CN103860553A - 一种猴系统性帕金森病模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种猴系统性帕金森病模型的建立方法，将剂量为0.2mg/kg的MPTP,以1ml/min的流量缓慢注射至猴下肢静脉，每天注射1次，连续注射10-13天，在Kurlan临床评分≥10分时停止注射，在停止注射3-12天后，如Kurlan量表临床行为评分为≥15分，且稳定至少三个月，即可得到稳定的猴系统性帕金森病模型；所述猴为中老年食蟹猴。本发明能将有个体差异及个体差异较大的食蟹猴建模成稳定的帕金森病模型；得到的猴系统性帕金森病模型不会出现自发性恢复；建模过程、特点与原发性帕金森病的病程发展相似，能为帕金森病发病机制研究、药效学研究和其他转化医学临床前研究提供稳定的模型载体。

Description

一种猴系统性帕金森病模型的建立方法

技术领域

本发明涉及一种动物疾病模型的建立方法，特别是涉及一种猴系统性帕金森病模型的建立方法。

背景技术

帕金森病是—种影响患者活动能力的中枢神经系统慢性疾病，多发生于中老年以上的人群。本病早期主要表现包括静止性震颤、肌强直、行动缓慢、动作起动困难和姿势异常等。静止性震颤即患者的手或臂不受控制地发抖，在休息时出现或情绪紧张时加重；其它早期症状包括开始活动时感到困难，其后双臂和双腿经常震颤，上肢不能作精细动作，乃致日常生活不能自理，如穿衣、脱鞋、洗漱都感到困难。本病在整体人群中的发病率为0.1%，65岁以上人群达1%，90岁以上人群高达6.1%，随着社会人口的自然老化，患病人数正逐年增加，该病已成为影响中老年人群生活质量和寿命的重要的、常见的神经变性性疾病之一。因此复制本病模型、筛选模型鉴定指标、建立模型长期维持方法，为帕金森病的深入研究提供良好的动物模型就显得非常重要了。

基于帕金森病发病机制研究、药效学和其他治疗评价临床前等研究目的，需要借助具有与临床帕金森病人发病过程、临床表现相似并且持续稳定、能被客观评价的灵长类帕金森病模型。但在此领域当今的应用技术中，1-甲基-4苯基-1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）非人灵长类帕金森病(PD)模型目前被认为最有效的、最为理想的模型。如申请公布号为CN102526047A的中国专利，公开了一种慢性全身性猴帕金森病模型的制备方法，该方法为：将剂量为0.2mg/kg的MPTP施用于猴，自首次施用日起，每间隔2天施用相同剂量MPTP，连续施用7次；其后改为每隔3天施用1次，连续注射7次；每隔3天施用1次，连续施用7次；所述的MPTP施用方法是静脉注射；所述猴为猕猴，年龄为5-6岁。申请公布号为CN102526764A的中国专利，公开了一种猴重度全身性帕金森病模型的制备方法，将剂量为0.5mg/kg的MPTP施用于猴，每日施用一次，连续施用4日，MPTP施用方法是臀大肌肌肉注射。申请公布号为CN101779609A的中国专利，公开了一种用低剂量MPTP建立雄性猕猴慢性帕金森病模型的方法，该方法按以下步骤进行:(1)给雄性猕猴肌肉注射MPTP三个月或三个月以上的时间，每隔2-3天注射1次，每次0.2-0.4mg/kg，在注射MPTP的期间，对猕猴每隔1-2天做一次行为观察，注射持续到猕猴出现震颤症状为止；(2)该猕猴在注射MPTP以前进行MRI扫描，得到正常期的图谱，对步骤1注射MPTP过程中的称猴每20-40天进行一次MRI检测，其结果和正常期的图谱进行对比，以观察脑内黑质区的改变进程；(3)该猕猴在注射MPTP以前进行SPECT扫描，得到正常期的图谱，对步骤1注射MPTP过程中的猕猴每20-40天进行一次SPECT检测，其结果和正常期的图谱进行对比，以观察纹状体成像上的改变进程；(4)注射过MPTP的猕猴，如果行为观察猴出现震颤，并且在MRI成像上观察到脑内黑质区有神经元缺损，同时在SPECT成像上显示纹状体有神经元缺损，则表明该猕猴就是成功建立的模型。

