于能精确感应到消化容器3内溶液的温度；加热器7、振动器8分别与控制单元6的输出端相连，控制面板2和传感器器9分别与控制单元6的输入端相连，电源10分别为控制面板2、控制单元6、加热器7和振动器8供电，在本实施例中，上述控制单元6采用微处理器，可以选择多个型号的微处理器，只要能实现上述控制功能就行；过滤容器4的上端设有过滤网；消化容器3、过滤容器5和混合容器6的入口部以及控制面板2分别安装在底座1的上表面11上，底座1上表面11上进一步设有一操作台13，用于表皮消化前，剪切等预处理；控制单元6、电源10和振动器8分别安装在底座1的下表面12上，振动器8的顶部与消化容器3的底部相接触。

采用本实施例上述装置进行表皮细胞的动态富集，操作步骤如下：

（1）预处理：取表皮，在表皮细胞富集仪的操作台13上制成若干块粒径在1-5mm表皮片；

（2）消化：启动表皮细胞富集仪电源10，取步骤（1）所得表皮片置于消化容器3中，加入消化酶，通过控制单元6控制振动器8和加热器7，进行动态消化，动态消化结束后，将细胞冲出消化容器，得细胞溶液，将细胞溶液转入过滤容器4进行过滤，去除表皮残渣，下层细胞液用于配液；

（3）喷涂：将过滤所得下层细胞液转入混合容器，与蛋白凝胶混合，混合均匀完成配液，在本实施例中，下层细胞液中添加抑制剂形成细胞悬液，抑制剂为自体血清，蛋白凝胶为纤维蛋白胶，具体的混合过程为：促凝剂和纤维蛋白胶先进行预混合，再将细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶灌入双筒注射器的不同筒中，在同样压力作用下，细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶同时挤出，混合均匀并涂覆在烧伤创面上，并在创面表面形成0.5-1mm厚的膜状薄层即可；

其中涉及到的消化酶以及消化酶添加量、促凝剂、抑制剂、蛋白凝胶等参数的设置可参考实施例1中对应的参数，本实施例振动器的作用与实施例1中生物实验室培养用摇床作用相同，都是使消化容器3内的溶液产生一定频率的震动或晃动，但装置结构和原理与实施例1中生物实验室培养用摇床不同，故本实施例中振动电机的转速范围为1100-2500rpm，具体操作中，根据表皮所选种类不同，以及处理量的差别，振动电机的转速可选择为1100、1500、1800、2300和2500等不同档位，过滤容器可选用目数为20、40、50或60，以适应处理效果和处理目的的需求。

对上述实施例的实施效果进行整体分析。

其中，表1为实施例1中不同消化方式时的总表皮细胞获取量，表2为上述实施例所得不同表皮细胞递呈组间创面愈合时间的比较。

表1不同消化方式的总表皮细胞获取量（P<0.01）

消化方式	表皮面积（cm²）	有活力表皮细胞获取量（10⁶）
			静态	5	2.42±0.16
转速60rpm	5	2.35±0.39
			转速120rpm	5	3.26±1.21
转速180rpm	5	15.04±4.82*
			转速240rpm	5	24.07±7.25*

由表1可以看出，当选取同等面积的断层表皮，转速（表1中的转速是指生物实验室培养用摇床的转速，型号HS-100C）在180-240rpm时的动态消化条件下，可以获得15×10⁶-24×10⁶的细胞获取量，其活力表皮细胞的获取量非常理想。