尽管如此，在当前应用的非人灵长类MPTP PD模型除尚未见有典型的病理特点和存在种属差异外，仍存在以下局限性，从而限制了其应用：（1）个体差异较大，不同个体猴子对MPTP的敏感性存在差异,给予同样的剂量的MPTP，每个动物的反应存在很大差别，症状轻重不一，使得不同研究之间不易进行比较；（2）在轻中度损害的模型易出现自发性恢复，这与PD进行性加重的特点不相一致，其对于模型是否会出现自发性恢复缺乏前瞻性的有效的预测，既往研究多集中在对模型某个阶段的模拟，而对模型临床演进和转归的全过程缺乏整体的研究，而这对预测、判断模型临床演化、转归和选择性的应用具有重要意义；（3）由于老年猴有限，大部分的模型均使用年龄较小的猴子，而PD发病多在中年以后，而研究表明年龄较大的猴较之年轻的猴子MPTP造模后出现自发性恢复的可能性较年轻猴要小；（4）MPTP模型不是慢性进行性的损害，相对急性的MPTP的应用导致急性的损害，不能完全模拟PD缓慢进行性进展的特点。

发明内容

本发明针对上述应用的局限性，选用中老年食蟹猴，采用个体化原则，建立系统性MPTP模型，给予食蟹猴小剂量MPTP注射直到出现典型的PD行为学表现后停止使用，并连续、长期观测临床演化和转归过程，避免自发性恢复的发生，建立与原发性PD更为接近的灵长类MPTPT PD模型，从而为PD发病机制研究、药效学研究和其他转化医学临床前研究提供稳定的模型载体。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种猴系统性帕金森病模型的建立方法，将剂量为0.2mg/kg的MPTP,以1ml/min的流量缓慢注射至猴下肢静脉，每天注射1次，连续注射10-13天，在Kurlan临床评分≥10分时停止注射，在停止注射3-12天后，如Kurlan量表临床行为评分为≥15分，且稳定至少三个月，即可得到稳定的猴系统性帕金森病模型；所述猴为中老年食蟹猴。所述“稳定至少三个月”，是指至少三个月内Kurlan量表临床行为评分均≥15分。

以上所述猴系统性帕金森病模型的建立方法，所述MPTP的浓度优选为0.2mg/ml。

以上所述猴系统性帕金森病模型的建立方法，在注射MPTP之前15分钟，将剂量为4～5mg/kg氯胺酮对猴进行肌肉注射；在注射氯胺酮之前30分钟，将剂量为0.04mg/kg的阿托品对猴进行肌肉注射。

以上所述猴系统性帕金森病模型的建立方法，所述阿托品注射液浓度优选为5mg/ml，所述氯胺酮浓度优选为50mg/ml。

以上所述猴系统性帕金森病模型的建立方法，所述中老年食蟹猴的年龄优选为9-15岁。

以上所述猴系统性帕金森病模型的建立方法，注射MPTP后第2天可给予流质食物鼻饲灌胃，一天两次，并一直持续至得到稳定的猴系统性帕金森病模型。

本研究选用采用个体化的原则所诱导的MPTP系统性PD模型，每只动物在不同的时限内（11.6±1.52天）出现典型的PD临床症状（Kurlan评分达到10分左右（10-11分，10.4±0.55）时停止注射MPTP。因此，我们认为Kurlan评分达到10分是模型猴从无症状的临床前期过渡到临床症状期的阈值。此过程的特点与原发性PD的病程发展有着相似的过程，进行性的黑质神经元死亡和随后出现的临床症状的原因，被认为是年龄相关的黑质细胞的变性效应叠加于已受病因侵害的黑质致密部的多巴胺能神经细胞的结果。所有5只动物停止MPTP后，可见临床症状仍在快速进展加重（临床评分持续增高），直到MPTP停止后3-12（6.40±3.65）天临床症状发展到高峰，即Kurlan评分达到第一个峰值，此时Kurlan评分为14-26（19.60±5.18）此阶段可看作MPTP后快速进展期（或惯性效应期）。

本研究中从症状起始并进入过快速进展期的特点基本上模拟了原发性PD的早期阶段。模型动物从终止注射MPTP后经过不同的时限（3-12天）快速进展至高峰，这也表明个体动物在MPTP损害达到阈值水平后所启动的黑质多巴胺神经元加速变性的速率也有较大差异，这也应部分归因于个体动物对MPTP敏感性的差异，无论如何这对于研究帕金森的起病阶段的机制和治疗研究提供了更为接近临床实际的时间窗的模型。