表2为不同表皮细胞递呈组间创面愈合时间的比较

（*表示与纤维蛋白胶组比较，P<0.05；**表示与纤维蛋白胶比较，P<0.01）

组别	天数±标准误差
		纤维蛋白胶	15.60±2.98
微载体	8.00±1.23*
		悬浮液	6.80±0.86**
静态	7.60±1.08*

采用上述实施例所得的凝胶状的富集细胞喷涂在烧伤创面即可，细胞在创面分布均匀，细胞的分布量不小于4000个/cm²，由于表皮细胞中除表皮干细胞外，其他细胞同样具有增殖的功能，有助于创面的关闭，因此，上述方案中，将全部的断层皮片作为表皮细胞来源，在进行动态消化过程中，在适宜温度下采用摇床提供动态条件，一方面可有利于筛选活性较大的细胞，从而获得更大、更多的细胞量，同时，消化酶的使用浓度和使用量也可以大大降低，既降低了药剂成本，消化酶浓度的降低也有利于细胞活性的保持，而本方法所得原细胞也可与其它物料溶合共用。采用本发明中的动态消化技术获得表皮细胞是一种可靠的方法，已经分化的表皮细胞可以在创面通过逆分化，形成表皮干细胞，促进伤口愈合，皮源得到充分合理的利用，扩增倍数达到120倍，其中根据处理量的不同，选用的消化酶中胰酶、EDTA等的浓度也逐渐增加，以适应处理能力，抑制剂的添加量与待处理的表皮量相对应，如当表皮片的量增加时，消化酶中的胰酶含量为0.3%、EDTA含量为0.035%，对应的消化过程中，静置时间控制在6分钟，动态时间控制在4分钟，循环4次，或者消化酶中的胰酶含量为0.5%、EDTA含量为0.05%，对应的动态消化过程中，静置时间控制在5分钟，动态时间控制在7分钟，循环5次；动态消化的转速应当控制在适宜的范围内，过高或高低都会影响最终活性细胞的获取量，因而本发明中，转速应控制在180-300rpm，如表1所示，其活性细胞的获得量最为理想；当采用的表皮片为刃厚皮片时，其处理时间相对于中厚皮片处理时间和消化酶浓度等都要减少，过滤目数为20目以强化过滤效果，消化酶中的胰酶浓度为0.28%、EDTA浓度为0.02%，对应的消化过程中，静置时间控制在5分钟，动态时间控制在4分钟，循环3次，或者消化酶中的胰酶浓度为0.38%、EDTA浓度为0.04%，对应的动态消化过程中，静置时间控制在4分钟，动态时间控制在6分钟，循环3次。

以下以应用于烧伤裸鼠背部创面时的测试结果为例，进行本发明技术方案的具体阐述。

图3、图4和图5为采用本实施例技术方案后，创面的染色结果对照，其中图3为第二周HE染色结果，A为微载体培养表皮细胞，可见表皮已经形成，并且较厚，但是欠均匀，复层化明显，B为未经培养的表皮细胞悬液，同样形成较厚的表皮层，有明显的复层化，C为原代培养表皮细胞也已经形成表皮层，有明显的复层化，D为单纯纤维蛋白胶，无明显表皮层形成，创面有大量成纤维细胞；图4为第三周动物实验组织学检测，HE染色结果：A为微载体培养表皮细胞，有较厚的但不均匀的表皮层形成，B为未经培养的表皮细胞悬液，有较厚的表皮层形成，且比较均匀，C为原代培养表皮细胞，有较薄的均匀的表皮层形成，D为单纯纤维蛋白胶，无明显表皮层形成；图5为第四周动物实验组织学检测，HE染色结果：A为微载体培养表皮细胞，有较厚的但不均匀的表皮层形成，B为未经培养的表皮细胞悬液，有较厚的表皮层形成，且比较均匀，C为原代培养表皮细胞，表皮层较薄，D为单纯纤维蛋白胶，无表皮层形成。

从在图6和图7中可以明显看出：通过动态消化获得的细胞（图7）明显多于静态消化所获得的细胞（图6），通过台盼蓝染色后，动态消化的细胞仍然维持较高的细胞活力（图7）。