在快速进展期后至5个月观察期间，通过行为学动态评价了解了此5只动物临床演化和转归特点，只有1只表现为自发性恢复，其余均持续处于PD临床状态，三只表现为持续稳定型，1只表现为进行性发展型。

99mTc-TRODAT-1SPECT显示前4只猴子纹状体99mTc-TRODAT-1摄取率较之造模前基线水平降低了57.6-78.0%，而自发性恢复猴99mTc-TRODAT-1摄取率则只减低了41.9%。与行为学评价的结果一致。给予左旋多巴干预处理后，所有4只动物均表现为不同程度的行为学的改善。

既往许多研究涉及非人灵长类PDMPTP模型出现自发性恢复临床的问题，主要表现为随着时间的延长有些动物显示部分或完全的行为学的恢复。而可能出现自发性恢复的因素与动物种属、年龄、MPTP应用的途径等方面有关，研究表明最初MPTP所造成的多巴胺耗竭的程度可能是动物是否发生自发性恢复的最关键的因素，而与本研究对应的快速进展期末的临床严重程度（Kurlan评分）可认为是MPTP造成多巴胺系统的起始损害程度。自发性恢复猴在快速进展期末Kurlan评分为14，明显低于其他动物（16-26），而后4只动物在5个月观察期均未发生自发性恢复。

本研究结果表明中老年食蟹猴在快速进展期末的Kurlan评分不低于15分，其发生自发性恢复的可能性才会大大降低并长时间保持稳定的PD临床状态，反之其发生自发性恢复的风险要大大提高。因此，快速进展期末Kurlan评分大于15分是获得长期稳定的系统性PD模型的必要条件，而这也会是一个较好预测临床转归即是否发生自发性恢复的指标。

灵长类动物的年龄选择是制模成功的重要因素之一，本研究选用中老年及以上的食蟹猴，这是因为在原发性PD多在老年人中发生，老龄是导致PD发病的重要因素，已证实在人类和非人灵长类动物，随着年龄的增长，黑质纹状体多巴胺能神经系统的功能完整性逐渐减退。年龄大的动物其黑质纹状体系统可塑性相对较小，故可降低在其它PD模型常出现的自发性恢复的几率。相关研究曾证实食蟹猴平均存活到25岁左右，文献报道最长活到37岁，人类9～12岁即进入青春期，寿命最长能达120岁以上故以此推断食蟹猴1岁相当于人类4-5岁，故本研究的动物的年龄均在中年以上。

中老年的食蟹猴在给予小剂量MPTP静脉注射后11.6.0±1.52（10～13）天出现明显的PD的症状，较之同样的实验条件下3岁猴在注射MPTP后15±1天出现临床症状的时间明显要短，这一方面说明随着年龄的增长对MPTP的敏感性也相应增加，与文献报道的结果一致，另一方面说明中老年食蟹猴对MPTP的敏感性与年龄小的食蟹猴相比存在更大的个体差异。因此应用个体化原则建立MPTP模型可克服和减少个体之间对MPTP敏感性的差异，从而减少自发性恢复的发生。这提示对于中老年食蟹猴，年龄越小，当kurlan评分达到临床阈值后仍可考虑适当追加MPTP，以期之后快速进展期末Kurlan评分能大于15分以上，从而使得自发性恢复的可能性最大程度的减低，而年龄越大，则在动物出现典型PD症状时即停止MPTP使用。

据本研究提示：在中老年NHP建立PD MPTP系统性模型，采用个体化原则可平衡和减少个体对MPTP的敏感性差异，达到临床阈值后停止MPTP；快速进展期末临床评分，是一个较好的预测后续临床演化和转归结果的指标，尤其是判断出现自发性恢复的可能性的指标。在本研究5个月的动态行为学观察中，自发性恢复动物，Kurlan评分下降发生在2-3月间，且3个月末时评分<15分，5个月时显著恢复，而持续稳定型和渐进性发展型的4只动物，其快速进展期末Kurlan评分>15，至3个月末时仍在20分左右及以上，且在5个月末时仍处于PD临床状态，因此提示我们在应用PD系统性模型进行治疗评价或药效学研究时，若快速进展期末Kurlan评分和3个月时Kurlan评分均>15以上，则其后在后续发生自发性恢复的可能性很小，且在3-5个月的时间窗内可进行治疗评价研究。且对PD系统性模型临床演化全过程各个临床阶段划分更为清晰，给PD发病机制、神经保护、药效学研究和其他转化医学临床前研究提供了更适宜的研究载体。

综上所述，本发明的有益效果是：（1）本发明能将有个体差异及个体差异较大的食蟹猴建模成稳定的帕金森病模型。（2）本发明得到的猴系统性帕金森病模型在早期可以预测其转归结果，从而可避免自发性恢复。（3）本发明建模过程、特点与原发性帕金森病的病程发展相似，可模拟帕金森病的发病和发展过程。

附图说明

图1是5只食蟹猴注射MPTP后30天Kurlan临床评分总图；

图2是编号为CF24的食蟹猴注射MPTP后30天的Kurlan临床评分变化趋势图；

图3是编号为CF04的食蟹猴注射MPTP后30天的Kurlan临床评分变化趋势图；

图4是编号为CF36的食蟹猴注射MPTP后30天的Kurlan临床评分变化趋势图；

图5是编号为CF16的食蟹猴注射MPTP后30天的Kurlan临床评分变化趋势图；

图6是编号为CM05的食蟹猴注射MPTP后30天的Kurlan临床评分变化趋势图；

图7是5只食蟹猴注射MPTP后在快速进展期末及第3、5个月Kurlan临床评分总图；

图8是编号为CF24的食蟹猴注射MPTP后在快速进展期末及第3、5个月Kurlan临床评分变化趋势图；

图9是编号为CF04的食蟹猴注射MPTP后在快速进展期末及第3、5个月Kurlan临床评分变化趋势图；

图10是编号为CF36的食蟹猴注射MPTP后在快速进展期末及第3、5个月Kurlan临床评分变化趋势图；

图11是编号为CF16的食蟹猴注射MPTP后在快速进展期末及第3、5个月Kurlan临床评分变化趋势图；

图12是编号为CM05的食蟹猴注射MPTP后在快速进展期末及第3、5个月Kurlan临床评分变化趋势图；

图13是5只食蟹猴基线水平和注射MPTP后5个月的纹状体^99mTc-TRODAT-1放射性摄取率的比较图；

图14是编号为CF24的食蟹猴造模全过程Kurlan临床评分和8h运动活动总量及给予左旋多巴干预后的变化图；

图15是编号为CF04的食蟹猴造模全过程Kurlan临床评分和8h运动活动总量及给予左旋多巴干预后的变化图；

图16是编号为CF36的食蟹猴造模全过程Kurlan临床评分和8h运动活动总量及给予左旋多巴干预后的变化图；

图17是编号为CF16的食蟹猴造模全过程Kurlan临床评分和8h运动活动总量及给予左旋多巴干预后的变化图；

图18是编号为CM05的食蟹猴造模全过程Kurlan临床评分和8h运动活动总量及给予左旋多巴干预后的变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步描述，但不限制本发明的保护范围和应用范围。

一、实验动物

健康中老年食蟹猴（Cynomolgus Monkeys，Macaca Fascicularis）5只，其中4只母猴，1只公猴，年龄9.1-15.3（10.81±2.54）岁，编号分别为CF04、CF16、CF24、CF36、CM05，广西雄森灵长类养殖繁育中心提供。经常规的检疫和体检、无肢体残损，动物正常行为习性完整。本研究在广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司AAALAC（Association for Assessmentand Accreditation of Laboratory Animal）国际资质认证实验室完成。动物区域环境温度范围为22～28℃之间，湿度范围为30～75％，12/12h光暗交替。常规早晚给予常规猴料2次/天，中午给新鲜水果或蔬菜1次（苹果、香蕉、胡萝卜等），提供随时饮用的符合标准的逆渗透纯净水。实验方案已经实验动物福利委员会（Institutional Animal Care and UseCommittee，IACUC）审核并认定批准。