表皮细胞中除表皮干细胞外，其他细胞同样具有增殖的功能，有助于创面愈合，因此，本发明所提供的上述方案中，将全部的断层皮片作为表皮细胞来源；在进行动态消化过程中，在一定温度下采用振动方式提供动态消化条件，一方面可获得更大、更多的细胞量，同时，消化酶的使用浓度和使用量也可以大大降低，同时可缩短消化时间，有利于细胞活性的保持，减少细胞损耗，采用本发明中的动态消化方法获得表皮细胞是一种可靠的方法，已经分化的表皮细胞可以在创面通过逆分化，形成表皮干细胞，促进伤口愈合，皮源得到充分合理的利用，扩增倍数达到100-120倍。

以上内容是结合本发明的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.表皮细胞的富集方法，其特征在于，（1）取表皮，制成若干块表皮片；（2）将该表皮片置于消化容器中，加入消化酶，进行动态消化，得细胞悬液：每1-2cm²断层皮片添加4-6ml的消化酶，所述的消化酶中包括胰酶和EDTA，其中，胰酶在消化酶中的质量浓度为0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的质量浓度为0.01-0.05%；动态消化在恒温条件下进行，由交替进行的静置和动态两种状态组成，动态消化完成后进行细胞冲刷后，至少进行一次过滤，过滤目数为20-60，去除表皮残渣，而下层细胞液中添加抑制剂，形成细胞悬液；（3）将该细胞悬液与蛋白凝胶混合，即可。

2.如权利要求1所述的表皮细胞的富集方法，其特征在于：步骤（1）中，所取的表皮为断层皮片，每块样表皮的粒径在1-5mm。

3.如权利要求2所述的表皮细胞的富集方法，其特征在于：所述的断层皮片的厚度为0.3-0.6mm的中厚皮片。

4.如权利要求1所述的表皮细胞的富集方法，其特征在于：所述交替进行的每对静置、动态构成一个循环，动态消化时，先静置5-7分钟，再进入动态，动态保持3-7分钟；每个动态消化包括2-5个循环，温度恒定控制在35-38℃。

5.如权利要求1所述的表皮细胞的富集方法，其特征在于：所述的动态时确保消化容器内物质的转速为60-300rpm。

6.如权利要求1所述的表皮细胞的富集方法，其特征在于：所述细胞冲刷采用的试剂为PBS、标准生理盐水或格林氏液中的任一种，以细胞完全冲出消化容器为止。

7.如权利要求1所述的表皮细胞的富集方法，其特征在于：所述的抑制剂为自体血清或大豆胰蛋白酶，每5-15ml下层细胞液中自体血清的添加1-3滴，大豆胰蛋白酶的添加量为下层细胞液的0.8-3倍。

8.如权利要求1或7所述的表皮细胞的富集方法，其特征在于，步骤（3）中，蛋白凝胶为纤维蛋白胶，细胞悬液与蛋白凝胶的混合过程为：分别将细胞悬液与促凝剂、纤维蛋白胶混合，所述的促凝剂和纤维蛋白胶先进行预混合，每5-10ml纤维蛋白胶中添加促凝剂1-3滴，再将细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶灌入双筒注射器的不同筒中，在同样压力作用下，细胞悬液和促凝剂/纤维蛋白胶同时挤出，纤维蛋白胶与促凝剂的总量和细胞悬液等量，混合均匀喷涂在创面上。

9.如权利要求1所述的表皮细胞的富集方法，其特征在于：所述的预处理和消化是在表皮动态消化仪或生物培养用摇床上进行的，表皮细胞动态消化仪包括底座，以及设置在底座上的控制面板、消化容器、过滤容器、混合容器、控制单元、加热器、振动器、传感器和电源，其中，控制面板包括显示屏和按键，振动器安装在消化容器的底部，使消化容器产生一定频率的振动；加热器安装在消化容器的外表面上，用于加热消化容器内的液体，温度传感器安装在消化容器上，用于监测消化容器的加热温度，上述加热器、振动器分别与控制单元的输出端相连，控制面板和传感器分别与控制单元的输入端相连，电源分别为控制面板、控制单元、加热器和振动器供电。