二、实验方法

1.MPTP药物注射

麻醉前30分钟给予阿托品注射液0.04mg/kg肌肉注射，所述阿托品注射液浓度是5mg/ml。在MPTP注射之前15分钟给予氯胺酮注射液（4～5mg/kg）肌肉注射进行麻醉，所述氯胺酮浓度是50mg/ml。0.2mg/kg MPTP-HCl溶液(浓度为0.2mg/ml)，经下肢静脉缓慢注射（1ml/min），每天（9AM）注射1次。注射MPTP后第2天给予合适营养的流质食物鼻饲灌胃一天两次，并一直持续至得到稳定的猴系统性帕金森病模型，所述流质食物为常规猴料、新鲜水果或蔬菜打碎后加入水，调成流动液体状态方便喂食。

2.左旋多巴干预治疗

鼻饲美多巴（Madopar，Roche）片剂（左旋多巴：苄丝肼＝4:1）250mg/片，起始量每日62.5mg/kg，一周后加量至每日125mg/kg（1/2片），分两次给药。

3.行为学评价

（1）临床评分

在每次注射MPTP后1小时（10AM），在饲养笼观察动物的临床表现，如无异常，则转移至行为观察笼采集1小时视频录像，应用临床评分量表进行临床评分。在MPTP注射后阶段同样在10AM进行视频录像，采集1小时视频录像，应用临床评分量表进行临床评分。左旋多巴干预期则在鼻饲左旋多巴后1小时进行视频录像以进行临床评分。

由两位对PD临床评分有经验的技术员按Kurlan量表进行评分，为了避免主观偏差，他们均不被告知具体的实验方案。Kurlan临床评分表是国际通用的帕金森病动物模型临床行为评价表，能对猴帕金森病的严重程度进行评价(Kurlan,1991),见下表。采用Kurlan量表进行临床行为评价，尽管存在主观因素，但由于对帕金森病症状的识别是根据模型猴的录像，并由对帕金森症状和帕金森猴评分熟练的技术人员进行逐一评定，评分人员不参与实验，因此是双盲的，其评价结果是客观的，这也是国际上广泛应用并被认可的模型猴运动行为评价方法。

（2）8hrs运动活动总量分析-网络摄像头运动监控分析

在注射MPTP前后，实验当天10AM开始进行，持续8小时，在左旋多巴干预期间，需先采集1h基线，然后两次给药后分别连续4h采集数据。左旋多巴给药后两次的4h时间段数据之和作为左旋多巴干预期8h随意运动活动总量。

（3）^99mTc-TRODAT-1SPECT成像

^99mTc-TRODAT-1标记方法及SPECT成像条件,在广西医科大学附属肿瘤医院SPECT中心进行。在制模前和制模后5个月分别进行一次扫描。在纹状体选取感兴趣区(ROI)，在相应的小脑半球选取相同大小的区域作为背景对照区，以纹状体感兴趣区^99mTc-TRODAT-1放射性活性计数/小脑^99mTc-TRODAT-1放射性活性计数，计算纹状体区^99mTc-TRODAT-1的特异性摄取率。

4统计方法

多组均数的比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），以P<0.05有统计学意义，数据用均数±标准差表示。统计处理均使用SPSS16.0软件。

5试验结果

（1）食蟹猴注射MPTP后30天的Kurlan临床评分变化。

开始注射MPTP后直到MPTP注射后第10～13天（11.60±1.52），5只动物表现出典型的震颤、强直、运动迟缓等PD临床症状，此时的Kurlan临床评分为10-11分（10.40±0.55），此可作为动物从无症状的临床前阶段过渡到出现典型PD症状的临床阶段的阈值，此后终止注射MPTP，停止MPTP注射后，可以观察到5只动物临床症状仍在快速进展和加重（Kurlan评分持续增高），直至停止注射MPTP后第3-12（6.40±3.65）天，临床症状进展达到高峰(Kurlan评分达到第一个峰值)，自此渐趋于稳定，MPTP停止后临床症状快速持续进展并进入相对稳定期的时间可称为快速发展期（或惯性效应期），快速进展期末时，即Kurlan评分达到第一个峰值分别为24、16、14、26、18（19.60±5.18）分，见图1-6。

（2）食蟹猴注射MPTP后5个月的Kurlan临床评分变化。

在注射MPTP后5个月期内，5只猴子的Kurlan临床评分情况为：CF16，CF24和CM05进快速进展期后Kurlan评分持续处于较高的水平且只有轻缓的波动，CF04表现为Kurlan评分缓慢渐进递增，CF36在造模后第1-2月Kurlan评分持续增高，但在第2-3个月期间一直到第5个月，Kurlan评分则逐渐下降。5只猴子的8h随意运动活动总量情况为：CF04、CF24、CF16和CM05在注射MPTP后第1-5个月即迅速降低到较低并持续保持在此水平；CF36在注射MPTP后则降低到较低水平，但至第2-3月随着Kurlan评分的下降，则8h运动活动总量逐渐回升。在注射MPTP后5个月末，给予左旋多巴干预治疗，所有5只模型猴均显示出不同程度的临床症状的好转，表现为Kurlan评分减低和8h随意运动活动总量的增加。

5只动物快速进展期末的Kurlan评分及其相应的第3、5个月Kurlan评分见图7-12，对于前述CF24、CF16、CM05持续稳定，CF04渐进性发展型猴其快速进展期末Kurlan评分分别为24，26，18和16，而自发性恢复的CF36为14，且其第3个月的临床评分为13.63±2.5，均低于其他动物第3月Kurlan评分，且第5个月时则接近正常，低于临床阈值，从下图中可以看出其与预后的关系。

（3）食蟹猴基线水平和注射MPTP后5个月的纹状体^99mTc-TRODAT-1放射性摄取率。

造模前后纹状体^99mTc-TRODAT-1摄取率（^99mTc-TRODAT-1Uptake Ratio）的变化：造模前和造模5个月后给予左旋多巴前，5只动物用DAT特异性放射性同位素配体－（^99mTc-TRODAT-1）SPECT成像检测结果显示：第5个月后纹状体^99mTc-TRODAT-1摄取率较之基线组均有不同程度的下降。CF24、CF04、CF16和CM05和CF36则分别较基线水平分别下降了57.6%、62.1%、60.2%和78%和41.9%，见图13。

（4）食蟹猴造模全过程Kurlan临床评分和8h运动活动总量及给予左旋多巴干预后的变化情况。

①编号为CF24的食蟹猴，见图14。

Kurlan临床评分变化：注射MPTP后即进入快速进展期，Kurlan评分达到24分，之后临床评分趋于下降至18分左右并稳定在此水平，至第4个月末开始显示有缓慢降低至15分左右，给予左旋多巴后则显示Kurlan评分逐渐降低。统计学分析显示在第1个月Kurlan评分即显著增高（P＜0.001），之后Kurlan评分持续稳定，在第5个月kurlan评分较之第4个月虽略有下降但无统计学差异，但显著低于第三个月（P＜0.05）。给予左旋多巴后，与模型第5个月相比，kurlan评分均明显下降（P＜0.001）。

8h随意运动活动总量变化：造模后即迅速减低并在1至第150天持续处于低水平，给予左旋多巴后则显示逐渐递增，统计学分析显示造模后第1个月与基线（BSL）相比均显著降低（P<0.001）,1-5各组之间则无显著差异(P＞0.05）。左旋多巴干预后与造模第5个月相比明显增加（P<0.05）。

②编号为CF04的食蟹猴，见图15。

Kurlan临床评分变化：注射MPTP后评分快速进展到16分左右并在此水平直到45天左右，自此呈现渐进性增加的趋势，至150天时已达到24分左右，统计学分析显示MPTP后第1个月Kurlan评分即显著增高（P＜0.001），第2-5个月依次与前个月相比均显示逐步递增，但未达显著统计学意义，到第3个月较之第1个月，第4个月较之第2个月评分则显著增高（P＜0.001）。给予左旋多巴后显示评分明显下降随后又逐渐回升，但统计学分析表明较之给药前第5个月显著减低（P＜0.001）。

8h随意运动活动总量变化，造模后即迅速减低，在之后1至第150天期间持续、波动地处于低水平，给予左旋多巴后则显示开始增加，统计学分析显示造模后第1个月与基线（BSL）相比显著降低（P<0.001）,1-5各组之间则无显著差异(P＞0.05）。左旋多巴干预后与造模第5个月相比虽有增加但未达到统计学意义的差异(P＞0.05）。

③编号为CF36的食蟹猴，见图16。

Kurlan临床评分的变化：注射MPTP之后评分迅速上升至14分左右，之后显示有逐渐增高的趋势，至70天左右达到18分，随后开始渐进性下降，至120天时已降到10分左右，至150天时下降到3分左右。给予左旋多巴则基本趋于0分。统计学分析显示MPTP后第1个月即显著升高（P＜0.001），从第3个月开始显示Kurlan评分逐步减低，较之第2个月有所减低，但未达到统计学意义的差异（P＝0.059）,而第4个月较第3个月则显著降低（P＜0.001）。第5个月较之第4个月有所降低，但未显示出统计学差异。给予左旋多巴干预后Kurlan临床评分继续降低，但与第5个月无显著差异(P＞0.05)。

8h随意运动活动总量变化：注射MPTP后即显著下降，至60天左右持续在低水平，之后至150天显示逐步的升高，统计学分析显示造模后第1个月与基线（BSL）相比显著降低（P<0.001），第1.2个月间屋显著差异（P＞0.05)，而第3个月较之第2个月，第4个月较之第3个月升高并有显著性差异（P＜0.001），而第5个月较之第4月有升高但无显著差异（P＞0.05)。给予左旋多巴后与虽仍有轻度升高但与第5个月相比无显著差异（P＞0.05）。

④编号为CF16的食蟹猴，见图17。

Kuraln临床评分变化：注射MPTP后评分迅速上升到27分左右并一直维持在此水平直到150天。给予左旋多巴后评分即降低，统计学分析显示MPTP后1个月即显著升高（P＜0.001）,而第1-5个月组间Kurlan评分未见显著性差异（P＞0.05），给予左旋多巴干预后，较之第5个月则有明显下降（P＜0.001）。

8h随意运动活动总量变化：注射MPTP后即明显下降，自此至150天持续处于较低水平，给予左旋多巴后则表现评分逐步上升。统计学分析显示，MPTP第1个月与基线（BSL）相比显著降低（P<0.001），第1-5月之间则无显著差异(P＞0.05）。给予左旋多巴后与第5个月相比明显回升（P<0.001）。

⑤编号为CM05的食蟹猴，见图18。

Kuraln临床评分变化：注射MPTP后迅速上升到18分左右并一直维持在此水平直到70天左右达到22分并维持在此水平直到150天。给予左旋多巴后评分即降低，统计学分析显示MPTP后1个月即显著升高（P＜0.001）,而第1-3个月组逐渐增高，但无统计学差异，第3个月较之第1个月显著增高（（P＜0.001），第3-5月间亦未见显著性差异（P＞0.05），给予左旋多巴干预后，较之第5个月则有明显下降（P＜0.001）。

8h随意运动活动总量变化：注射MPTP后即明显下降，自此至150天持续处于较低水平，给予左旋多巴后则表现评分逐步上升。统计学分析显示，MPTP第1个月与基线（BSL）相比显著降低（P<0.001），第1-5月之间持续处于低水平且各组间无显著差异(P＞0.05）。给予左旋多巴后与第5个月相比明显回升（P<0.001）。

Claims (6)

1.一种猴系统性帕金森病模型的建立方法，其特征在于：将剂量为0.2mg/kg的 MPTP,以 1 ml/ min 的流量缓慢注射至猴下肢静脉，每天注射1次，连续注射10-13天，在Kurlan临床评分≥10分时停止注射，在停止注射3-12天后，如Kurlan量表临床行为评分为≥15分，且稳定至少三个月，即可得到稳定的猴系统性帕金森病模型；所述猴为中老年食蟹猴。

2.根据权利要求1所述猴系统性帕金森病模型的建立方法，其特征在于：所述MPTP的浓度为0.2mg/ml。

3.根据权利要求1或2所述猴系统性帕金森病模型的建立方法，其特征在于：在注射MPTP之前15分钟，将剂量为4～5mg/kg氯胺酮对猴进行肌肉注射；在注射氯胺酮之前30分钟，将剂量为0.04mg/kg的阿托品对猴进行肌肉注射。

4.根据权利要求3所述猴系统性帕金森病模型的建立方法，其特征在于：所述阿托品注射液浓度是5mg/ml，所述氯胺酮浓度是50mg/ml。

5.根据权利要求4所述猴系统性帕金森病模型的建立方法，其特征在于：所述中老年食蟹猴的年龄为9-15岁。

6.根据权利要求5所述猴系统性帕金森病模型的建立方法，其特征在于：注射MPTP后第2天给予流质食物鼻饲灌胃，一天两次，并一直持续至得到稳定的猴系统性帕金森病模型。

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